CN119403568A 用于治疗癌症的组合物和方法 （艾丽塔生物治疗剂公司）

2024.11.19PCT/US2023/0177952023.04.06WO2023/196539EN2023.10.12融合蛋白至少包含第一接头。在一些实施方案公开描述了融合蛋白及其在治疗患有癌症的受24.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长多肽是抗白蛋白抗体或其抗原5.如权利要求4所述的融合蛋白，其中所述抗白蛋白抗体或其抗原结合片段包含抗白6.如权利要求5所述的融合蛋白，其中所述抗白蛋白VHH包抗体或其抗原结合片段是抗CD20抗体或其8.如权利要求7所述的融合蛋白，其中所述抗CD20抗体或其抗原结合片段包含抗CD2014.如权利要求1_13中任一项所述的融合蛋白，其中所述目标多肽是CD19或其片段或15.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述CD19包含与SEQIDNO:47的氨基酸序列18.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述目标多肽包含与SEQIDNO:48或56的氨19.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述目标多肽包含与SEQIDNO:46的氨基酸20.如权利要求14所述的融合蛋白，其中所述目标多肽包含SEQIDNO:46的氨基酸序321.如权利要求1_20中任一项所述的融合蛋白，其包含所述抗体或其抗原结合片段与22.如权利要求1_21中任一项所述的融合蛋白，其包含所述目标多肽与所述半衰期延23.如权利要求21或22所述的融合蛋白，其中所述第一接头或第二接头包含以下中的26.如权利要求1_25中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与SEQIDNO:中的任一个的氨基酸序列具有至少27.如权利要求1_26中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:2、中的任一个的氨基酸序列。中的任一个的氨基酸序列组成。29.如权利要求1_26中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与SEQIDNO:30.如权利要求1_26中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQIDNO:2、32.如权利要求1_31中任一项所述的融合蛋白，其包含结合第二肿瘤抗原的第二抗体33.如权利要求32所述的融合蛋白，其中所述第二肿瘤抗原是CD79b、HER_2/neu、c_34.一种核酸，所述核酸包含编码如权利要求1_33中任一项所述的融合蛋白的氨基酸438.一种产生融合蛋白的方法，其包括在适合表达所述融合蛋白的条件下培养如权利39.一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要42.如权利要求39_41中任一项所述的方法，其中在施用后，所述43.如权利要求39_42中任一项所述的方法，其进一步包括51.一种产生抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合表达所述抗体或其抗原结合片段或融合蛋白的条件下培养如权利要求50所述5[0001]过去十年见证了复发性和难治性B恶性病癌症治疗的转变。使用CD19靶向细胞疗6本发明的范围内的各种改变和修改对于熟习此项技术者将是[0012]图2示出了在去除唾液酸化(例如，唾液酸酶)的各种处理后蛋白质制备物CTE1的CD19阴性/CD20阳性JeKo_1细胞(JeKo_19KO)的结合亲和力曲线，如通过流式细胞术所测与纯化的生物素化人白蛋白(左图)或生物素化人CD20膜制备物(右图)的体外结合亲和力[0016]图6示出了野生型JeKo_1细胞主要对CD19和CD20表达呈阳性，如通过流式细胞术[0017]图7A至图7C示出了在13天内用CAR_19T细胞处理的JeKo_1B细胞淋巴瘤细胞的[0018]图8A示出了CAR_19T细胞与JeKo_1细胞以1:1的比孵育13天的CD19和CD20表达水7[0020]图10示出了注射JeKo_19KO淋巴瘤细胞并且用CAR_19T细胞加CTE1、CAR_19T细胞独的CAR_19T细胞治疗或未经治疗的小鼠的生物发[0026]图16示出了各种融合蛋白构建体与CD20阳性/CD19阴性JeKo_1细胞(JeKo_19KO)[0027]图17示出了各种融合蛋白构建体在与CAR_19T细胞一起施用时针对CD19阴性/CD20阳性JeKo_1细胞(JeKo_[0029]图19A示出了CTE3融合蛋白与CD19阴性/CD20阳性JeKo_1细胞(JeKo_19KO)的结合[0030]图20示出了CTE3融合蛋白制备物在与CAR_19T细胞一起施用时针对CD19阴性/CD20阳性JeKo_1细胞(JeKo_[0032]图22A示出了人血清对CTE3介导的CAR19细胞毒性的影响。