重组DNA技术课件

重组DNA技术

RecombinantDNAtechnique第一节

重组DNA技术的基本过程

BasicProcessofRecombinantDNATechnology**学习要求：

掌握重组DNA技术与基因工程的概念、基本原理和基本步骤。一、重组DNA技术相关概念重组DNA技术(RecombinantDNATechnology)：

又称基因工程技术(geneticengineering)，是在体外将不同来源的特异基因或

DNA片段插入载体分子，构建成重组DNA分子；并将它导入到合适的受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，筛选出含有目的基因的转化子细胞；再进行扩增、获取大量同一DNA分子。**

亦称DNA克隆(DNAcloning)，或基因克隆(genecloning)。克隆化(cloning)：

获取这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。重组DNA(recombinantDNA,)：又称嵌合DNA（chimeraDNA），是采用克隆技术把来自不同生物的外源DNA插入载体分子所形成的杂合DNA分子。**克隆(clone)：

指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体；**二、DNA重组技术基本程序重组DNA技术的基本过程（续）**分－－分离目的基因并进行必要的改造切－－限制酶切目的基因与载体接－－拼接目的基因与载体成重组载体转－－将重组载体转导入受体细胞筛－－筛选出含重组DNA的细胞等二、DNA重组技术基本程序****CommonEnzymesUsedinRecombinantDNATechnology第二节

重组DNA技术中常用工具酶学习要求：

掌握限制性内切酶的概念、性质和分类方法，熟悉重组技术中的其他工具酶。一、限制性核酸内切酶

（restrictonEndonuclease）

是一类能识别双链DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶，又称为限制酶（restrictionenzyme）。——基因工程的手术刀----“切”与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。**

主要是从原核生物中分离纯化而来。第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。（一）限制酶的命名：HindⅢ

属种株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶一、限制性核酸内切酶**Ⅰ和Ⅲ型限制酶通常是相对分子量较大的多亚基蛋白质复合物，同时具有内切酶和甲基化酶活性，反应过程中需有Mg2+和ATP参与。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型（基因工程技术中常用Ⅱ型）。（二）限制酶的分类：Ⅱ型限制酶通常以同源二聚体形式存在，只具有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中只需有Mg2+参与而不需有ATP参与。**Ⅱ类酶识别序具有回文结构(palindrome)特点，

即具有双重旋转对称结构的DNA反向重复双链序列。（三）Ⅱ型限制酶的作用特点：1.基本特性：大部分Ⅱ型限制酶都能识别由4~8个核苷酸组成的特定序列。**BamHⅠGGATCCCCTAGGGTCCAGGACCTG+平端切口GCCTAGGATCCG+粘端切口HindⅡGTCGACCAGCTG平或钝末端（bluntend)粘性末端（stickyend)切口：平端切口、粘端切口**GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ2.同裂酶来源不同但能识别相同序列，切割DNA后产生相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶。**BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA3.同尾酶识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端(compatibleend)。**4.可变酶识别DNA序列中的一个或几个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个核苷酸。为Ⅱ型限制酶的特例。

如：BstpⅠGGTNACC

CCANTGG**

如：BblⅠCGGN(N)4CCG;

GCC(N)4NGGC（四）限制酶的应用及影响因素1.限制酶的应用重组DNA技术、基因组DNA物理图谱绘制、基因组DNA同源性研究、切割基因组DNA或cDNA构建基因组文库或cDNA文库等。2.影响限制酶作用的因素

DNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、时间及缓冲液体系等。**

只能封闭DNA链上的缺口（nick）,而不能封闭裂口（gap）。

是一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。二、DNA连接酶(DNAligase)——基因工程的缝纫针----“接”需要在一条DNA链的3

末端具有游离的羟基、另一条DNA链的5

末端有磷酸基团，而且反应过程需要由ATP提供能量。**（一）DNA连接酶的类型：1.大肠埃希菌DNA连接酶只能连接具有互补黏性末端的两个双链DNA分子底物。需要NAD+作为辅助因子。*********GAATTC*****************CTTAAG**********5′3′5′3′EcoRIDNA连接酶*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′—P

OH—+*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′AluIT4DNA连接酶—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************+**2.T4DNA连接酶

