(3.1)-3.血管发生的分子病理学基础

血管发生的分子基础人类的血管新生过程：排卵及黄体形成期的卵巢、月经周期的子宫内膜及创伤愈合等一些特定器官组织并且受到严密调控，即仅在短时间内发生血管新生，随后即被抑制而处于静止状态为治疗“血管新生依赖性疾病”，血管生成调控机制的研究与认识是十分重要的，并已成为医学及生命科学研究领域的热门课题学习内容：血管形成：指的是由血管母细胞或造血血管母细胞来源的内皮细胞原位分化形成新血管的过程；在生理状态下，血管形成仅限于胚胎形成的早期血管新生：指由即存的血管以出芽的方式形成新血管的过程。在生理状态下，血管新生则存在于胚胎发育和出生后两个时期血管生成的过程及类型●血管内皮前期细胞来源于造血干细胞和胚胎干细胞，表达CD34和CD31，其分化增殖导致新血管的形成Flk-1/VEGF系统不仅是EPC及血液干细胞发生的必需调控系统，而且在以后的内皮细胞增殖和分化等血管新生过程中也起重要作用皮细胞的生物学行为、器官特异性和病理性血管内皮细胞增生以及研究间充质干细胞诱导分化等领域提供了新的重要的理论依据●缺血性疾病的治疗：注入带有血管内皮生长因子基因的EPC进行基因治疗将成为最有前景的治疗方法●血管依赖性疾病的治疗：如肿瘤的治疗，可导入带有抑癌或诱导肿瘤细胞死亡基因的EPC，使它选择性聚集在癌增殖的中心部位，进行肿瘤的基因治疗，也将成为今后肿瘤治疗的重要方案之一血管发生不仅是胎儿时期循环系统建立的起点，在实体肿瘤、炎症和糖尿病性视网膜病变等许多疾病的发生发展中也起关键作用。有许多生长因子参与血管的发生，其中最重要的是血管内皮生长因子（VEGF）,它在多种生理和病理性血管发生中发挥重要作用血管内皮生长因子及其受体VEGF121VEGF145VEGFVEGFVEGF189VEGF206（较为少见）VEGF-BVEGFVEGFVEGFVEGF-DVEGF-E●VEGF121、VEGF145及VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能特异地直接作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞的有丝分裂，增加血管内皮细胞的通透性；●VEGF189和VEGF206具有肝素亲和性，是与细胞外基质紧密结合的不溶性蛋白，具有增加血管内皮细胞通透性的作用VEGF的作用●VEGF主要由血管周围的细胞产生，并主要通过旁分泌机制作用于内皮细胞，在促进血管形成、抑制内皮细胞的凋亡以及提高血管通透性等方面发挥重要作用血管内皮生长因子受体的类型VEGF受体：VEGF受体1（VEGFR-1，又称flt-1）VEGF受体2（VEGFR-2，又称flk-1或KDR）VEGF受体3（VEGFR-3又称flt-4）：Flt-4表达增强与肿瘤的淋巴结转移有关它们均由细胞外重复免疫球蛋白样区域和细胞内酪氨酸激酶区域以及连接两者的跨膜区域3部分构成，属酪氨酸激酶受体，称为Flt家族血管内皮生长因子的功能VEGF与血管内皮细胞表面的特异性受体结合后，可产生多种生物学功能•促进内皮细胞的增殖：增殖信息转导主要通过KDR/Flk-1完成，而Flk-1主要与血管形成和其它几种基因如：MAPK、磷脂酶C-γ和磷酸肌酸激酶C等的表达有关•增强血管的通透性：VEGF引起血管通透性增加呈可逆性，这与血管内皮细胞有孔化、血管内皮细胞间缝隙形成以及囊泡结构有关在体内增加的VEGF可储存在VVO中，VEGF