增加的CTE3水平示于x结合。图23E示出了抗CD19CART细胞加单特异性和双特异性抗CD20和抗CD79b蛋白对[0035]图25A示出了一轮CAR19刺激后JeKo_1CD19KO细胞的细胞毒性曲线。图25B示出8缺乏或基本上不含任何聚合物部分。准氨基酸外的任何氨基酸，无论其是以合成方式制备还是从天然来源获得。如本文所用，基和/或用其他化学基团取代来修饰，所述化学基团可改变肽的循环半衰期而不会不利地9从上下文中明确)可指任何本领域已知或开发的构建体或形式，用于在替代呈现中利用抗MicroProteins、FynomersB、centyrins和KALBITOR®。如本领域所知，天然产生少四个结构域(各自的长度为约110个氨基酸)构成：缩的反平行β桶中相互堆积而成。每个可变结构域含有三个高变环(称为“互补决定区”一些实施方案中，可基于所关注蛋白质的氨基酸序列和/或解析的结构在计算机中生成蛋白质结合分子(例如Cao等人,Designofproteinbindingproteinsfromtarget理解为涉及携带Fc受体(FcR)的效应细胞，所述效应细胞可识别并且随后杀伤抗体包被的2和Fv域和/或VL内的一个或多个CDR结构域)的氨基酸残基组成的最小识别单元。在许多实施方实施方案中，片段以与亲本抗体相当的亲和力结合至抗原和/或与亲本抗体竞争结合至抗2片段片段化以酶促或化学方式产生和/或其可从编码部分抗体序列的基因以重组方式产生。可常包含至少约50个氨基酸并且更通常包含至少约200中的任一种中评估，包括当孤立地研究相互作用实体或部分时或在更复杂系统的情形中的异常生长表型的细胞。一般而言，本申请中用于检测蛋白质有时可包含例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式缔合的多于一条多肽或逆转所述个体中发生的癌症支持过程，或将增强或增加所述个体中的癌症抑制过程的对已知具有在统计上与发展出相关疾病、病症和/或疾患的风险增加相关的一个或多个易[0063]随着靶向B细胞恶性病抗原CD19的嵌合抗原受体(CAR)转导的自体T细胞的引入，巴细胞白血病(ALL)和非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)患者中诱导高反应率和持久缓解(Ruella等者接近10年无癌症(Chong等人,NewEnglandJournalofMedicine.MassachusettsClinOncol.2020；38:3805–15；Schuster等人,BiologyofBloodandMarrowTransplantation.2019；25:S20–1；Grupp等人,BiologyofBloodandMarrowMedicine.MassachusettsMedicalSociety；2018；378:439–48；Neelapu等人,New许多患者由于白血病或淋巴瘤细胞上CD19蛋白的丢失或下调而复发(Shah等人,NatRevCD19胞外结构域(ECD)或ECD内区域的表达的突变事件和/或经由表达的转录下调发生(Plaks等人,Blood.2021；138:1081–5；Majzner等人,CancerDiscov.American模式中很常见(Donk等人,BloodCancerDiscov.AmericanAssociationforCancer胞啃作用(trogocytosis)，一种CD19通过CAR从淋巴瘤细胞中物理剥离的过程(Perna,TranslationalCancerResearch[Internet].AMEPublishingCompany；2016[引自2022其CD19表达水平如何，(ii)在体外存在CAR_19T细胞的情况下有效触发CD19阴性肿瘤细胞羧基末端)：信号序列；抗CD20VHH；第一接头(GSGGGGSGGGGS)；目标多肽；第二接头头设计方法描述于Chen等人,AdvDrugDelivRev.2013；65:1357_69；和Liu等人,[0076]来自骆驼科动物的VHH结构域的氨基酸残基根据以下文献中给出的VH结构域的一酸残基总数可能不同并且可能不对应于由Kabat编号指示的氨基酸残基总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可能未被占据，或实际序列所含的氨基酸残基CDR根据IMGT编号(EhrenmannF.,KaasQ.