连接的底物可以是两个双链DNA分子的互补黏性末端或平末端。最早是从T4噬菌体感染的大肠埃希菌分离，易制备，应用广。1.DNA连接酶应用（二）DNA连接酶的应用及影响因素：催化两个具有黏性末端或平末端的DNA片段形成磷酸二酯键，形成新的重组DNA分子；接合由复制叉上不连续复制链上产生的缺口；缝合DNA损伤修复、遗传重组及DNA链剪接中缺口。**2.影响DNA连接酶作用的因素①对黏性末端的连接效率远高于对平末端的连接；**②连接黏性末端的温度一般在4~15℃；③连接酶的用量，平末端连接用量高；④ATP浓度一般为0.01~1mmol/L;⑤载体分子与插入片段的摩尔数比为1:10~1:3。三、DNA聚合酶能够催化以DNA或RNA为模板合成DNA的反应，把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子或引物链的3´-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。（一）大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ（二）Klenow片段具有53

聚合酶，53

及35

核酸外切酶活性。具有53

聚合酶，35

核酸外切酶活性。**（三）TaqDNA聚合酶/PfuDNA聚合酶（四）反转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶。PfuDNA聚合酶是最常用的高保真DNA聚合酶之一。有35

核酸外切酶活性。

TaqDNA聚合酶是被发现的第一个耐热的、依赖DNA的DNA聚合酶，最佳反应温度为70~75℃。有53

聚合酶，53

核酸外切酶活性，但无35

核酸外切酶活性。对Mg2+浓度非常敏感。

普遍使用的是来源于AMV(鸟类成髓细胞白血病病毒)及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)的反转录酶，具有53

聚合酶活性。**（一）末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）

四、其它修饰酶是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3

-OH末端上。(1)底物是单链DNA或有3

突出末端的双链DNA。5′3′OHCo2+dNTPnppi5′3′(A/G/C/T)n**(2)底物是3

平端或3

凹端的双链DNA。Co2+dNTPnppi5′3′OH5′3′(A/G/C/T)nCo2+dNTPnppi5′3′OH5′3′(A/G/C/T)n用途：

（1）主要作用是在载体或目的基因3

末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重组。（2）DNA3

末端的同位素标记。**（二）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）能特异地切除DNA和RNA上5

-磷酸基团。（三）多核苷酸激酶（polynuleotidekinase）又称T4多核苷酸激酶，能催化ATP的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA片段的5

-OH末端。**重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻5´磷酸和3´羟基间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①缺口合成；②双链cDNA分子或片段连接；③平移制作高比活探针；④DNA序列分析；⑤填补3´末端反转录酶①合成cDNA第一链；②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析Klenow片段DNA聚合酶I大片段，cDNA第二链合成，具DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性TaqDNA聚合酶；PfuDNA聚合酶有53

聚合酶，53

外切酶活性，对Mg2+浓度非常敏感，最佳反应温度为70~75℃；后者还有35

核酸外切酶活性。末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针第三节

重组DNA技术中常用载体

CommonVectorsinRecombinantDNATechnology**学习要求：掌握质粒载体的概念和特点，了解各载体的应用。载体（vector）的概念克隆载体(cloningvector)表达载体(expressionvector)是在克隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相适应的强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。含有复制起始点oriC，可使插入的外源DNA序列被扩增或保存的载体。指能携带外源DNA分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具。**①含有复制起始点，具有自主复制的能力；⑥具有较高的遗传稳定性。⑤拷贝数较多，易与受体细胞的染色体DNA分开；④分子质量相对较小，以容纳较大的外源DNA；③具有一个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；②具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；克隆载体应具备的基本条件：**重组DNA技术中常用载体：一、质粒载体：最常用的目的基因克隆载体粘粒载体：用于克隆大片段DNA(自习)M13噬菌体载体：用于Sanger双脱氧DNA测序(自习)二、

噬菌体载体：构建基因组DNA或cDNA文库(自习)四、病毒载体：包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物病

毒用于在真核细胞中表达目的蛋白(自习)三、人工染色体载体：用于更大DNA片段的克隆(自习)**一、质粒(plasmid)载体细菌培养

质粒存在于细菌染色质以外，具有自我复制能力的双链环状DNA。小的约2~3kb,大的数百kb。大肠杆菌染色质质粒质粒扩增并表达蛋白质

严紧型质粒（stringentplaxmid）

松弛型质粒（relaxedplaxmid）AmprORITetr（一）pBR322质粒载体：一种克隆载体ORI：Ampr,

Tetr：两个抗性基因，用于筛选阳性克隆。PstI,BamHI：两个酶切位点，用于插入目的基因分子量较小拷贝数较高复制起始点，保证高拷贝自我复制。**

（二）pUC质粒载体系列OripUC192686bpAmprP(BLA)PlacAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCS提供多个单酶切位点用于克隆操作LacZ’β半乳糖苷酶N端α肽片段的编码基因分子量更小拷贝数更高**（三）其它质粒载体1.能在体外转录克隆基因的质粒载体由pUC系列质粒载体派生而来，带有来自噬菌体T7、SP6的启动子，为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。如pGEM-3Z/4Z.2.穿梭质粒载体（shuttleplasmidvector）是一类人工构建的，具有两种不同复制起始点和选择标记，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。**（四）TA克隆载体

