血液细胞外囊泡分离技术及其在肿瘤诊断中的应用规范总结2026

血液细胞外囊泡分离技术及其在肿瘤诊断中的应用规范总结2026近年来，细胞外囊泡（extracellularvesicles，EV）成为肿瘤生命科学研究领域的热点，肿瘤源性的EV有望成为肿瘤无创检测的新型生物标志物，它同循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA一并被称为肿瘤液体活检指标，具有无创及可动态监测等临床优势。然而，由于EV的直径较小，从生物样本中提取分离具有一定难度。EV分离和检测技术的开发蓬勃发展，但目前国际上尚无统一的分离提取标准

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。具有临床应用前景的技术应具备样品和试剂消耗少、省时、简便、分离度高、成本低等优势。一、EV分离技术现阶段肿瘤EV分离纯化技术体系丰富，不同分离策略的性能特征、适用条件及产出样本质量等也存在差异。（一）差速超速离心差速超速离心为EV分离公认金标准，科研应用最广，适配多类样本；经分步离心逐级剔除杂质，可得到较高纯度EV

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1］

。常规流程先以10000~20000×

g离心10~90min粗富集EV，再以100000~200000×

g离心45~150min去除轻质杂颗粒，沉淀重悬得到EV。提升离心力或时长可增加产量，但易共沉淀杂蛋白；通过添加蔗糖、碘克沙醇、氯化铯等介质的密度梯度离心，可依据沉降差异分馏收集同密度高纯度EV

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1,2］

。总体来说，该体系整体耗时久、回收率偏低、设备要求高，且高离心力易破坏EV结构等缺点不适用于临床诊断。（二）超滤超滤分为死端过滤与切向流过滤，依靠特定孔径滤膜筛分粒径匹配的EV。死端过滤流体与渗透方向同向，但易发生膜堵塞，仅适用于小体积样本；切向流过滤流体流向垂直于过滤方向，可缓解滤压升高，适配大体积样本处理

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。EV回收率与粒径分布高度依赖滤器型号，滤膜易吸附EV、发生堵塞，造成产物损耗，制约其在临床上的应用。（三）尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱以多孔凝胶聚合物为固定相，依据分子粒径分级洗脱：大颗粒率先流出，随后为EV，小分子杂蛋白最后洗脱

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。该技术通用性强，适配各类样本，所得EV纯度优于多数分离手段，可最大程度保留EV形态与生物活性；同时易于放大、适配自动化高通量操作，但该技术的设备成本相对较高。（四）聚合沉淀法聚合沉淀法为主动富集EV的手段，借助聚乙二醇、凝集素、鱼精蛋白、乙酸钠等试剂剥夺EV表面水分子，构建疏水微环境，低速离心便可沉淀EV

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。该法操作简易、产量高、成本低廉，无需专用设备，适配大批量样本；但产物纯度低，易混杂游离蛋白、病毒颗粒等杂质。（五）免疫磁珠法：免疫磁珠法依托EV膜表面标志物实现靶向富集：磁珠偶联CD9、CD63、CD81等通用标志物或表皮生长因子受体、上皮细胞黏附分子等肿瘤特异性标志物抗体，孵育后特异性捕获EV

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。受来源异质性影响，EV标志物表达量存在差异，不同组合抗体可分选不同亚型EV

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。该技术特异性高、操作便捷，适用于肿瘤诊断；缺点是成本偏高，且仅可捕获携带对应靶标的EV。（六）微流控技术近年来微流控技术得到迅速发展，可依据检测信号快速分选EV，并实时监测EV以助力疾病早期诊断。肿瘤EV微流控分离体系分为两类：一类依托粒径等物理特征筛分，另一类依靠膜蛋白表达等生化特征实现特异性捕获

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9,10,11,12,13,14］

。二、EV分离的质量控制（一）分析前质量保证血液是肿瘤EV研究中最常见的样本。由于血液成分复杂，且容易受到分析前一些因素的影响，例如，患者性别、年龄、饮食、昼夜节律、运动、药物，以及血液采集、制备、储存、抗凝剂的应用等