和LefrancM._P.NucleicAcidsRes.,38:[0080]在一些实施方案中，本公开的融合蛋白包含CD20结合多肽，其是或包含抗CD20绘示的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，抗CD20VHH包含SEQIDNO:40中绘示的的CDR3。在一些实施方案中，抗CD20VHH包含与SEQIDNO:38中绘示的CDR1至少85％、等人,Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版1988)；Brinkman等人,1995,J.Immuno且人源化抗体可通过例如美国专利号6,180,370肽是用于细胞治疗剂，例如CAR_T细胞、抗体或如WO2017/075537、WO2017/075533、WO2018156802和WO2018156791中所述的抗体药物缀合物的抗[0087]在一些实施方案中，目标多肽包含全部或部分肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性[0088]在一些实施方案中，目标多肽包含选自以下的全部或部分肿瘤抗原或由其组成：[0089]在一些实施方案中，目标多肽包含以下全部或部分B细胞特异性标志物或由其组[0090]CD19是一种95kDaI型跨膜糖蛋白，用作B细胞发育的生物标志物(Wang等人,靶标，尤其是对于嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法(Maude等人,Blood125:4017–4024及使用抗体_CD19融合物或被工程化以直接结合至肿瘤生物标志物的CD19变体将CD19_肿[0091]假设CD19的胞外区含有两个C2样免疫球蛋白结构域(参见例如Wang等人,发表的结构表明CD19不包含C2样免疫球蛋白结构域(Teplyakov等人,Proteins86:495_500的约氨基酸20至约氨基酸278的片段)或由其组成。在一些实施方案中，目标多肽包含SEQ在一些实施方案中，目标多肽包含与SEQIDNO:48的氨基酸序列具一部分，其包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，CD19变体是或包含WO2019/与转铁蛋白受体结合而再循环(参见例如Widera等人,Adv.DrugDeliv.Rev.55:1439_66直接连接至白蛋白或白蛋白结构域的方法，如例如在Patterson等人,Bioconjugate[0097]在一些实施方案中，半衰期延长多肽是或包含透明质酸结合结构域。透明质酸X7_B基序的碱性氨基酸(YangB.等人Identificationofacommonhyaluronanbindingmotifinthehyaluronanbinding成并且在生理条件下采用无规卷曲构形的多肽(被例描述于美国专利公布号20130072420、美国专利号9,221,882和/或美国专利号10,081,谷氨酸和脯氨酸残基的总和占半衰期延长多肽的总氨基酸序列的多于约80％、或约85％、或当患有此类肿瘤的癌症患者通常被认为并非常规化疗的候选者时，肿瘤被表征为晚期。或多种已知治疗方式(例如，一种或多种常规化可将编码本文所述的融合蛋白的核苷酸序列引入细胞中以作为细胞治疗剂施用于受试者。γT细胞。[0111]在诸如细胞疗法的离体应用中，首先开发了衍生自鼠白血病病毒(MLV)的γ逆转病毒载体的一般策略基于天然病毒序列的缺失和改变，以防止产生具有复制能力的病毒。列(LTR)和包装信号。在大多数情况下，三个额外质粒提供了病毒产生和包装所需的因子细胞的情况下，这些步骤中的大部分在使用一次性血液收集和处理袋的封闭系统中进行。卷,文章编号:119(2021年6月23日)；Carbonaro_Sarracino等人,MolecularTherapy:[0113]重组表达载体可使用例如以下文献中所描述的标准重组DNA技术来制备：Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.2001；和Ausubel等人,CurrentProtocolsin[0116]可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入至细胞，例如免疫细胞(例如T细胞)[0119]多种制备多肽的方法是本领域已知的并且可用于制备要包含于蛋白质治疗剂中使用本领域已知的技术通过重组DNA技术产生用于产生多肽的载体。