2025 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法

GB/T18653—2025

目次

前言

…………………………Ⅲ

引言

…………………………Ⅳ

范围

1………………………1

规范性引用文件

2…………………………1

术语和定义

3………………1

缩略语

4……………………1

仪器设备

5…………………1

试剂和材料

6………………2

生物安全措施

7……………3

检验程序

8…………………3

样品采集与运输

9…………………………4

样品分离与纯化

10…………………………5

生化鉴定

11…………………6

鉴定

12PCR………………7

实时荧光鉴定

13PCR……………………9

质谱鉴定

14………………10

综合判定

15………………10

附录规范性培养基和试剂的配制

A()…………………11

附录资料性胎儿弯曲杆菌菌落形态示意图

B()………15

附录资料性胎儿弯曲杆菌产物大小和测序结果对照

C()PCR……16

附录资料性胎儿弯曲杆菌实时荧光扩增曲线

D()PCR……………17

附录资料性微生物质谱仪鉴定谱图

E()………………18

Ⅰ

GB/T18653—2025

前言

本文件按照标准化工作导则第部分标准化文件的结构和起草规则的规定

GB/T1.1—2020《1:》

起草

。

本文件代替胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法与相比除

GB/T18653—2002《》,GB/T18653—2002,

结构调整和编辑性改动外主要技术变化如下

,:

更改了范围见第章年版的第章

———(1,20021);

增加了缩略语见第章

———(4);

更改了仪器设备试剂和材料见第章和第章年版的

———、(56,20022.1,2.2);

增加了生物安全措施见第章

———(7);

更改了检验程序见第章年版的

———(8,20022.4,2.5);

增加了鉴定方法见第章

———PCR(12);

增加了实时荧光鉴定方法见第章

———PCR(13);

增加了质谱鉴定方法见第章

———(14);

更改了培养基和试剂及其配制方法见附录年版的附录

———(A,2002A)。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任

。。

本文件由中华人民共和国农业农村部提出

。

本文件由全国动物卫生标准化技术委员会归口

(SAC/TC181)。

本文件起草单位南京农业大学上海海关动植物与食品检验检疫技术中心中国动物卫生与流行

:、、

病学中心中国药科大学青岛海洋科技馆

、、。

本文件主要起草人薛峰申进玲李超曲志娜曹钰莹戴建君汤芳任建鸾王玉英王娟王琳

:、、、、、、、、、、。

本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为

:

年首次发布为

———2002GB/T18653—2002;

本次为第一次修订

———。

Ⅲ

GB/T18653—2025

引言

胎儿弯曲杆菌Campylobacterfetus为革兰阴性杆菌呈型海鸥飞行轮廓型和螺旋状弯曲无

(),S、,

芽孢和荚膜为微需氧菌在严格厌氧条件下微弱生长或不生长胎儿弯曲杆菌分为个亚种分别为

,,。3,

胎儿弯曲杆菌胎儿亚种Campylobacterfetusfetus胎儿弯曲杆菌性病亚种Campylobacter

(subsp.)、(

fetusvenerealis胎儿弯曲杆菌空肠亚种Campylobacterfetustestudinum牛羊感

subsp.)、(subsp.)。、

染胎儿弯曲杆菌胎儿亚种多会引发散发性流产牛感染胎儿弯曲杆菌性病亚种会导致不育胚胎早死和

,、

流产造成严重经济损失人类偶有胎儿弯曲杆菌胎儿亚种感染一般见于孕妇或免疫低下的个体依

,。,,

据感染部位不同常导致多种并发症

。

Ⅳ

GB/T18653—2025

胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法

1范围

本文件描述了胎儿弯曲杆菌Camlobacteretus的分离鉴定方法

(pyf)。

本文件适用于公畜包皮垢及精液母畜阴道黏液流产胎盘及胎儿的肝肺和胃内容物等样品中胎

、、、

儿弯曲杆菌的分离与鉴定

。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中注日期的引用文

。,

件仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改单适用本

,;,()

文件

。

分析实验室用水规格和试验方法

GB/T6682

实验室生物安全通用要求

GB19489

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义

。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件

。

值循环阈值

Ct:(CycleThresholdValue)

脱氧核糖核酸

DNA:(DeoxyribonucleicAcid)

核糖体核糖核酸

rRNA:(RibosomalRibonucleicAcid)

聚合酶链式反应

PCR:(PolymeraseChainReaction)

增菌运输培养基

TEM:(TransportEnrichmentMedium)

磷酸盐缓冲液

PBS:(PhosphateBufferedSolution)

