肾脏干细胞产品质量控制指南（试行）

肾脏干细胞产品质量控制指南（试行）1目的为规范治疗用肾脏干细胞产品的全生命周期质量控制，明确质量控制要点与可接受标准，保障产品的安全性、有效性和质量一致性，根据《中华人民共和国药品管理法》《细胞治疗产品生产与质量控制指导原则（试行）》，结合肾脏干细胞产品的研发生产特点制定本指南。2适用范围本指南适用于自体/异体来源成体肾脏干细胞、诱导多能干细胞（iPSC）分化来源肾脏干细胞等治疗用肾脏干细胞产品的质量控制，涵盖临床研究阶段和上市许可阶段产品，未经基因修饰或经临床验证安全性的定点基因修饰肾脏干细胞产品均适用本指南。3规范性引用本指南引用《中华人民共和国药典》（2025年版）三部相关要求、ICHQ5A（人用动物源生物技术产品的病毒安全性评价）、ICHQ5B（生物技术产品的质量分析）、ICHQ7（活性药物成分的GMP生产指南）、国家药品监督管理局发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》相关要求，未注明日期的引用版本适用于本指南。4原材料质量控制4.1供体与原始细胞材料质量控制4.1.1成体来源肾脏干细胞供体控制自体供体应当完成全套流行病学筛查，筛查项目包括：乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒（HIV）I/II型抗体、梅毒螺旋体抗体、巨细胞病毒（CMV）IgM抗体、EB病毒核酸、人类嗜T淋巴细胞病毒（HTLV）I/II型抗体，所有筛查结果阴性方可用于分离制备；供体应当排除遗传性肾脏疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病病史，肾活检样本应当经病理确认无异常病变。异体供体除符合上述筛查要求外，还应当完成人类白细胞抗原（HLA）高分辨分型，供体遴选符合伦理审查要求，排除供体携带的遗传性致病变异。4.1.2iPSC来源肾脏干细胞原始材料控制起始iPSC种子细胞应当建立三级细胞库，检定符合要求：STR分型明确，无交叉污染；多能性检定：碱性磷酸酶染色阳性率≥95%，流式检测Oct4、Sox2、Nanog表达阳性率≥90%，体外三胚层分化试验证实多能性；全基因组测序确认无致病性拷贝数变异与点突变，整合型重编程来源的iPSC应当确认无外源重编程因子整合残留；致瘤性试验裸鼠观察16周无肿瘤形成。4.2细胞库质量控制肾脏干细胞产品应当建立三级细胞库管理体系，包括原始细胞库（OCB）、主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB），各级细胞库检定项目与可接受标准如下：（1）细胞鉴别：人源细胞采用16位点STR分型鉴定，与原始供体位点匹配率≥90%，无交叉污染；（2）细胞活力：复苏后台盼蓝染色检测活率≥85%；（3）微生物污染：细菌、真菌检查阴性，支原体检查（培养法结合核酸法）阴性；（4）内毒素含量≤0.5EU/mL；（5）外源因子检定：体外培养法检测多种类外源病毒，体内法检测致瘤性病毒，特异性病毒筛查结果均为阴性；（6）细胞遗传学检定：G显带核型分析异常染色体占比≤5%，全基因组CNV检测无致病性遗传变异；（7）特异性表型检定：流式检测CD24+CD133+双阳性细胞占比，成体来源肾脏干细胞≥80%，iPSC分化来源肾脏干细胞≥70%，qPCR检测核心转录因子SIX2、PAX2表达阳性，符合设定阈值；（8）致瘤性检定：原始细胞库与主细胞库必须完成裸鼠致瘤性试验，接种1×10^7个细胞观察16周，无肿瘤形成方可合格，工作细胞库可豁免致瘤性试验，但每扩大培养一代应当重新进行核型检定。