通过增强VVO的功能来增加毛细血管后微静脉和小静脉的通透性PLGFPLGF血管内皮生长因子与其受体的关系KDR/Flk-1在胎生早期至少在内皮细胞增殖信号的转导过程中发挥重要作用；KDR/Flk-1可能作用于它们共同的前体细胞，或可能先引起内皮细胞损伤，再引起血细胞的形成障碍lFlk-1酪氨酸激酶区域靶基因研究胎生早期Flk-1能够捕捉VEGF，以负型调节因子形式发挥作用VEGF-Flk-1系统也作用于血管外的其它细胞如巨噬细胞信号转导蛋白及其相互作用VEGF与VEGFR的结合引发受体构象变化（二聚体形成）和自磷酸化（磷酸化过程中，起重要PTB，适配器蛋白和P13-K也起作用并使下游蛋白发生磷酸化，传递血管新生VEGF信号传导途径细胞外基质与基质金属蛋白酶●ECM可将其分为基膜（BM）和间质结缔组织（CT）两大类胚胎发育、决定细胞粘附迁移、创伤修复及肿瘤浸润转移等方面都起着重要作用细胞外基质的种类ECM成分由4大家族组成基质金属蛋白酶（MMPs）l基质金属蛋白酶的家族成员按照MMPs结构及作用底物的不同将其分为6大类:胶原酶、明胶酶、间质溶素、膜型基质金属蛋白酶、弹性蛋白酶及未定类等●MMPs的组织来源非常广泛，某些细胞在生理条件下就有微弱的表达。在病理条件下，MMPs的产生、分泌与活化明显增高如：MMP-2与MMP-9是参与细胞外基质重塑的主要蛋白酶，在许多恶性肿瘤的浸润和转移过程中，癌细胞表达高水平的MMP-2与MMP-9基质金属蛋白酶的结构和性质●基质金属蛋白酶的结构MMPs成员包含5个区域:疏水信号肽区含有半胱氨酸残基的前肽区域：维持酶原的稳定催化活性区域：有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要富含脯氨酸的铰链区羧基末端即血红素结合蛋白同源序列：与酶的底物特异性有关基质金属蛋白酶的性质●其催化作用依赖于含锌离子的活化中心●该蛋白酶多以酶原形式由细胞分泌，后经过各种物理、化学和生物因素的作用才能变成具有降解活性的蛋白酶●MMPs酶原能被其它的蛋白酶或有机汞激活●在MMPs酶原的活化过程中要失去约10kD左右的分子结构●在cDNA序列上，各MMPs之间具有一定的同源性；●每个MMPs可以裂解一种或多种细胞外基质成分，某一ECM成分也可被多个MMPs所裂解●MMPs的活性可以被一些体内自然产生的组织抑制物或人工合成的抑制物所降低基质金属蛋白酶的活化与调控机制金属蛋白酶的活化机制•MMPs是以无活性的酶原形式由细胞合成和分泌•在体外，一些物理因素或化学试剂能和半胱氨酸的巯基反应，解除其与锌离子之间的联系，暴露锌离子，使酶原处于一种活化的中间状态•在体内，一些蛋白水解酶（如胰蛋白酶、血浆纤溶酶和激肽释放酶等能够选择性地裂解前肽片段，甚至能将半胱氨酸残基之前的片段进行裂解，从而使酶原处于一种活化的中间状态•随后，一些已被激活的MMPs便可选择性地裂解这些处于活化中间状态的酶原，赋予它们永久的活性基质金属蛋白酶的调控机制MMPs的产生、分泌与发挥功效受到多种因素的严密调控，包括转录水平、酶原激活及活化酶的抑制物3个层次的调节转录水平的调节•MMPs转录水平的调节关键在于AP-1和PEA-3两位点与各种因子之间的关系。