许多耐热的DNA聚合酶(如Taq、Tth等)扩增时，都在PCR产物3´-末端加上了A碱基。

TA克隆载体是专为克隆PCR产物而设计的，在其MCS两侧的3´-末端携带有未配对的T碱基的载体。3′3′5′PCR产物AA5′Taq酶T载体TT5′5′3′3′**在连接酶的作用下可直接将PCR产物克隆到TA载体中。λgt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆)EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建)可容纳7kb以下的外源片段。有供外源基因片段插入的单一内切酶位点。可容纳9~23kb的外源片段。有两个或两组内切酶位点，供外源基因片段插入替代。（一）λ噬菌体载体可插入的外源DNA片段大，感染效率远高于质粒载体的转化效率。**二、噬菌体载体（自习）三、人工染色体载体（自习）

酵母人工染色体载体，简称YAC载体，由酵母染色体、酵母2μmDNA质粒的复制起始序列等元件衍生而成；可插入100kb～2,000kb外源DNA片段，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。

细菌人工染色体载体，简称BAC载体，以细菌F因子为基础构建而成；可插入100kb～300kb外源DNA片段，是人类基因组计划中序列分析采用的主要载体。**常用于构建载体的RNA病毒（整合型）：逆转录病毒(retrovirus,RV)慢病毒(lentivirus):也属于RV家族常用于构建载体的DNA病毒（游离型）：腺病毒(adenovirus,Ad)腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus,HSV)埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)痘苗病毒(vacciniavirus)四、病毒载体（自习）

**第四节

目的基因的获得和体外重组

TargetDNAAcquirement&RecombinantInVitro**学习要求：

熟悉目的基因的获取方法、重组DNA分子的构建。（一）化学合成法*已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。****避免使用稀缺密码子，及宿主细胞的密码偏好。反转录AAnATTnT5′5′mRNA反转录酶mRNAcDNA3′TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3′DNApolyIcDNA核酸酶S1双链cDNA3′5′3′5′5′加热变性加入特异性引物DNA聚合酶重复上述步骤扩增出大量的产物聚合酶链式反应退火延伸（二）PCR或RT－PCRgDNA文库：g-文库cDNA文库：c-文库方法：

用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。**（三）从基因文库中筛选BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶，15ºC+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体目的基因自连载体自连二、目的基因的体外重组—接（一）黏性末端连接1.同一限制酶切位点连EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶，15ºC重组体2.不同限制酶切位点连**目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶，15ºC重组体载体自连目的基因自连（二）平末端连接

**EcoRⅠCCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠ由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

(三）人工接头(linker)连接**5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nTT(T)nT3´5´5´

3´3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体3´A(A)nA

A(A)nA3´5´5´（四）同聚物加尾连接**PCR扩增+3′3′5′PCR产物AA5′T载体TT5′5′3′3′连接转化蓝白筛选Taq酶(五）T-A克隆****Inporting,Screening&VerificationofRecombinantDNA第五节

重组DNA分子的导入和筛选鉴定学习要求：熟悉重组DNA分子引入宿主细胞、筛选以及一些常用的分子生物学技术检测。一、重组DNA分子的导入—转宿主细胞应具备的特征：①处于感受态②对载体无严格限制③限制酶和重组酶缺陷④不对外源DNA进行修饰⑤能表达重组体所提供表型特征将体外构建的重组DNA分子导入用于复制、扩增和表达的原核或真核受体细胞。**（一）转化(transformation)

指将质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌（原核细胞）的过程。如大肠杆菌K12突变株经低渗CaCl2,0℃处理进入感受态。DH5α（二）转染(transfection)

指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组DNA分子导入真核细胞的过程。（三）感染(infection)