4.3生产用原材料质量控制生产过程中使用的所有原辅材料应当符合药用级质量要求，优先选择无动物源、成分明确的原材料：（1）胎牛血清：如必须使用，应当符合《中华人民共和国药典》要求，外源病毒筛查全部阴性，内毒素含量≤0.25EU/mL，血红蛋白含量≤20mg/dL，每批次提供合格证明；（2）无血清培养基：所有成分明确可追溯，无不明来源添加物，无菌、支原体、内毒素检测符合要求；（3）重组细胞因子、生长因子：纯度≥95%，残留宿主蛋白≤100ng/剂量，残留宿主DNA≤10ng/剂量，无菌、内毒素检测合格；（4）分选试剂：免疫磁珠、流式抗体应当符合医用级要求，无热原，无外源因子污染。5生产过程质量控制5.1中间产品逐阶段检定生产过程中每个关键工序应当取样进行中间产品质量控制，不合格中间产品不得进入下一工序：（1）原代分离/诱导分化阶段：原代分离后细胞活率≥80%方可进入扩增培养；iPSC诱导分化过程中每一轮诱导应当取样检测SIX2、PAX2表达，不符合表型要求的批次直接废弃；（2）扩增阶段：每次传代后检测细胞活率，活率<80%不得继续传代，记录每批次传代次数，成体肾脏干细胞从原代分离到终产品传代次数不得超过15代，iPSC分化来源肾脏干细胞扩增传代次数不得超过10代，超过传代限度的批次不得用于临床，如需突破传代限度应当完成完整的核型、致瘤性验证，确认安全性后方可调整；（3）收获后中间产品：检定项目包括细胞计数、活率、微生物污染、支原体、内毒素、表型鉴定，所有项目符合要求方可进入配药灌装工序。5.2杂质过程控制生产过程应当对各类杂质进行全程控制，明确可接受限度：（1）工艺杂质：胎牛血清残留量≤5μg/mL，胰蛋白酶残留量≤10μg/mL，分选用磁珠残留量≤100ng/10^7个细胞，游离抗体残留量≤50ng/10^7个细胞，重组生长因子残留量≤100ng/剂量；（2）细胞杂质：非目标细胞中CD45+免疫细胞占比≤5%，其他类型非目标细胞总占比≤10%；（3）致瘤风险杂质：iPSC分化来源产品中未分化iPSC残留量≤0.01%，软琼脂克隆形成试验克隆形成率≤0.01%，超过限度不得进入下一工序。6终产品质量控制6.1一般性状检查终产品外观应为均匀混悬液，无凝块、沉淀、异物、变色；pH值应为7.2~7.4；渗透压应为280~320mOsm/kg·H2O，符合上述要求为合格。6.2细胞鉴别终产品必须完成细胞鉴别，确认细胞身份：（1）基因型鉴别：STR分型与原始细胞库比对，同源性≥90%，无其他细胞交叉污染；（2）特异性身份鉴别：流式细胞术检测CD24、CD133表型，符合本指南规定的阳性率要求；qPCR检测核心转录因子SIX2、PAX2，相对表达量较阴性对照高100倍以上，确认目标细胞身份。6.3细胞计数与活率终产品活细胞计数偏差应当控制在标示量的±10%范围内，台盼蓝染色或流式检测活细胞占比≥80%，符合要求为合格。6.4杂质检测终产品应当完成所有杂质项目检测：（1）微生物杂质：细菌、真菌培养阴性，支原体检测阴性，内毒素含量≤0.5EU/mL，或按照最大临床剂量计算每公斤体重不超过0.5EU，符合要求；（2）工艺残留杂质：所有工艺残留杂质符合本指南5.2规定的限度要求；（3）细胞杂质：非目标细胞占比符合限度要求，未分化iPSC残留符合限度要求。