微专题11　PCR技术和基因编辑技术

6/6微专题11PCR技术和基因编辑技术1.RT-PCR（逆转录PCR）常规的PCR过程是由DNA依赖的DNA聚合酶以DNA作为模板进行扩增的，而逆转录PCR则由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。首先，由逆转录酶将RNA单链转录为与其互补的DNA（cDNA），再通过常规PCR和相应引物进行另一DNA链的合成以及DNA双链的扩增。逆转录PCR是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA，广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。2.重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR是一种通过引物之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用重叠延伸PCR可以实现基因的定点突变。如图所示：①PCR扩增DNA的过程中，PCR1应选择引物F1和R1，PCR2应选择引物F2和R2，第二步中延伸不需引物，通过PCR3大量扩增突变产物应选择引物F1和R2。②重叠延伸PCR通过在引物R1和F2上引入突变实现定点突变。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是引物R1和引物F2可以互补配对，导致引物失效。3.反向PCR技术（1）条件：当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。（2）原理：用限制酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。PCR反向扩增后，经测序可以确定未知序列。反向PCR可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA片段。具体流程如图（以EcoRⅠ酶切为例）：4.实时荧光定量PCR（1）原理①获取cDNA。从样本中提取mRNA，通过逆转录酶将样本的mRNA逆转录为cDNA。再以cDNA为模板进行PCR。②PCR扩增cDNA。在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团。探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光（如图甲）。（2）检测：每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。通过该技术检测某病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）越小，说明病毒核酸浓度越高。5.大引物PCR大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。6.不对称PCR不对称PCR是利用不等量的一对引物经PCR扩增后产生大量的单链DNA的过程，这对引物分别称为非限制性引物和限制性引物，两条引物的比例通常为100∶1，这样随着PCR反应的进行，浓度低的引物很快被消耗光，高浓度引物随即产生大量的目的单链DNA。低浓度引物的加入保证了扩增过程具有足够多的模板，而高浓度引物则保证了单链DNA的大量合成。7.基因编辑技术CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA（sgRNA）引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如图）。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。脱靶问题，即对基因组非特异性切割的有效解决方法：适当增加sgRNA的长度，设计出特异性较强的sgRNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。1.（2025·广东佛山质检）PCR定点突变技术是一种基因工程技术，它可以通过人工合成的引物，使目标DNA序列发生特定的突变，从而实现对基因的精确编辑。PCR定点突变技术的过程如图所示（图中对应的字母为引物，黑点为定点诱变的位点）。下列叙述错误的是（）A.获得片段1所需要的引物为F和R_m，且2次循环即得片段1B.获得片段2所需要的引物为R和F_m，且1次循环即得片段2C.图中两种引物F_m和R_m之间，能够进行碱基互补配对D.图中PCR扩增所需要的引物F和R最好不配对2.（2025·山东滨州高三模拟）某病毒的检测可以采用实时荧光RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）的方法，RT-PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是（）A.过程①以mRNA为模板合成单链DNAB.过程②③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，理论上需要n个引物BC.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度D.游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接3.（2023·江苏高考22题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：（1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有，扩增程序中最主要的不同是。（2）有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用。EGFP基因序列：5'ATGGTGAGCAAGGGC……GACGAGCTGTACAAG3'AnB1基因序列：5'CATGTCCAGCTGCAG……CCAAAACCACAACCA3'图2A.ATGGTG……CAACCAB.TGGTTG……CACCATC.GACGAG……CTGCAGD.CTGCAG……CTCGTC（3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有。（4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有。A.稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有。（6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是。4.（2021·海南高考25题）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是。（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是。（3）过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是。随后，Cas9蛋白可切割序列。（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是，基因敲除成功的判断依据是。（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