AP-1是c-fos和c-jun产物识别的部位，这两种蛋白与AP-1位点形成杂二聚体，进而促进MMPs的转录•PEA-3位点是ets基因产物的结合点，Ets表达高的细胞中MMP-1、MMP-3和MMP-9的基因表达及MMP-9的明胶水解活性均显著增高•各种生长因子、细胞因子、激素及癌基因产物都对MMPs的转录水平调节产生巨大影响●MMPs酶原在体外可被多种物理和化学因素所激活，在体内可被许多组织蛋白酶所激活，甚至MMPs家族内某些成员间也可具有一定的酶原激活效应●纤溶酶原激活物-纤溶酶系统在MMPs酶原激活中起重要作用，该系统可以启动MMPs的级联放大效应活化酶的抑制物调节●在体内，MMPs的分泌和活化并不能使细胞外基质充分降解，这是因为有些宿主细胞或肿瘤细胞自身所产生的天然抑制物的存在●常见的天然抑制物有α2-巨球蛋白(α2M）、纤溶酶原激活物抑制物（PAI）和MMPs组织抑制因子（TIMPs）●α2M是一种由肝脏生成的高分子量（750kD）血浆糖蛋白，是一种重要的MMPs清除剂，可非特异性地抑制MMP-1、MMP-●PAI-1也可以通过抑制纤溶酶原激活物(PA)的产生和表达，来干扰级联放大激活过程，继而抑制MMPs酶原的激活●TIMPs家族是一个多基因家族的编码蛋白质，其成员有：TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4●MMPs与TIMPs的相互作用关系主要分两步：第一步是MMP与TIMP形成短暂、快速和可逆的双分子复合物过程；第二步是随后发生的缓慢、几乎是完全不可逆的过程，在此过程中MMPs与TIMPs经同分异构化形成紧密的复合物，从而达到对MMPs水解活性的最终抑制目前，还存在有许多人工合成的MMPs抑制●与MMPs催化中心Zn离子鳌合而抑制其水解酶活性的抑制物●阻断MMPs酶原活化的抑制物●在基因水平阻断MMPs合成的抑制物当前开发了可选择性抑制MMPs，特别是MMP-2及MMP-9的非肽类抑制物，如AG3340、CGS27023A及BAY12-9566等基质金属蛋白酶的促新血管形成作用●MMPs在血管新生过程中的表达及调控●MMPs在生理性血管新生过程中的表达及调控●MMPs在某些伴有血管新生的疾病中的表达及调控●MMPs在癌组织中的表达及调控血管壁的平滑肌细胞在VEGF的作用下也能增加MMP-1、MMP-3和MMP-9的蛋白质及其●MMPs在不同癌组织中的表达不同种类的癌细胞所表达的MMPs分子种类和表达量也不相同乳腺癌：MMPs（除MMP-7，-8及-13外）高表达子宫内膜癌：MMP-7，-8及-9呈高表达甲状腺癌：只有MMP-2呈高表达口腔癌：除MMP-7外其它MMPs都高表达l多数癌组织中潜在型MMP-2的激活程度是癌发生转移的重要指标。因此检测癌组织内MMP-2l肿瘤细胞及其间质的某些细胞，包括巨噬细胞和纤维母细胞都表达和产生MT-MMP，后者能转录调节因子Ets家族迄今发现至少有ets-1、ets-2、spi-1、erf及ela-f等11种ets基因家族成员Ets家族蛋白的调节机制毒基因插入和染色体的移位●多种生长调节因子，如生长因子、非核性原癌基因蛋白、蛋白激酶C激活剂及细胞内钙浓度等都可作用于ets基因，调节Ets蛋白表达的不同水平，即基因转录、翻译后修饰及蛋白稳定性Ets-1与新血管形成●血管周围基膜的分解和内皮细胞本身的迁移力是血管生成的两个关键因素。