微生物的遗传与变异

第六章微生物的遗传变异

Microbiology

Genetics

第一节微生物遗传与变异的概念第二节常见的微生物表型变异第三节微生物变异的机理第四节微生物变异株的获得及微生物遗传性的保存ReviewGenetics遗传学:scienceofheredityHeredity,inheritance遗传:geneticsubstancetransmittedfromparenttooffspring子代Variation变异:Inheritable,lowrate(10-5~10-8)Mutation突变:anychangeinthenucleotidesequenceoftheDNAinacell.Modification饰变:onphenotype,notgenotypeGenotype基因型:geneticmakeupPhenotype表现型:actual,expressedproperties第一节微生物遗传与变异的概念微生物是遗传学研究中的明星:

微生物细胞结构简单,营养体一般为单倍体,

方便建立纯系。

很多常见微生物都易于人工培养,快速、大

量生长繁殖,菌落形态特征的可见性和多样性。

物种和代谢类型多样,易于积累不同的中间代谢

产物或终产物。

对环境因素的作用敏感,易于获得各类突变株,

易于形成营养缺陷型,操作性强。

研究微生物遗传学的意义微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题时最热衷的研究对象。对微生物遗传规律的深入研究,不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展,而且为育种工作提供了丰富的理论基础,促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。

ThreeClassicalExperiments三个经典实验三个经典实验1.Transformation转化2.Infectionofbacteriophage噬菌体感染3.Reconstructionofplantvirus植物病毒重建三个证明DNA是遗传物质的经典实验1.经典转化实验肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）；R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）遗传变异的物质基础1928年,F.Griffth作了3组实验:1944年,Avery精确重复了转化实验,确定了转化因子实验证明,将R菌转化为S菌的转化因子是DNA2.噬菌体感染实验Hershey&Chase’sexperimentofphageinfectionConclusion:DNAwasthephysicalcarrierofheredity遗传物质基础是DNA3.ReconstructionofTobaccoMosaicVirus(TMV)植物病毒重建

Nucleicacid,DNAorRNA,isthehereditarymaterial为了证明核酸是遗传物质，H.Fraenkel-Conrat（1956)用含RNA的烟草花叶病毒（TMV)进行了著名的植物病毒重建实验。将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡，就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下，也能感染烟草并使其患典型症状，而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。

选用TMV和霍氏车前花叶病毒（HRV)，分别拆分取得各自的RNA和蛋白质，将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒：

（1)RNA（TMV)­蛋白质（HRV)（2)RNA（HRV)­蛋白质（TMV)用两种杂合病毒感染寄主：（1)表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子（2)表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。上述结果说明，在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。

朊病毒的发现和思考朊病毒含有微量的核酸，仍未发现?朊病毒仅由蛋白质构成朊病毒的遗传物质为蛋白质?质粒（plasmid)：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。质粒的结构特点通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；

细菌质粒多在10kb以内)质粒的检测

提取所有胞内DNA后电镜观察;

超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察;

对于实验室常用菌,可用质粒所带的某些特点,

如抗药性初步判断。

质粒的主要种类质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应致育因子（Fertilityfactor，F因子)抗性因子（Resistancefactor，R因子)产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid)毒性质粒（virulenceplasmid)代谢质粒（Metabolicplasmid)隐秘质粒（crypticplasmid)AdvantagesofusingplasmidasAdvantagesofusingplasmidasvectoringeneengineeringvectoringeneengineering质粒作为基因工程载体的优势质粒作为基因工程载体的优势1.Smallsize:easilyusedinDNAseparationandmanipulation体积小,易操作2.Circularshape环形:keepDNAstable3.Independentstartingpointofreplication:notcontrolledbynucleargenome独立的复制起点4.Multiplecopies多拷贝:increaseexogenousDNArapidly迅速复制外源DNA5.Antibioticresistantgene:usedasselectivemarker抗生素抗性基因作为选择标记一、形态和结构的变异3-6%食盐

鼠疫杆菌

多形态性(衰残型)。

琼脂培基第二节常见的微生物表型变异青霉素、溶菌酶

正常形态细菌

L型变异抗体或补体

(部分或完全失去胞壁)正常霍乱弧菌霍乱弧菌L型一、形态和结构的变异

特殊结构的变异：

42-43℃

炭疽杆菌

失去形成芽胞能力,毒性降低10-20天

变形杆菌（H)1%石炭酸

单个菌落（O)

迁徙生长

鞭毛变异一、形态和结构的变异二、菌落变异在陈旧培养基中长期培养

光滑型菌落

粗糙型菌落

S

或在有免疫力的人体内

R失去LPS的特异性多糖重复单位同时伴有其他性状的改变SinglecellsortofSalmonellacultureresultsindifferentcolonymorphologyNon-Geneticvariation三、毒力变异

β棒状噬菌体

白喉棒状杆菌

获得白喉毒素

胆汁、甘油、马铃薯培养基

牛型结核杆菌卡介苗

13年(230代)三、毒力变异四、耐药性变异

细菌对某种抗菌药物有敏感变成耐药的变异称为耐药性变异。金黄色葡萄球菌耐青霉素的菌株已从1946年的14%上升至目前的70%以上。有些细菌还表现为同时耐受多种抗菌药物，即多重耐药性，甚至产生药物依赖性。