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。静脉穿刺的处理：活化的血小板可大量释放EV，采血全程需尽量避免血小板激活。依据指南建议，优先选用大号针头穿刺，规避蝶形套管或较小针头，以降低剪切刺激，减少血小板源EV释放

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；穿刺后即刻松止血带，弃去首段2~3ml血液，防止高压或成纤维细胞掺入诱发血小板活化

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。血样采集后轻柔颠倒混匀8~10次，严禁剧烈震荡；不宜低温久置，尽快分离血浆或血清，最大限度减少血小板活化

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。2.血浆和血清的选择：血清、血浆为研究EV常用的体液样本

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。由于血清样本无抗凝剂，常在采血后1h内自发凝血，凝血过程会激活血小板并释放大量EV

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，血小板衍生EV约占血清EV总量的50%以上

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；但血清样本无抗凝剂、纤维蛋白干扰

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。血浆样本经抗凝剂处理无体外凝血过程，血小板活化水平更低，EV组分更贴合体内血液循环中的真实情况

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。无论选用何种样本，由于EV易吸附或内化于血细胞，采血后均需快速离心去除血细胞

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。3.抗凝剂的选择：目前抗凝剂的作用方式有多种，如钙离子螯合剂、蛋白酶抑制剂、血小板活化抑制剂等。其代表的抗凝剂种类也有很多，例如，柠檬酸钠、乙二胺四乙酸、肝素、腺苷和双嘧达莫等添加剂

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。目前尚不推荐使用肝素抗凝剂，因其不仅会降低核酸提取效率，还可抑制聚合酶链式反应过程中一些关键酶活性，干扰EV下游检测分析的准确性与可靠性

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。因此，抗凝剂的种类应根据肿瘤EV下游特定的分析目的来进行选择。目前国际血栓和止血标准化委员会推荐柠檬酸钠用于EV的研究

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15，22］

。4.溶血、脂蛋白和血浆蛋白：静脉穿刺操作不当、采血管负压异常及个体差异均会诱发溶血，红细胞释放的血红蛋白与核酸会干扰肿瘤EV检测结果

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。溶血程度可经肉眼初筛，也可借助分光光度法、血红蛋白检测实现精准评估

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。脂蛋白的粒径、密度与EV重叠且浓度更高，单一的粒径或密度分离方法难以完全去除其污染，高纯度EV制备需结合多维度理化特性复合分离

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24,25］

。血液中游离白蛋白、免疫球蛋白、纤维蛋白原等蛋白易与EV共分离，可通过尺寸排阻色谱、密度梯度离心等方法有效去除，完成EV纯化

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。5.昼夜节律、运动和禁食状态：血液中的一些参数常呈现全天变化的趋势，例如，昼夜节律变化、体育锻炼等均可能会对血小板活化产生影响

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，从而使血液中EV数量发生波动。此外，白细胞的运输以及一些促炎和抗炎细胞因子在血液循环中也是呈全天变化的节律

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。因此，建议在一天中同一时间收集样本。目前食物摄入对肿瘤EV的影响尚不清楚，但由于脂蛋白可携带RNA，并且食物摄入会影响循环脂蛋白颗粒的类型、数量和功能

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。因此，建议在最后一次进餐后按规定时间间隔进行样本收集。此外，一些药物也可能对血液中EV产生影响，因此，记录所服用药物的名称及时间等也具有一定的价值

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。6.储存方式：肿瘤EV检测优先采用新鲜样本，而多数研究需储存EV样本，但储存容器、缓冲液、温度等条件会影响EV的数量与质量，干扰实验结果

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。现有研究建议采用硅化容器储存EV，避免EV吸附管壁造成损耗

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。磷酸盐缓冲盐水等冷冻保护剂可减轻冻融损伤，提升-80℃条件下EV长期与短期储存稳定性、耐受多次冻融

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。目前国际共识大多支持EV储存在-80℃，且尽量减少反复冻融的次数