指以噬菌体或病毒载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后，通过感染宿主细胞而将重组DNA注入细菌或真核细胞的过程。**1.磷酸钙介导的转染2.DEAE-葡聚糖介导的转染3.脂质体转染4.电穿孔转染5.显微注射（二）转染(transfection)**非转化细胞(不能生长）单抗生素筛选转化细胞阳性重组子自身环化载体酶解未完全载体1.根据载体的耐药性标记筛选（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选二、重组DNA分子的筛选与鉴定—筛**DNA连接酶重组质粒目的基因与pBR322经BamHI酶切后进行重组**AmprTetrPstI123456789101112AmpTetTet平板123456789101112目的基因用BamHI酶切2.根据载体的耐药性标记插入失活选择Atypicalbacterialtransformationexperiment.BamHI切割目标基因。pUC质粒载体插入了β半乳糖苷酶N端α肽片段的编码基因lacZ’；产物α肽也无活性，也不能分解培养基中的X-gal。

DH5a宿主菌染色体插入了β半乳糖苷酶C端的ω肽片段的编码基因lac’△M15；产物ω肽无活性；不能分解培养基中的X-gal。有活性的β半乳糖苷酶由α肽和ω肽互补(α互补)而成，可使培养基中的X-gal分解形成蓝色化合物而出现蓝色菌落。**5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)3.根据β-半乳糖苷酶显色反应筛选α**X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶（α+ω）白色蓝白斑筛选：ωDH5a宿主菌蓝色菌落：阴性克隆;

白色菌落：阳性克隆**蓝白斑筛选组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救4.根据筛选插入的外源基因的性状进行筛选**λ-核酸外切酶(二)限制性内切酶酶切电泳鉴定(四)PCR(三)核酸分子杂交法

是从基因文库中挑选含有目的基因的阳性克隆的常用方法。

根据MCS两侧的保守序列设计引物，对提取的重组载体进行PCR扩增鉴定，并可直接进行测序。**(五)免疫化学检测法利用特异性抗体与目的基因表达的蛋白质相互结合通过放射免疫、化学发光来筛选转化菌。

用插入点的限制酶酶切重组DNA，行琼脂糖凝胶电泳，观察目的基因和载体的泳带是否存在。重组DNA技术操作的主要步骤载体目的基因(外源基因）gDNA文库cDNA文库化学合成RT-PCR连接酶重组DNA转化、转染、感染带重组DNA的宿主细胞筛选表型筛选酶切电泳鉴定核酸分子杂交法**质粒噬菌体病毒人工染色体限制酶消化开环载体DNA目的基因**ExogenousGeneExpression第六节学习要求：了解外源基因的表达。外源基因的表达表达体系的建立包括技术和策略：

外源基因表达涉及目的基因的克隆、扩增，转录、翻译，蛋白质产物的加工修饰，以及分离、纯化等过程，需要在适合的表达系统中完成。表达系统可根据受体细胞的不同分为原核表达系统和真核表达系统。**表达载体的构建；

受体细胞的建立及表达载体的导入和表达；

表达产物的分离、纯化等。

（一）对外源目的基因的要求①外源真核基因不能带有5´端非编码区和内含子结

构，必须用cDNA或化学合成基因；②外源基因必须置于原核细胞的强启动子和SD序列

等元件控制下；③重组载体必须形成正确的开放阅读框架；④外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并能被有

效翻译，所表达的蛋白质产物稳定且对宿主菌不能有毒害作用。**一、外源基因在原核系统中的表达

----大肠杆菌（E.coli）表达体系最常用

（二）对原核表达载体的要求②在MCS的上下游分别加上强启动子和转录终止区，

与插入的目的基因组成转录单位。③在MCS的上下游分别加入RBS、起始和终止密码，

与插入的目的基因组成翻译模板。①

含多克隆位点PCS，以利于外源基因插入。**是在克隆载体的基础上，加上可使插入基因在宿主细胞中表达所需的必要元件，如启动子、终止子、核糖体识别位点、起始密码和终止密码等。UU**DNA聚合酶RNA聚合酶核糖体核糖体

（三）外源基因在原核细胞中的表达方式②融合型表达蛋白：将外源目的基因与另一基因拼接成融合基因，表达融合蛋白(fusionprotein)。①非融合型表达:外源目的基因不与其他基因融合，直接从起始密码AUG开始在原核调控元件控制下

表达蛋白质。③分泌型表达：将外源目的基因与信号肽编码序列

拼接成融合基因的表达方式。*包含体(inclusionbody)：高效表达时蛋白质致密地集聚在细胞内形成的一种水不溶性结构。**优点:**（四）优缺点培养简单、迅速、经济而又适合大规模生产。①只适于表达cDNA，不适于真核基因组DNA；

②真核蛋白常不能形成正确的折叠和修饰；③真核蛋白常以无生物活性的包含体形式存在；④难以实现大量分泌性蛋白的表达；