可使用已知方法构建含有多肽编码序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组[0122]对于细菌系统，可使用多种表达载体，包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,1983,EMBO12:1791)；pIN载体(Inouye和Inouye,1985,NucleicAcids体还可用于将外来多肽表达为与谷胱甘肽5_转移转录终止子等来提高表达效率(参见例如Bittner等人,1987,MethodsinEnzymol.153:人胚肾细胞系(293或293细胞亚克隆用于在悬浮培养物中生长，Graham等人,J.GenVirol.,36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如HT1080)；幼仓鼠肾细胞(BHK，A10)；中国仓鼠卵巢细胞+/_DHFR(CHO，Urlaub和Chas[0128]在一些实施方案中，可将编码本文所述的融合蛋白的核酸引入至细胞中和/或作细胞(例如肿瘤细胞)中。此类融合蛋白的引入可如Sambrook等人,(MolecularCloning:ALaboratoryManual,2001)和其他病毒学和分子的有吸引力的候选媒介物。已开发许多基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞[0133]可通过添加LentiBOOST(MayflowerBioscienceSBPLV10112)或TransDux组病毒并在体内将其递送至受试者的细胞。许多逆转猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马感染性贫血病毒(EIA)和维斯纳病毒394,411和Kines,R.等人IntJofCance病毒剂量会随时间推移而增加(与随时间减少的小分子疗法相比)，并且可内建安全特征[0141]本公开的某些实施方案包括例如以有效治疗受试者的量向受试者施用本文所述在收缩期起到增强T淋巴细胞存活作用的细胞因子，其可促进记忆T淋巴细胞的形成和存[0149]本文所述的细胞治疗剂可形成为组合物，例如细胞治疗剂和药学上可接受的载细胞(例如，作为肿瘤体积或肿瘤负荷程度可在剂量递增临床试验中定义用于一种或多种特定癌症适应症的细胞治疗[0154]本文所述的细胞治疗剂的剂量可一次或以一系列亚剂量在合适的时段内施用于另一种药学上可接受的液体中的无菌溶液或悬浮液的可注射制剂的形式肠胃外施用。例物中所包含活性成分的量使得在指定范围内提[0156]注射用无菌组合物可根据常规药学实践，使用注射用蒸馏水作为媒介物来配[0161]在一些实施方案中，含有融合蛋白的药物组合物与细胞治疗剂例如CAR_T细胞组些实施方案中，CAR_T目标抗原是如本文所述的肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原中，增加肿瘤细胞上的目标抗原密度可通过将本发明的融合蛋白结合至肿瘤细胞来实现。完全反应而未达到最小残留疾病阴性状态的患者。(参见例如/manuals/fim/1/en/topic/multiple_myeloma_resp标抗原的损失或下调或进行性疾病)来鉴定和/或选择受试者进行治疗。在一些实施方案[0170]本文所述的方法可包括准备和/或提供报告，诸如以电子、基于网络或纸质的形用癌症疗法的信息或建议，例如向患者施用预先选择的剂量或以预先选择的治疗方案施SEQIDNO:2的氨基酸序列)在Expi293细胞中表达。CTE2(具有SEQIDNO:2的氨基酸序列并且缺少C末端六组氨酸标签(例如SEQIDNO.55)在用Superdex75纯化分离主峰且去除任何内毒素，并且使用SEC_HPLC自存在的小聚集体中[0180]评价三种蛋白质制备物的唾液酸化程度：如实施例1中所述的CTE1和CTE2，以及CTE3(SEQIDNO.55)，一种从发现具有唾液酸化和未唾液酸化形式的第二批CTE2纯化的了调动步骤，因此可在15–20min的有效运行时间内以尽可能高的解析度记录电荷变异图[0185]评估CTE1和CTE2融合蛋白(如实施例1中所述)和CTE3(AEX制备物)与CD19阳性和CTE蛋白一起孵育，洗涤以去除未结合的蛋白质，0.0611.50.2[0189]评估融合蛋白与CD20和白蛋白的结合。简言之，使用抗CD19抗体FMC63实施两种ELISA形式以捕获融合蛋白。