含链霉素培基

痢疾杆菌

依链株(耐药菌株)

长期培养

四、耐药性变异四、耐药性变异五、代谢的变异某种微生物原来在代谢过程中能全成某种营养成分的特性,会变为失去这种能力,成为所谓的营养缺陷型。

肠道杆菌细胞壁脂多糖上的特异性多糖称为O抗原，具有属特异性;鞭毛蛋白称为H抗原，具有种特异性。血清学鉴定的基础。O与H是可以发生变异的。

六、抗原性的变异第三节微生物变异的机理表型的差异只与环境有关特点:暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为一、非遗传性变异

微生物受外界环境条件变化影响,产生诱导作用,使基因表达暂时改变,某一表型性状随之发生改变,当除去该诱发条件时,可恢复原来的性状。

遗传型变异（基因转移、基因突变)：遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为（自发突变频率通常为10-6-10-9)第三节微生物变异的机理二、遗传性变异

在自然或人工条件下,微生物的基因发生了改变,使相应的性状也发生变化,并可以遗传下去,这就是遗传性变异。

（一)基因突变基因突变（genemutation)简称突变，是变异的一种，指生物体内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。突变率常在10-4~10-9范围内。

CharacteristicsofMutationCharacteristicsofMutation突变的特征突变的特征1.Spontaneous自发性2.Non-correspondent不对应性3.Rare稀有性4.Independent独立性5.Inducible可诱发性6.Stability稳定性7.Reversible可逆性（二)基因转移（transgenosis)转化转导噬菌体转换接合基因转移的方式1.转化（transformation)转化或转化作用：受体菌（recipient或receptor)直接吸收了来自供体菌（donor)的DNA片段，通过交换整合到自己的基因组中，从而获得部分新的遗传型状的现象。接受了供体菌DNA的受体菌称为转化子（transformant)。范围：原核生物中，转化是一个较普遍的现象。转化发生的条件:两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的那些种中，其不同菌株间也不一定都可发生转化。进行转化的受体细胞必须处于感受态(competence)。即受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。也可以采用人工的方法使细菌转变成感受态供体菌受体菌DNA片段1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae)的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力自然转化过程的特点：a)不需要活的DNA供体细胞；b)转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；

c)通常情况下质粒的自然转化效率要低得多。

人工转化用CaCl2处理细胞,电穿孔等是常用的人工转化手段。

在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段,是基因工程的奠基石和基础技术。

不是由细菌自身的基因所控制;用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的"人工感受态”。

质粒的转化效率高;2.转导（transduction)：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传形状的现象。获得新遗传形状的受体细胞称为转导子（transductant)。

普遍转导:通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段部分携带到受体菌中，而实现其遗传性状传递到受体菌的转导现象局限性转导:通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。

Transduction1.Generalizedtransduction2.Specializedtransduction3.接合（conjugation)：供体菌通过性菌毛传递不同长度的单链DNA给受体菌，在后者细胞中发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象。获得新性状的受体细胞称为接合子。存在范围：细菌和放线菌中都存在接合现象。

TransferofplasmidDNAbyconjugationTheFplasmidofanF+cellisbeingtransferredtoaF-recipientcell4.原生质体融合（protoplastfusion）概念：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。原生质体融合的优点：

可以提高重组率

双亲可以少带标记或不带标记

可进行多亲本融合

有利于不同种间、属间微生物的杂交

通过原生质体融合提高产量

原生质体融合操作示意图

去壁

[A+B-]（高渗下)[A+B-]PEG或电脉冲

离心促融

去壁

[A-B+]（高渗下)[A-B+]

融合子（AA,BB,AB)长成菌落[--]检出[A+B+]融合子

筛选优良性状的融合子5.转染（transfection）：把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染（transfection）。它与转化不同之处是病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌，中间也不发生任何遗传因子的交换或整合，最后也不产生具有杂种性质的转化子。

一、从自然变异中筛选诱变剂物理因素化学因素紫外线激光离子束X射线r射线温度烷化剂碱基类似物吖啶化合物二、传统的人工诱变方法第四节微生物变异株的获得及微生物遗传性的保存三、原生质体融合（protoplastfusion)概念：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程，称为原生质体融合。原生质体融合的优点：

可以提高重组率

双亲可以少带标记或不带标记

可进行多亲本融合

有利于不同种间、属间微生物的杂交

通过原生质体融合提高产量

四、基因工程Incorporationintoartificialplasmidsofgenesfromawidevarietyofsourceshasmadepossiblethetransferofgeneticmaterialacrossvirtuallyanyspeciesbarrier。MutantsthataredetectableNon-motileNon-capsulatedRoughcolonyNutritionalSugarfermentationDrugresistantVirusresistantTemperaturesensitivePigment★按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（selectivemutant)：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型)，只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。非选择性突变株（non-selectivemutant)：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型)，能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。第四节微生物变异株的获得及微生物遗传性的保存变异菌的一般筛选方法平皿快速检测法变色圈法透明圈法生长圈法抑菌圈法梯度平板法摇瓶培养法菌种保藏：

1.目的：

①存活，不丢失，不污染

②防止优良性状丧失

③随时为生产、科研提供优良菌种

2.原