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。由于适宜储存条件可能因肿瘤EV的成分和来源而异，因此，尽力对所研究肿瘤EV种类进行储存条件的探索比对，以寻求优质储存状态。（二）分析中质量保证1.EV形态的检测：电子显微镜是验证EV囊泡结构的核心手段，不同显微观测技术呈现的EV形态存在差异：扫描电镜下EV多呈碟形或茶托状，冷冻透射电镜可观测到EV双层膜圆形囊泡结构

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32,33］

。使用扫描电镜时，样品的制备尤为重要，需提前将标本固定在戊二醛中并进行脱水，因此，可能会诱导EV形态的变化

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32,33］

。此外，在某些情况下，电子束可能对样本造成损坏。而冷冻电镜无需固定脱水，液氮环境可规避电子束损伤，最大程度保留EV完整结构

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。原子力显微镜也可用于EV的分析。目前国际细胞外囊泡协会（InternationalSocietyforExtracellularVesicles，ISEV）建议使用电子显微镜时，记录报告3个主要的参数：固定、吸附和负染方法

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。建议同时提供低倍和高倍图像，保障检测结果的规范性与可重复性

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。2.EV粒径和浓度的检测：除了纳米级的扫描电子显微镜或冷冻射电显微镜可以测量EV粒径外，近几年，一些新的检测方法也不断涌现出来，如电阻脉冲传感分析仪、纳米流式检测法、纳米颗粒跟踪分析仪等

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13，16，34］

。可调电阻脉冲传感分析仪是基于库尔特原理，可原位检测悬浮液中50nm至细胞大小粒径的EV，精准测定颗粒粒径与浓度

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。但该技术也存在局限性，易受系统稳定性干扰，孔隙易被大颗粒堵塞，而太小的颗粒则易被背景噪声掩盖。Anderson等

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通过优化系统噪声、截止阈值等参数，有效提升了检测灵敏度与稳定性。ISEV建议，可调电阻脉冲传感检测需详细记录仪器型号、孔径、校准颗粒、软件版本及样本预处理流程，且优先报告EV粒径分布数据，而不是单个粒径数值

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16］

。纳米流式分析技术融合纳米技术与流式细胞术，具备高灵敏度、高分辨率、高通量等优势，可有效区分染色EV与背景杂质

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，快速检测悬浮液中直径300nm以下EV，并依据表面抗原表达水平实现EV定量与亚型分类

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36］

。国际EV流式工作组已发布标准化实验报告框架，涵盖实验设计、样本制备、仪器校准、质控及EV特征分析等内容

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。ISEV建议将该框架作为EV流式检测补充资料，同时需校准体积、荧光、光散射等核心参数，并建议定义检测的上限和下限

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。纳米颗粒跟踪分析技术依托光散射与布朗运动原理，可检测10nm~2μm范围内EV的粒径分布与浓度，是目前EV领域广泛使用的光学技术

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33，38］

。该技术样本制备简便、检测高效，且检测后可回收天然状态EV，这使得该项技术更具吸引力。根据ISEV建议，该技术需记录仪器、激光、软件、分析算法等核心参数，开展光散射与荧光模式的缓冲液对照实验；荧光检测需同步报告总颗粒数与阳性标记颗粒数，排除标记伪影干扰；如注入流体，建议报告相应的设置信息。此外，建议报告EV直径分布，而不是单个EV直径数据

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。3.EV标志蛋白的检测：EV标志蛋白在EV身份鉴定及分离纯化中具有关键作用。国际ISEV建议采用5类成分报告EV标志蛋白，其中类别1和2用于确认EV存在，类别3用于评估常见污染物，类别4和5提供EV起源或共分离物信息，检测时应至少包含类别1、2、3中的蛋白

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。例如，四跨膜蛋白（CD63、CD9、CD81）作为EV的“通用标签”，可确认EV的存在