ELISA板(ThermoFisher)在4℃下用1μg/mlFMC63包被过夜，并且在室温下用200μl/孔含0.3％脱脂牛奶的Tris缓冲盐水(TBS)封闭1ml生物素化人白蛋白(NovusBiologics)或0.5μg/ml生物素化人CD20_“纳米盘”(AcroBiosystems)添加至含1％BSA的TBS后维持1小时，再次洗涤板，随后与链霉亲和素_HRP和TMB过氧化物酶底物(ThermoFisher)一起孵育13.522.324.622.015.118.6×104个细胞/孔的密度接种50μL携带荧光素酶基因的JeKo_1CD19KO目标细胞。在50μL由在550RCF下离心10分钟收集并以50μL的体积添加至孔中，以得到定义的CAR_19T:目标不透明组织培养板(FisherScientific)中。在带有注射器的光度计中读取板以分配底物方块)和CTE3(空心三角形)蛋白存在的情况下具有等效细胞毒性活性，即不考虑唾液酸化达两种抗原的野生型淋巴瘤细胞上CD19的表观密度。使用“BangBeads”方法(Bangs[0202]在AccuriC6plus机器上分析珠粒：将流速设置为100_200个事件/秒(介质流体的FL2(PE通道)的几何平均值或中值，以便输入QuickCal电子表格(使用访问代码下载FL2(PE通道)并将半高/全宽门应用于细胞群体。记录细胞群体的FL2(PE通道)的几何平均值或中值，以便输入QuickCal电子表格。输入FL2(PE通道)的中值并获得ABC(抗体结合能[0204]结论为CTE3将淋巴瘤细胞上的表观CD19密度增加至足以增加CAR_19介导的细胞生成CD19抗原逃逸模型，将携带荧光素酶基因的野生型CD19阳性/CD20阳性JeKo_1细胞(JeKo_luc)以1×104个细胞接种于96孔圆形底板的100μl每孔的RPMI/FBS中。添加含CAR_培养物孵育长达13天。在第1、6、11和13天通过流式细胞术评价样品的CD19_CD20+群体珠粒计数通过流式细胞术进行计数后，将JeKo_luc细胞以1×104个细胞重新铺板于50μl过流式细胞术分析未与蛋白质一起孵育或与用蛋白质处理的样品的抗CD20_APC和抗ROR1_[0208]野生型JeKo_1细胞具有非常高的增殖指数，并且其被用作抗原从CAR_T细胞疗法[0209]图6显示野生型JeKo_1细胞表达CD19(X轴)和CD20(Y轴)，因此几乎所有细胞[0212]如图7中所示，JeKo_1细胞可经由细胞群体水平的CD19表达缺失来逃避CAR_19的[0214]图8A示出了CAR_19细胞与JeKo_1细胞(E:T1:1)一起孵育13天之后的CD19(x轴)并且然后随机分组以在n＝8只小鼠/队列的6个不同队列中的每个中给出等效的平均肿瘤[0220]使用JeKo_19KO细胞系、CTE蛋白和CAR_19T细胞进行了若干研究。向动物注射时停止给药以评价动物的淋巴瘤复发迹象。九天后，即第42天，用CAR_19T细胞加2mg/kg延迟但仍快速增加。未治疗组和CAR_19治疗组的线终止对应于这些队列中所有动物的损[0230]这些结果显示完全保护免受淋巴瘤，如通过所有用2mg/kgCTE2治疗的动物(8/8只动物不显示信号)、大多数用0.4mg/kgCTE2治疗的动物(6/8只动物不显示信号)和一半用0.08mg/kgCTE2治疗的动物(4/8只动物不显示信号)的发光所测量。发光信号的缺乏和液酸至糖基化蛋白质中。唾液酸化程度更高的蛋白质在体内具有更长半衰期。表4总结了评估在SEQID6内CDR2序列不同的抗CD20VHH(SEQIDNO:37_42)结合CD19_CD20+Jeko_1[0241]用Ser_Trp(SW)取代SEQIDNO:37的CDR2N末端处的Thr_Tyr(TY)明显影响结令人惊讶的是，用Trp_Ile(WI)对SEQIDNO:37的CDR2的C末端处的Ser_Pro(SP)序列进行高度非保守性取代不影响结合。另外，SEQIDNO:37的抗CD20VHH的CDR3内的突变(AANPTYGSDWNAEN至AADPTYGSDWNAEN)对与CD20的结合仅6[0246]表7.[0248]通过抗CD19mAbFMC63的结合测量的构建体与JeKo_19KO细胞上的CD20的直接细乎与构建体#526(CTE1)等效。在C末端(Pro至Thr)具有保守变化构建体#635明显失去五倍结合；并且构建体#636(相对于SEQIDNO:37，CDR3Asn突变为[0249]评价了在CAR_19存在下融合蛋白对JeKo_19KO细胞的杀伤。