前者主要与MMP-1有关，后者则主要与Ets-1有关●Ets家族蛋白是转录调节因子，在蛋白酶及受体型酪氨酸激酶的转录中发挥重要作用达ets-1mRNA,其产物Ets-1蛋白则通过与MMP-1基因上的ets基序相结合调节MMP-1基因的表达，发挥其在其它重要的血管生长因子●碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）●血小板源性生长因子（PDGF）●表皮生长因子（EGF）●胰岛素样生长因子（IGF）●其它与新血管形成有关的因子碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)●bFGF是血管内皮细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角膜细胞、神经细胞及星形胶质细胞等生长的刺激物●人类bFGF基因定位于4号染色体上,基因全长大于40kb，人的bFGF有18、22、22.5和24kD4种表达形式●18kD的蛋白质主要分布于细胞质中，可以增强细胞的迁移，介导FGF受体的下行调节以及细胞在软琼脂中的生长,这些效应可在FGF受体显性失活突变存在的情况下被抑制●而高分子量者（22、22.5和24kD）则多分布于细胞核内及核糖体中，只能介导细胞在软琼脂中以及在低血清条件下的生长，并且在FGF受体显性失活突变存在的情况下不被抑制bFGF在体内的分布bFGF除分布于细胞内，还分布于许多细胞的胞膜及胞外基质中bFGF的生物学功能●网状内皮细胞的修复：bFGF是很强的促血管壁细胞增殖因子，诱导新血管形成。通过对内皮细胞的趋化作用和促有丝分裂作用加强其分化功能。bFGF还能促进血管平滑肌细胞的有丝分裂●结缔组织的修复：bFGF能促进多种类型的间充质细胞的有丝分裂，不仅促进其增殖，还可加速其分化●在胚胎发育中的作用：bFGF具有促进细胞增殖●bFGF存在两类受体：一类是高亲和力受体FGFRs，属酪氨酸激酶类受体，另一类为低亲和力受体HSPGs，即肝素样受体●HSPGs主要存在于细胞表面与细胞周围的基质中。bFGF与HSPGs结合形成二聚体，构象发生变化后与FGFRs结合，并激活受体型酪氨酸激酶，后者使底物磷酸化bFGF的调节及应用前景bFGF基因表达在转录水平和/或转录后的调控有细胞特异性，许多能够刺激细胞增殖的因素均可诱导血管平滑肌细胞中bFGF的表达lbFGF与肿瘤的关系bFGF与肿瘤（如胃癌、神经胶质瘤）生长、增殖密切相关。bFGF本身并不是肿瘤细胞的营养因子，而是参与肿瘤的血管形成以促进肿瘤生长bFGF的临床应用前景●bFGF对皮肤移植成活和减少收缩有明显效安全、有效的创伤愈合治疗药物●对神经性耳聋治疗取得良好疗效，并提高或恢复了耳聋患者的听力血小板源性生长因子（PDGF）PDGF主要由粘附于血管损伤处血小板的α颗粒释放，由两种肽链（A链、B链）通过二硫键连接形成的同源或异源二聚体PDGF-AB和PDGF-BBPDGF受体的生物学功能●PDGF通过影响骨骼肌中细胞骨架与细胞膜的相互作用而致细胞骨架重排●参与胚胎的发育和生长以及中枢神经系统发育过程PDGF及其受体表达与相关的疾病●PDGF能促进伤口愈合及骨缺损修复●应用重组PDGF治疗糖尿病引起的溃疡也已进入临床实验阶段表皮生长因子（EGF）制着细胞的代谢、生长、分化和癌变发展和皮肤创面愈合等密切相关表皮生长因子及其受体的结构主要在颌下腺、小肠Brunner腺和肾脏等部位胰液、肠液、胆汁、乳汁、前列腺液和血液等几乎所有体液中EGFR属于酪氨酸激酶受体超家族中的一员，是原癌基因c-erbB1编码的单链跨膜糖蛋白EGFR与配体结合后，经跨膜部，激活胞内一系列蛋白质分子（第二信使将信号传递繁殖及分化所必需的蛋