6.5安全性检定终产品安全性检定项目如下：（1）细胞遗传学安全性：每批次终产品应当进行核型分析，染色体异常率≤5%，CNV检测无致病性遗传变异，传代超过10代的产品额外检测端粒酶活性，端粒酶活性不得高于正常体细胞的2倍，排除异常激活风险；（2）致瘤性/成瘤性：临床研究阶段，异体细胞产品每3批完成1次裸鼠致瘤性试验，自体产品首批完成后每年度抽检1次，接种1×10^7个细胞观察16周，无肿瘤形成为合格；iPSC来源产品每批次都要完成未分化iPSC残留检测和软琼脂克隆形成试验，符合限度要求；（3）外源病毒安全性：所有批次都要完成特异性病毒核酸检测，包括HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、HTLV，结果全部阴性，逆转录酶活性检测阴性，排除逆转录病毒污染。6.6功能有效性检定终产品应当完成功能检定，确认生物学活性符合要求：（1）体外功能试验：克隆形成试验，肾脏干细胞克隆形成率≥10%；基质胶三维培养试验，7天内形成肾小管样结构的克隆比例≥30%；旁分泌功能检测，每1×10^6个细胞培养24小时，上清中VEGF分泌量≥100pg，HGF分泌量≥200pg，符合上述要求为合格；（2）体内功能验证：临床研究阶段，每3批产品应当在急性肾损伤小鼠模型中进行体内功能验证，给药后28天，模型小鼠血清肌酐、尿素氮水平较阴性对照组下降≥30%，肾脏病理损伤评分下降≥40%，证实产品生物学活性符合要求，上市后每年进行1次体内功能验证，无需每批次检测。7储存与运输质量控制7.1储存控制终产品通常采用深低温冻存，应当储存于-196℃液氮或≤-150℃深低温冰箱，储存过程实行24小时连续温度监控，温度波动幅度不得超过±5℃/24h，建立温度记录台账，异常温度波动应当启动偏差调查，产品评估合格后方可继续储存；产品有效期应当经稳定性研究确定，未完成稳定性验证的产品有效期不得超过2年。7.2运输控制冻存产品运输应当采用足量干冰保温，全程维持温度≤-130℃，安装温度记录仪实时记录温度，运输过程中任何时间点温度高于-130℃且持续时间超过1小时的，该批次产品不得放行使用；复苏后常温使用的产品，应当在2~8℃条件下运输，运输时间不得超过24小时，到达接收方后应当检测活率，活率≥70%方可使用。7.3使用前解冻控制临床使用前解冻复苏，应当取样检测细胞活率和无菌，活率<70%不得使用，无菌检测不合格不得使用。8产品放行与留样8.1放行要求所有产品放行前应当确认所有检定项目符合预先批准的质量标准，生产过程记录、检验记录完整可追溯，所有偏差已经完成调查和处理，符合伦理要求，方可放行；临床研究产品由项目负责人和企业质量授权人共同签字放行，上市产品由企业质量授权人签字放行。8.2留样要求每批次产品应当留存足够量的样品，留样量不少于2倍全检量，留样储存条件与产品一致，上市产品留样保留至产品有效期届满后2年，临床研究产品留样保留至研究结束后5年。9稳定性研究为确认产品有效期和储存运输条件，应当完成规范的稳定性研究：9.1实时稳定性研究选取3批代表性终产品，在规定储存条件下放置，分别于0、3、6、12、18、24个月取样检测，检测项目包括活率、表型、纯度、安全性、生物学活性，根据检测结果确定产品有效期。9.2特殊稳定性研究冻融稳定性考察证实，冻存产品仅允许冻融1次，冻融1次后活率下降不得超过5%，冻融2次活率不得低于70%，因此明确规定终产品不得反复冻融；运输稳定性考察模拟最长运输周期和极端运输条件，考察后产品活率下降不超过10%，所有指标合格，确认运输条件合规。10特殊产品控制要求10.1异体肾脏干细胞产品额外要求除上述要求外，应当每批次验证HLA分型与供体一致，免疫原性检定，MHC-II+阳性细胞占比≤10%，符合要求方可放行。10.2基因修饰肾脏干细胞额外要求应当确认基因修饰位点正确，无插入突变，目的基因表达符合要求，插入位点不在原癌基因或抑癌基因区域