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16］

；胞内来源的蛋白肿瘤易感基因101蛋白和ALG-2相互作用蛋白X可作为“内生性标志”，有助于排除细胞碎片或非外泌体囊泡的干扰

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16］

。目前常用检测方法包括免疫印迹法、酶联免疫法、流式细胞术、蛋白质谱及微流控芯片等。此外，在高纯度EV分离中，标志蛋白还可作为免疫亲和捕获的靶点，提升分离纯度。4.EV分离性能的检测：EV分离的性能直接决定了后续研究的准确性、临床应用的安全性以及实验流程的可重复性。目前，国际上尚未形成统一的EV质控标准。ISEV发布的系列指南中并未设定诸如提取重复性、回收率、杂蛋白去除率等具体数值阈值，而是要求研究者详尽报告EV的分离与纯化流程，采用至少两种正交方法进行物理表征，通过检测特定阳性与阴性标志物评估样品纯度，并提供总颗粒数与总蛋白量等关键定量指标，以此确保研究结果的严谨性与可重复性。在上述过程规范的基础上，国内一些团体标准进一步明确了EV的安全性指标，样本中内毒素检测值应≤0.5EU/ml，真菌、细菌、支原体等微生物按照药典中“1101无菌检查法”和“3301支原体检查法”项检测应均为阴性，细胞内外致病因子HIV抗体、HBsAg、HCV抗体、TP抗体、CMV-IgM、HTLV抗体、HPV抗体、HHV抗体、EBV抗体检测应均为阴性，HCV、HBV、HIV病毒核酸检测应均为阴性

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40］

。近年来新兴的微流控技术分离检测EV较传统方法更加高效、精准，虽然当前微流控技术分离EV暂无统一的通用量化标准，但在一些科研成果中已展示其可达到的性能指标。Meng等

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41］

研发基于黏弹性的微流控装置可从全血中分离出荧光标记EV，纯度和回收率分别超过97%和87%。Soong等

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42］

研发的基于光诱导介电泳微流控技术可成功将不同尺寸的EV逐步引导至特定位置，实现100~150、151~225和226~350nmEV尺寸的高效分离，纯度可达86%。Zhang等

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43］

研发基于声学虚拟波柱的微流控技术从全血中分离EV纯度高达97%。此外，为了尽量确保微流控技术分离EV的质量和可重复性，ISEV建议在使用基于微流控技术分离检测EV时，标注以下内容

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15］

：（1）仪器的所有装置，包括动力泵和收集装置等；（2）所有缓冲液的组成；（3）所有场的特性，如流速和压力、pH梯度、电场等；（4）分离室的大小尺寸和组成，包括分子量截留滤板等；（5）馏分收集的所有相关详细信息等。这些内容在微流控技术的质量控制中起着重要作用。同时通过标注这些内容可为后续研究提供一定的参考，以便逐步实现不同研究中微流控技术分离检测EV的可重复性和一致性。三、EV在肿瘤诊疗中的应用相较于循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA，血液中肿瘤EV丰度更高、富集更简便；脂质双层屏障可防护内容物降解

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44,45］

，有利于肿瘤的早期诊断。肿瘤来源的EV可携带其母细胞的相关生物学信息，使其成为癌症诊断的潜在生物标志物。随着分子检测技术的不断发展，关于肿瘤EV蛋白和核酸标志物的研究也越来越多（

表1

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2

,

3

），如Melo等

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46］

研究发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖1阳性EV在早期胰腺癌患者血清中的丰度显著高于正常人群，且具有较高的准确性和敏感性。Zhu等

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47］

研究显示CD14阳性的EV可作为诊断鳞状细胞食管癌的潜在生物标志物。Rana等

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48］

研究显示半乳糖凝集素-3结合蛋白可作为胶质瘤早期检测的潜在生物标志物。Li等

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49］

利用糖链外泌体捕获技术，偶联凝集素磁珠，快速提取血清中岩藻糖基化EV，并对其进行miRNA谱的检测，结果鉴定出5个miRNA（hsa-let-7a、hsa-miR-21、hsa-miR-125a、hsa-miR-20