数据总结于以下图1766[0257]构建体#526(CTE1)和#607几乎等效地结合至细胞表面CD20，对于构建体#526[0264]本实施例进一步证明，如本文所述的融合蛋白以浓度依赖性方式介导CAR_19T细96孔圆形底板在含有10％FBS且不含抗生素的RPMI1640培养基(RPMI/FBS)中以1×104个细胞/孔的密度接种50μL携带荧光素酶基因的JeKo_1CD19KO目标细胞。在50μLRPMI/FBS中稀释测试蛋白并添加至细胞中。将CAR_19T细胞解冻并且用RPMI/FBS洗涤一次，经由在550RCF下离心10分钟收集并以50μL的体积添加至孔中，以得到定义的CAR_19T:目标(E:T)组织培养板(FisherScientific)中。在带有注射器的光度计中读取板以分配底物型拉莫斯霍奇金氏淋巴瘤细胞表面上的表观CD1[0266]CTE融合蛋白可将CAR_19T细胞重定向至与CD20细胞表面蛋白结合并展示于所述JeKo_1CD19KO目标细胞、野生型JeKo_1套细胞淋巴瘤细胞或野生型拉莫斯霍奇金氏淋巴CTE3处理后测量的测试细胞上的CD19受体或CD20受体的总数被发现大约等于CD19受体的[0267]CAR_19T细胞在目标JeKo_19KO细胞和CTE蛋白存在的情况下具有细胞毒性活性。的JeKo_1细胞(E:T3:1)一起孵育后平均具有至少60％细胞毒性活性。CAR_19T细胞在与用0.001μg/mLCTE蛋白处理的JeKo_1细胞(E:T3:1)一起孵育后平均具有至少50％细胞毒性与JeKo_1细胞一起孵育后表现出提高的[0268]这些结果进一步证明融合蛋白将淋巴瘤细胞上的表观CD19密度增加至足以增加Lipofectamine2000，用cDNA转染细胞以表达人CD20(GenScriptOHu00965D)或“食蟹猕异。转染后约48小时通过Accutase去除细胞，并且通过在4℃下以500xg离心2分钟收获细个细胞5μl的Fc阻断剂(BD)添加至细胞悬浮液中并在室温下孵育10分钟。细胞然后如上进为约6ng/ml。这些结果表明CTE3在人与非人灵长类动物(食蟹猕猴)之间具有跨物种特异表达CD20的细胞的能力。细胞毒性测定使用表达荧光素酶的JeKo_1CD19KO_luc细胞来确定CTE3在50％人血清或30或60mg/mlHSA存在下的活性。将JeKo_1CD19KO_luc细胞以1×104个细胞铺板于(96圆形底板)含有50％人血清或10％FBS(对照条件)的RPMI培养基中或物转移至96白色不透明板中，并且使用带有自动注射器的GloMax板读取器(Promega)测量0.468.30.112倍。确定细胞毒性测定的IC50值并示于表11中。CTE3在50％人血清中的效力(IC50为约0.090.3降低了CTE3诱导JeKo_1CD19KO_luc细胞的细胞毒性的能力。确定细胞毒性测定的IC50值[0284]双特异性CD79bxCD20CAR19接合蛋白通过在CTE3中组装抗CD79bscFv与抗CD20VHH和CD19ECD而产生。构建体被设计为将抗CD79bscFv置于抗CD20VHH_CD19ECD中，并且收获上清液并进行滴定。以ELISA格式测定#650和#651蛋白与生物素化CD20或下用200μl/孔含0.3％脱脂牛奶的Tris缓冲盐水(TBS)封闭1小时。然后用洗涤米盘(ACROBiosystems)或生物素化CD79b(自制)的稀释缓冲液，并且在37℃下孵育1小时。[0286]如图23A中所示，将CD79bscFv置于抗CD20VHH的N或C末端位置不会显著影响与[0287]通过流式细胞术检查结合细胞表面CD20或CD79b的能力。与CD20(#606抗CD20VHH_CD19ECD_抗白蛋白)和CD79b(#645抗CD79bscFv_CD19ECD)结合的对照被包含在此6.70_34.4524.46_425.80200.9269.4[0292]在表达CD79b的细胞上，#650和#651的结合均比单特异性抗CD79bCTE#645更这些结果表明抗CD20和抗CD79b结构域在存在于细胞表面上时可结合[0293]如图23E中所示，测试了CD20xCD79bCTE#650和#651针对CD20+/CD79b+JeKo_114示出了针对JeKo_1CD19KO细胞的细胞1.455.6184.056.80.9970.80.5270.8[0296]单特异性抗CD20CTE(#606)和双特异性抗CD20/抗CD79bCTE(#650/#651)可在约[0298]SPR测量在25℃下使用1×HBS_EP+运行缓冲液在Biacore8K(Cytiva)上进行。在每个配体的单独实验中，生物素化抗CD19和生物素化HSA被固定至链霉亲和素包被的CM5Biacore传感器芯片上。