5仪器设备

51荧光定量仪

.PCR。

52仪

.PCR。

53凝胶电泳设备

.DNA。

54高速冷冻离心机可控温至离心速度可达g以上

.(4℃、12000)。

55高压灭菌器

.。

56天平感量感量

.(0.01g,0.0001g)。

57冰箱或以下

.(2℃~8℃、-20℃)。

58涡旋混合器

.。

1

GB/T18653—2025

59微量移液器并

.(0.2μL~2μL、1μL~10μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1000μL,

配备与移液器匹配的吸头

)。

510级生物安全柜

.Ⅱ。

511微需氧培养装置提供微需氧条件氧气二氧化碳氮气

.(:5%、10%、85%)。

512显微镜目镜物镜

.:10×,10×~100×。

513微生物生化鉴定系统

.。

514分光光度计或核酸蛋白测定仪

.。

515麦氏比浊仪

.。

516电泳凝胶成像分析系统

.。

517微生物质谱仪

.(MALDI-TOFMS)。

518水浴装置

.:37℃±1℃、100℃。

519恒温培养箱

.。

520人工授精吸管或卡苏吸管

.(AI)。

521灭菌注射器号针头号针头

.2mL,5,20。

522无菌离心管

.。

6试剂和材料

61要求

.

除非另有规定所用试剂应为分析纯分子生物学试验用水应符合规定的一级水其他

,,GB/T6682,

试验用水应符合规定的二级水

GB/T6682。

62试剂及培养基

.

621来苏尔按照附录中配制

..5%:AA.1。

622无菌按照配制

..PBS:A.2。

623增菌运输培养基按照配制

..(TEM):A.3。

624血琼脂按照配制

..Skirrow:A.4。

625哥伦比亚血琼脂按照配制

..:A.5。

626布氏肉汤基础培养基按照配制

..:A.6。

627氧化酶溶液按照配制

..:A.7。

628过氧化氢溶液按照配制

..3%:A.8。

629巯基乙酸盐肉汤按照配制

..:A.9。

6210马尿酸钠水解试剂按照配制

..:A.10。

6211革兰染色液

..。

6212生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡

..。

6213琼脂糖

..。

6214电泳缓冲液

..50×TAE。

6215实时荧光预混液

..PCR。

6216α氰羟基肉桂酸色谱纯

..--4-(HCCA):。

6217基质溶液取α氰羟基肉桂酸按说明书配制或用市售商品

..:--4-(HCCA),,。

6218靶板标本板

../。

6219细菌提取试剂盒商品化

..DNA()。

2

GB/T18653—2025

63标准菌株

.

631胎儿弯曲杆菌胎儿亚种或胎儿弯曲杆菌性病亚种

..DSM5361/ATCC27374ATCC19438。

632大肠埃希菌标准菌株

..ATCC25922。

633粪肠球菌标准菌株

..ATCC29212。

634唾液弯曲杆菌标准菌株

..DSM10535。

7生物安全措施

实验室设施设备人员防护及实验的安全操作实验废弃物和菌种的处理应符合的

、、GB19489

要求

。

8检验程序

胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序按照图进行

1。

3

GB/T18653—2025

图1胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序

9样品采集与运输

91不同样品采集方法

.

911动物包皮垢

..

9111抽吸法

...

将动物用六柱栏保定用绳子固定采样侧的后肢剪短阴筒外部的阴毛用消毒剂如来苏尔

,,,(5%)

消毒尿道口将人工授精吸管或卡苏吸管插入阴筒内轻轻地来回抽动吸管吸取包皮液取出吸管插

,,,。,

入盛有灭菌生理盐水的离心管中吹吸数次再将吸管放入消毒液中进行消毒处理

3mL,。

9112冲洗法

...

将动物用六柱栏保定用绳子固定采样侧的后肢剪短阴筒外部的阴毛用消毒剂如来苏尔

,,,(5%)

4

GB/T18653—2025

消毒尿道口将无菌注射器连接无菌人工授精管将无菌注入包皮囊用力按

,(AI),20mL~30mLPBS,

摩收集液体置于离心管中

15s~20s,。

912动物精液

..

将动物用六柱栏保定用绳子固定采样侧的后肢剪短阴筒外部的阴毛用消毒剂如来苏尔

,,,(5%)

消毒尿道口用假阴道挤压阴茎或人工刺激的方法采集动物精液精液样品应用无菌稀释

,。PBS。

913动物阴道黏液

..

9131抽吸法

...

将动物用六柱栏保定用消毒剂如来苏尔消毒外阴部将吸管或卡苏吸管插入阴道腔直

,(5%),AI,

至吸管前段触及子宫颈轻轻地前后移动吸管吸取阴道黏液取出吸管插入盛有灭菌生理盐

,,。,3mL

水的离心管中吹吸数次再将吸管放入消毒液中进行消毒处理

,。

9132冲洗法

...