白质，最终调节细胞的生长及分裂EGFR广泛分布于哺乳动物的上皮细胞，在啮齿类和人类内胚层壁层、成熟骨骼肌和造血组织以外的各种组织中表达，在人类的多种肿瘤中如神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌和头颈部鳞癌表达增高表皮生长因子及其受体的生物学功能细胞内DNA、RNA和蛋白质的合成，加速上皮细胞的增殖和分化，还能推迟角化细胞的老化时间；●EGF对胃粘膜细胞有保护作用和抗消化性溃疡作用●EGF/TGF-α也是血管生成因子和化学趋化因子●EGFR基因拷贝数增加或过度表达，能多肿瘤生长，促进正常细胞的转化和恶性肿瘤的转移●调节骨和钙的代谢等功能表皮生长因子的表达及其应用前景EGF及受体在癌组织中高表达，EGFR表达与肿瘤病人的预后密切相关，而且EGFR表达阳性的肿瘤还表现出对化疗药物的抵抗性目前已制备针对EGFR单克隆抗体以治疗肿瘤EGF可用于创面愈合和胃、十二指肠溃疡病的局部治疗转化生长因子-β(TGF-β)●TGF-β是TGF家族中的一类具有激素样活性为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5●TGF-β1对间皮起源的细胞具有生长刺激作用，而对上皮起源的细胞则是一潜在的生长抑制因子TGF-β1最初从血小板中提纯,是一个二硫键连接形成的二聚体多肽，分子量25kDTGF-β1广泛存在于哺乳动物的所有组织中，以血小板及骨组织中表达水平最高一跨膜糖蛋白，广泛分布于各种正常细胞与肿瘤细胞表面●Ⅰ和Ⅱ型受体是主要参与TGF-β信息转导的分子,可传导TGF-β的多种生物学活性●Ⅲ型受体又叫β聚糖，是蛋白多聚糖，分子量并促进配体与受体的结合TGF-β的生物学功能●抑制上皮源性细胞的生长，包括一些恶性肿瘤细胞●促进间皮起源细胞的生长●促进细胞外基质的合成及贮存，包括胶原蛋白和纤连蛋白等●调节胚胎发生过程●增加某些降解酶抑制因子的合成:如PAI-1、TIMP等；抑制某些蛋白酶的表达（如胶原酶在组织修复、炎症反应和间质纤维化中也起重要作用转化生长因子-β及其受体的调节机制及应用前景通过调控Ⅰ型受体的表达，实现对TGF-β信号转导的控制将具有重要的临床意义许多的特异性效应物可改变受体的表达，从而改变细胞对TGF-β的反应TGF-β与肿瘤lTGF-β1作为肿瘤负向调控的生长因子可能在大肠癌等肿瘤的基因治疗上有广阔前景l抗TGF-β的作用，可望用于治疗肝硬化、肺纤维化、硬皮病、慢性胰腺炎和肾小球疾病等胰岛素样生长因子（IGF）IGF家族有IGF-1和IGF-2，主要产生于肝脏IGF-1既具有胰岛素样作用，又可促进细胞分化和增殖，在人和脊椎动物生长发育过程中起重要作用IGFRs有IGFR-1和IGFR-2两种受体，主要分布于细胞膜上；IGF-1和IGF-2均主要通过IGFR-1发挥作用在血浆中IGFs以结合蛋白（IGFBPs）的形式存在，二者以二硫键结合。IGFBPs通过调节IGF与IGFR结合，具有协同IGF穿越毛细血管屏障的作用IGF-1及其受体的生物学功能●IGFs与受体结合后引起受体构象变化并激活内源性激酶，继而使至少3个酪氨酸残基磷酸化，发挥生物学作用胰岛素样生长因子的研究及应用前景IGF-1已用于多种疾病的治疗，如治疗胰岛素耐受型糖尿病和坐骨神经损伤等在中枢神经系统损伤的治疗中，认为IGF-1也是一种有前途的治疗药物其它与新血管形成有关的因子●血小板源性内皮细胞生长因子