生物素/链霉亲和素相互作用是一种高亲和力的非共价相互作用，[0299]CM5芯片表面通过与1_乙基_3_(3_二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/N_羟基琥珀[0301]如图24B和图24C中所示，缔合和解离曲线表明CTE3分别对抗CD19和HSA具有良好[0306]CM5芯片表面通过与1_乙基_3_(3_二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)/N_羟基琥珀[0307]对于结合研究，使用脱盐柱将CTE3交换至运行缓冲液中。制备连续稀释的CTE3抗CD20的测量动力学参数详述于表16中。证明，在重复刺激抗CD19CART细胞后，CTE3对表达CD20的细胞的细胞毒性高于CD20xBangBeads确定细胞数量。确定CAR19细胞浓度后，使用再刺激的CAR19细胞建立了针对Jeko_1CD19KO细胞的CTE3或双特异性抗CD20x抗CD3(BPSBiosciences，目录号：[0332]本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定[0335]ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTGGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATAGCCAGGTGCAATTACAAGAGTCTGGTGGAGGCCTAGCACAAGCGGGCGGTTCCCTGAGACTCAGCTGCGCTGCTAGCGGACGTACATTTTCCATGGGCTGGTTTCGTCAAGCTCCTGGCAAGGAACGCGAGTTTGTGGCTGCTATTACCTACTCTGGAGGCTCCCCTTACTACGCGAGTTCTGTTCGCGGCCGGTTTACAATCTCCCGGGATAATGCTAAGAATACAGTTTATCTACAAATGAACTCCCTGAAACCCGAGGATACCGCTGTTTATTACTGTGCCGCTAACCCAACCTACGGCTCTGATTGGAACGCTGAGAACTGGGGCCAGGGCACACAGGTGACTGTTAGTTCCGGTGGCGGTGGCAGCGGTGGCGGAGGATCTGGAGGCGGTGGAAGTGGAGGTGGAGGTTCTCCCGAGGAGCCCCTGGTTGTGAAAGTCGAGGAAGGCGACACCGCCGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGTACCTCTGATGGACCCACGCAACAATTGACATGGTCTCGTGAATCCCCTCTGAAGCCTTTCCTCAAGTACAGCCTGGGAGTCCCCGGCCTTGGAGTACATGTCAGGCCAGACGCGATTAGTGTTGTCATCCGCAATGTTAGTCAGCAGATGGGCGGCTTTTACTTGTGTCAACCCGGCCCTCCTTCCGAGAAGGCATGGCAGCCTGGCTGGACCGTGAATGTTGAAGGCAGCGGCGAGCTGTTCCGATGGAACGTCAGTGACCTTGGCGGCCTGGGCTGCGGACTGAAGAACAGATCCAGCGAAGGACCAAGTAGCCCTAGCGGCAAGTTGATGTCTCCAAAATTATATGTTTGGGCAAAGGATAGGCCCGAGATTTGGGAGGGGGAACCCCCATGCCTGCCTCCACGAGACAGCCTCAATCAAAGCCTGAGTCGAGATCTGACCGTTGCTCCTGGTTCAACACTGTGGCTGTCATGCGGCGTACCACCGGATTCTGTTTCTCGCGGGCCCCTGTCTTGGACCCACGTCCATCCTAAGGGTCCCAAGTCCCTCCTGAGCCTGGAGCTCAAGGACGACCGGCCAGCACGCGATATGTGGGTTATGGGCACAAGCCTCATGCTGCCCCGAGCAACCGCGCAAGACGCCGGCAAATGGTACTGCCATAGGGGTAACCTTACCATGAGTTTTCACTTGGAGATCACAGCTAGGCCTTCTCGAGGTGGCGGTGGCTCCGGAGGCGGCGGATCAGGAGGTGGCGGCAGTGAAGTCCAACTTGTGGAGTCTGGCGGAGGCTTGGTCCAACCTGGCAATTCTCTGCGCTTGTCCTGCGCTGCTAGCGGGTTCACTTTTTCATCTTTCGGAATGTCTTGGGTTAGACAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAATGGGTTTCGTCCATTAGTGGCAGCGGGTCTGACACTCTTTACGCGGACAGTGTCAAGGGCAGGTTCACGATATCAAGAGACAACGCAAAAACCACACTCTACCTCCAAATGAACTCTTTGAGACCTGAAGATACAGCAGTGTATTATTGCACAATTGGTGGCTCTCTGTCCCGCTCGTCCCAAGGGACACTCGTAACGGTCAGCTCACATCATCACCATCA[0338][MGWSCIILFLVATATGVHS]_[QVQLQESGGGLAQAGGSLRLSCAASGRTFSMGWFRQAPGKEREFVAAITYSGGSPYYASSVRGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAANPTYGSDWNAENWGQGTQVTVSS]_[GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS]_[PEEPLVVKVEEGDTAALWCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKYSLGVPGLGVHVRPDAISVVIRNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSRDLTVAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMGTSLMLPRATAQDAGKWYCHRGNLTMSFHLEITARP]_[SRGGGGSGGGGSGGGGS]_[EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS]_[0341]CAGGTGCAATTACAAGAGTCTGGTGGAGGCCTAGCACAAGCGGGCGGTTCCCTGAGACTCAGCTGCGCTGCTAGCGGACGTACATTTTCCATGGGCTGGTTTCGTCAAGCTCCTGGCAAGGAACGCGAGTTTGTGGCTGCTATTACCTACTCTGGAGGCTCCCCTTACTACGCGAGTTCTGTTCGCGGCCGGTTTACAATCTCCCGGGATAATGCTAAGAATACAGTTTATCTACAAATGAACTCCCTGAAACCCGAGGATACCGCTGTTTATTACTGTGCCGCTAACCCAACCTACGGCTCTGATTGGAACGCTGAGAACTGGGGCCAGGGCACACAGGTGACTGTTAGTTCCGGTGGCGGTGGCAGCGGTGGCGGAGGATCTGGAGGCGGTGGAAGTGGAGGTGGAGGTTCTCCCGAGGAGCCCCTGGTTGTGAAAGTCGAGGAAGGCGACACCGCCGCCCTGTGGTGCCTCAAGGGTACCTCTGATGGACCCACGCAACAATTGACATGGTCTCGTGAATCCCCTCTGAAGCCTTTCCTCAAGTACAGCCTGGGAGTCCCCGGCCTTGGAGTACATGTCAGGCCAGACGCGATTAGTGTTGTCATCCGCAATGTTAGTCAGCAGATGGGCGGCTTTTACTTGTGTCAACCCGGCCCTCCTTCCGAGAAGGCATGGCAGCCTGGCTGGACCGTGAATGTTGAAGGCAGCGGCGAGCTGTTCCGATGGAACGTCAGTGACCTTGGCGGCCTGGGCTGCGGACTGAAGAACAGATCCAGCGAAGGACCAAGTAGCCCTAGCGGCAAGTTGATGTCTCCAAAATTATATGTTTGGGCAAAGGATAGGCCCGAGATTTGGGAGGGGGAACCCCCATGCCTGCCTCCACGAGACAGCCTCAATCAAAGCCTGAGTCGAGATCTGACCGTTGCTCCTGGTTCAACACTGTGGCTGTCATGCGGCGTACCACCGGATTCTGTTTCTCGCGGGCCCCTGTCTTGGACCCACGTCCATCCTAAGGGTCCCAAGTCCCTCCTGAGCCTGGAGCTCAAGGACGACCGGCCAGCACGCGATATGTGGGTTATG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