将动物用六柱栏保定用消毒剂如来苏尔消毒外阴部将无菌注射器连接无菌管将

,(5%),AI,

无菌注入阴道腔反复抽出和注入液体次次收集液体置于离心管中

20mL~30mLPBS,4~5,。

914流产胎儿与胎盘

..

无菌采集流产胎儿的肝肺和胃内容物及胎盘置于无菌塑封袋或其他密闭容器中

、,。

92样品保存运输

.

低温保存避免直接接触冰块微需氧环境下保存样品尽快送至实验室检测若样品

(4℃~8℃,),。

不能在采样当天送达实验室应将样品液静置用灭菌注射器吸取上清液注入增

,1min~2min,1mL,

菌运输培养基中送检

(TEM)。

10样品分离与纯化

101样品分离

.

1011生殖道样品

..

对于采用抽吸法采集的样品用无菌枪头吸取接种于血平板上在微需氧条件下

,300μL,Skirrow,

培养

37℃±1℃3d~5d。

对于采用冲洗法采集的样品将样品g离心去除上清液加入无菌重悬接种于

,3500,500μLPBS,

血平板上在微需氧条件下培养

Skirrow,37℃±1℃3d~5d。

1012流产胎儿及胎盘样品

..

用接种环无菌蘸取胎儿的胃内容物直接接种于平板上胎儿的肝脏和肺脏应先用火焰做

,Skirrow;

表面灭菌再接种于平板上胚胎膜用无菌冲洗去除表面大部分污染物刮取绒毛并接

,Skirrow;PBS,,

种于平板上在微需氧条件下培养

Skirrow。37℃±1℃3d~5d。

1013采样当天无法送达实验室的样品

..

对于不能在采样当天送达实验室的样品先将已接种样品的增菌运输培养基微需氧条件下

,37℃±

培养再吸取增菌液于血平板上用接种环均匀划线或者涂布棒涂布均匀在

1℃3d,200μLSkirrow,,

5

GB/T18653—2025

微需氧条件下培养

37℃±1℃3d~5d。

102样品纯化

.

取出平板观察菌落形态胎儿弯曲杆菌在平板上的菌落特征为灰粉色圆形中间凸

,。Skirrow:、,

起表面光滑而有光泽边缘规则直径为菌落形态示意图见附录中图如果呈现

,,,1mm~3mm,BB.1。

可疑菌落将可疑菌落划线于哥伦比亚血平板上在微需氧条件下培养挑取可

,,37℃±1℃3d~5d。

疑菌落的纯培养物不少于个进行后续鉴定如无可疑菌落可报告胎儿弯曲杆菌为阴性

(3)。,。

103形态观察

.

挑取纯化菌落革兰染色镜检胎儿弯曲杆菌为革兰染色阴性呈螺旋状或状一些老龄培养

,、。,“S”;

物可出现球状或球杆状不形成芽孢和荚膜在菌体的一端或两端有鞭毛

,,。

104动力观察

.

挑取纯化菌落悬浮于布氏肉汤中用相差显微镜观察胎儿弯曲杆菌呈螺旋状运动宜使

,1mL,,。

用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株为阳性对照

ATCC27374。

11生化鉴定

111氧化酶试验

.

用铂铱接种环或玻璃棒挑取纯化菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上如果在内出现紫红色紫

/,10s、

罗兰或深蓝色为阳性宜使用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株为阳性对照大肠埃希菌

。ATCC27374,

标准菌株为阴性对照

ATCC25922。

112过氧化氢酶试验

.

挑取纯化菌落加至干净玻片上的过氧化氢溶液中如果在内出现气泡则判定结果为阳

,3%,30s

性宜使用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株为阳性对照粪肠球菌标准菌株

。ATCC27374,ATCC29212

为阴性对照

。

113硫化氢H2S试验

.()

纯化菌落接种于巯基乙酸肉汤中试管口悬吊一条长宽为的乙酸铅滤纸

,×20mm×6mm,

微需氧环境中培养观察如见滤纸变黑即为产生即为硫化氢试验阳性宜使用

37℃±1℃,72h,H2S,。

胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株为阳性对照胎儿弯曲杆菌性病亚种标准菌株

ATCC27374,

为阴性对照

ATCC19438。

11425℃和42℃生长试验

.

挑取纯化菌落接种于哥伦比亚血琼脂平板上微需氧条件下和培养

,,25℃±1℃42℃±1℃

观察细菌生长情况

3d,。

115甘氨酸氯化钠试验

.、

纯化菌落分别接种于含甘氨酸或氯化钠的巯基乙酸肉汤中微需氧环境培养

1%3.5%,37℃±1℃

培养基近表面有云雾状生长为阳性甘氨酸试验时宜使用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株

3d,。,

为阳性对照胎儿弯曲杆菌性病亚种标准菌株为阴性对照氯化钠试验时宜

ATCC27374,ATCC19438;,

使用唾液弯曲杆菌标准菌株为阳性对照胎儿弯曲杆菌性病亚种为阴性对照

DSM10535,ATCC19438。

6

GB/T18653—2025

116马尿酸钠水解试验

.

