微专题11　PCR技术和基因编辑技术

微专题11PCR技术和基因编辑技术1.

RT-PCR（逆转录PCR）常规的PCR过程是由DNA依赖的DNA聚合酶以DNA作为模板进行扩增的，而逆转录PCR则由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。首先，由

逆转录酶将RNA单链转录为与其互补的DNA（cDNA），再通过常规PCR

和相应引物进行另一DNA链的合成以及DNA双链的扩增。逆转录PCR是一

种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA，广泛应用于遗传病的诊

断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。2.

重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR是一种通过引物之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过

多次PCR扩增，从而获得目的基因的方法。利用重叠延伸PCR可以实现基

因的定点突变。如图所示：①PCR扩增DNA的过程中，

PCR1应选择引物F1和R1，PCR2应选择引物F2

和R2，第二步中延伸不需引物，通过PCR3大量扩增突变产物应选择引物

F1和R2。②重叠延伸PCR通过在引物R1和F2上引入突变实现定点突变。PCR1和

PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是引物R1和引物F2可以互补配

对，导致引物失效。3.

反向PCR技术（1）条件：当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序

列时，可采用反向PCR技术。（2）原理：用限制酶切割该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。PCR反向扩增后，经测序可以确定未知序列。反向PCR可用于检测目的基因在受体细胞基因组上的插入位点等未知DNA片段。具体流程如图（以EcoRⅠ酶切为例）：4.

实时荧光定量PCR（1）原理①获取cDNA。从样本中提取mRNA，通过逆转录酶将样本的mRNA逆转录

为cDNA。再以cDNA为模板进行PCR。②PCR扩增cDNA。在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团。探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；新链延伸过程中，DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光（如图甲）。（2）检测：每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。通过该技术检

测某病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值

的循环数（Ct值）越小，说明病毒核酸浓度越高。5.

大引物PCR大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。6.

不对称PCR不对称PCR是利用不等量的一对引物经PCR扩增后产生大量的单链DNA的

过程，这对引物分别称为非限制性引物和限制性引物，两条引物的比例通

常为100∶1，这样随着PCR反应的进行，浓度低的引物很快被消耗光，高

浓度引物随即产生大量的目的单链DNA。低浓度引物的加入保证了扩增过程具有足够多的模板，而高浓度引物则保证了单链DNA的大量合成。7.

基因编辑技术CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA（sgRNA）引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如图）。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。脱靶问题，即对基因组非特异性切割的有效解决方法：适当增加sgRNA的

长度，设计出特异性较强的sgRNA。CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其

明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入

宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因

治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用

前景。

1.

（2025·广东佛山质检）PCR定点突变技术是一种基因工程技术，它可以通过人工合成的引物，使目标DNA序列发生特定的突变，从而实现对基因的精确编辑。PCR定点突变技术的过程如图所示（图中对应的字母为引物，黑点为定点诱变的位点）。下列叙述错误的是（

）A.

获得片段1所需要的引物为F和R_m，且2次循

环即得片段1B.

获得片段2所需要的引物为R和F_m，且1次循

环即得片段2C.

图中两种引物F_m和R_m之间，能够进行碱基

互补配对D.

图中PCR扩增所需要的引物F和R最好不配对√解析：根据图示过程可知，获得片段1所需要的引物为F和R_m，且2次循环即得片段1，A正确；获得片段2所需要的引物为R和F_m，且2次循环即得片段2，B错误；结合题图分析，引物F_m和R_m之间，能够进行碱基互补配对，C正确；图中PCR扩增所需要的引物F和R最好不配对，以防引物发生碱基互补配对，从而不能与模板结合，D正确。2.

（2025·山东滨州高三模拟）某病毒的检测可以采用实时荧光RT-PCR

（逆转录聚合酶链式反应）的方法，RT-PCR的具体过程如图。下列有关叙

述错误的是（

）A.

过程①以mRNA为模板合成单链DNAB.

过程②③拟对单链cDNA进行第n次循环的

扩增，理论上需要n个引物BC.

该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，

可提高检测的灵敏度D.

游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接√解析：过程①是以mRNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，A正确；过程②③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光

RT-PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为

增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量（或浓度），便于检测，C正

确；游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接，D正确。3.

（2023·江苏高考22题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表

达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：（1）分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的

有

，扩增程序中最主要的不同是

⁠

⁠。模板（片段F1、片段F2）、引物

退

火温度

解析：PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2＋）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。不同的PCR反应体系中，模板和引物是不同的：扩增程序中依据不同引物设置不同的退火温度是最重要的环节，恰当地选择退火温度，尽量避免引物与模板的非特异性结合，以保证目的产物的有效扩增。而对于延伸时间而言，以常用的Taq

DNA聚合酶为例，催化DNA延伸的速度为1

000～2

000

bp/min，通常在实验室中可根据目的片段大小在30

s～2

min的时长内大致设置延伸时间，一般不需要精确控制。（2）有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用

⁠。EGFP基因序列：5'ATGGTGAGCAAGGGC……GACGAGCTGTACAAG3'AnB1基因序列：5'CATGTCCAGCTGCAG……CCAAAACCACAACCA3'图2A.ATGGTG……CAACCAB.TGGTTG……CACCATC.GACGAG……CTGCAGD.CTGCAG……CTCGTCCD

解析：由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnB1中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。（3）将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化

质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需

使用的酶主要有

⁠。解析：传统重组质粒构建需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性内切核酸酶（限制酶）。限制性内切核酸酶

（4）转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误

的有

⁠。A.

稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落B.

抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高C.

抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落D.

抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化ABC

解析：转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误；培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板法和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。（5）为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为

模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结

果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有

⁠。P3、P4

解析：EGFP为720

bp，AnB1为390

bp，二者的总大小为720

bp＋390

bp＝1

100

bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。（6）对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序

确认，原因是

⁠

⁠。解析：琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大

小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列4.

（2021·海南高考25题）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9

基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引

导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因

编辑技术的工作原理如图所示。（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码

序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，

插入时所需要的酶是

⁠。解析：基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定SgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。DNA连接酶

（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是

⁠

⁠。解析：大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。感受态细胞法

/Ca2＋处理法

（3）过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的

SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则

是

。随后，Cas9蛋白可切割

序列。解析：根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则，实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。碱基互补配对

目标基因

（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1

200

bp的基因，在

DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是

⁠

，基因敲除成功的判断依据是

⁠

⁠

⁠。解析：可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，即利用经编辑过的DNA片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探