纯化菌落接种于马尿酸钠液中制成浓厚菌悬液水浴再加入

0.4mL1%,37℃±1℃2h,0.2mL

茚三酮试剂混匀后水浴观察结果变深紫色为阳性淡紫色或不变色为阴性

,20min,,。

注上述生化试验使用商品化生化鉴定试剂盒生化鉴定卡微生物生化鉴定系统等按说明书进行

:、、。

117结果判定

.

胎儿弯曲杆菌的判定按照表进行符合胎儿弯曲杆菌生化特性的菌判定为生化鉴定结果阳性

1。,。

不符合胎儿弯曲杆菌生化特性的菌判定为生化鉴定结果阴性

,。

表1胎儿弯曲杆菌生化反应

氧化酶过氧化氢硫化氢生长试验马尿酸钠

菌名

试验酶试验试验甘氨酸氯化钠水解试验

25℃42℃1%3.5%

胎儿弯曲杆菌性病亚种

b

Cfetusvenerealis+V-VV---

.subsp.

胎儿弯曲杆菌胎儿亚种

b

Cfetusfetus+++VV+--

.subsp.

空肠弯曲杆菌

ac

Cjejuni+V+-VV-+

.

猪肠弯曲杆菌

Chyointestinalis++n.d.-+V-n.d.

.

唾液弯曲杆菌

Csputorum+Vn.d.-+++n.d.

.

注阳性反应阴性反应反应不定未确定

:“+”———;“-”———;“V”———;“n.d.”———。

a空肠弯曲杆菌空肠亚种阳性空肠弯曲杆菌德莱亚种不确定

,。

b虽然胎儿弯曲杆菌不属于嗜热弯曲菌相当多的菌株可在生长

,42℃。

c空肠弯曲杆菌空肠亚种阳性空肠弯曲杆菌德莱亚种阴性

,。

12PCR鉴定

121DNA模板的制备

.

从哥伦比亚血琼脂上挑取个个胎儿弯曲杆菌疑似单菌落于无菌水中混匀放置于干

4~5500μL,

式恒温金属浴中冷却后g离心上清液即为模板获得的模板立即

10min,,120002min,DNA。DNA

使用或放入冰箱保存备用

-20℃。

也可使用等效的商品化细菌提取试剂盒并按其说明书制备模板

DNADNA。

122PCR扩增

.

1221引物

..

按照表信息合成胎儿弯曲杆菌引物

2。

7

GB/T18653—2025

表2胎儿弯曲杆菌PCR检测用引物信息

组分名称序列目的基因片段长度

MG3FGGTAGCCGCAGCTGCTAAGATcstA

764bp

MG4RTAGCTACAATAACGACAACT

1222对照设置

..

检测过程中分别设阳性对照阴性对照和空白对照使用胎儿弯曲杆菌胎儿亚种标准菌株

、。

或胎儿弯曲杆菌性病亚种标准菌株为阳性对照使用除胎儿弯曲杆菌之外的

ATCC27374ATCC19438,

一株其他弯曲杆菌标准菌株为阴性对照以无菌去离子水为空白对照

,。

1223PCR反应体系

..

胎儿弯曲杆菌检测反应体系按照表配制

PCR3。

表3胎儿弯曲杆菌PCR反应体系

组分名称体积

/μL

预混液

PCR(2×)12.5

上游引物

(10μmol/L)1.0

下游引物

(10μmol/L)1.0

模板

DNA2.0

无菌去离子水

8.5

总量

25.0

1224PCR反应程序

..

预变性变性退火延伸个循环延伸

95℃3min;95℃30s,54℃30s,72℃1min,30;72℃10min。

123电泳

.

用电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶平板含或替代物凝固后放

1×TAE1.5%(1μL/mLEBEB),

入水平电泳槽使电泳缓冲液刚好淹没胶面将上述扩增产物样品加入样品孔使用分子

,。5μL,DNA

质量标准参照物作对照电泳当指示剂到达凝胶底部约时停止于凝胶成

。100V25min~35min,1/3,

像仪观察电泳条带约

(764bp)。

124结果判定

.

质控系统阳性对照出现预期大小的扩增条带阴性对照和空白对照均未出现预期大小的扩增条

:,

带则试验成立以上要求应在同一次试验中同时满足否则本次试验无效

,。,,。

阳性结果