生物制品溴盐测定指南（试行）

生物制品溴盐测定指南（试行）1范围本指南规定了生物制品中无机溴盐（以Br⁻计）的测定原理、试剂与材料、仪器设备、样品前处理、测定方法、结果计算、方法验证与偏差控制、注意事项，适用于疫苗、抗体药物、重组蛋白制品、血液制品等各类生物制品生产过程中原料、中间产物、终产品的溴盐残留量控制检测。本指南包含滴定法（适用于溴盐含量≥0.1%的样品）、离子色谱法（适用于溴盐含量0.001%0.1%的样品）、分光光度法（适用于溴盐含量0.0001%0.01%的样品）三种方法，实验室可根据样品溴盐浓度范围和自身条件选择合适方法。

##2规范性引用文件

本指南方法依据《中华人民共和国药典》（2025年版）四部通则、GB5009.182-2017《食品安全国家标准食品中铝的测定》（离子色谱部分参考）、ISO10304-1:2007《水质离子溶解性阴离子的测定第1部分：溴化物、氯化物、氟化物、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐和硫酸盐的测定》编制，检测操作未注明条件处均符合上述文件要求。

##3术语与定义

3.1无机溴盐：指生物制品生产过程中引入的溴化钠、溴化钾、溴化铵等可溶性无机溴化物，本指南测定结果以溴离子（Br⁻）计。3.2残留溴盐：生物制品经纯化工艺后，残留在终产品中的无机溴离子总量。3.3检出限：指本方法能定性检测出溴离子的最低浓度，定量限为能定量测定溴离子的最低浓度。4测定方法4.1方法一：硝酸银滴定法（摩尔法，适用于高含量溴盐测定）4.1.1原理在中性至弱碱性（pH6.5~10.5）条件下，以铬酸钾为指示剂，用硝酸银标准滴定溶液滴定样品中的溴离子，溴离子与银离子生成淡黄色溴化银沉淀，过量的银离子与铬酸钾生成砖红色铬酸银沉淀，指示滴定终点，根据硝酸银消耗量计算溴离子含量。反应式如下：Ag⁺+Br⁻→AgBr↓（Ksp=5.0×10⁻¹³）2Ag⁺+CrO₄²⁻→Ag₂CrO₄↓（砖红色，Ksp=1.2×10⁻¹²）4.1.2试剂与材料所有试剂均为优级纯，试验用水为电阻率≥18.2MΩ·cm的一级去离子水，储存于聚乙烯容器中。（1）溴离子标准储备溶液（1000mg/LBr⁻）：准确称取经105℃干燥至恒重的溴化钾（KBr，基准试剂）1.4892g，置于1000mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，4℃密封储存，有效期6个月。（2）铬酸钾指示剂（50g/L）：称取50g铬酸钾（K₂CrO₄），溶于100mL水中，滴加硝酸银溶液至产生砖红色沉淀，放置过夜后过滤，滤液稀释至1000mL，储存于棕色瓶中，室温保存有效期3个月。（3）硝酸银标准滴定溶液（0.1mol/L）：称取17.5g硝酸银，溶于1000mL水中，摇匀，储存于棕色瓶中。标定：准确称取经500℃~600℃干燥至恒重的基准氯化钠0.2g，置于250mL锥形瓶中，加50mL水溶解，加1mL50g/L铬酸钾指示剂，在不断摇动下用配制的硝酸银溶液滴定至溶液呈砖红色即为终点，同时做空白试验。浓度计算公式：

式中：c(AgNO3)——硝酸银标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；

m(NaCl)——基准氯化钠的质量，单位为克（g）；

V1——滴定氯化钠消耗硝酸银溶液的体积，单位为毫升（mL）；

V0——空白试验消耗硝酸银溶液的体积，单位为毫升（mL）；

0.05844——与1.00mL硝酸银标准滴定溶液[c(AgNO3)=1.000mol/L]相当的氯化钠的质量，单位为克（g）。

标定后浓度偏差小于0.2%方可使用，每2个月重新标定一次。（5）硝酸溶液（0.1mol/L）：量取6.3mL浓硝酸，加水稀释至1000mL。（6）酚酞指示剂（1g/L乙醇溶液）：称取0.1g酚酞，溶于100mL95%乙醇中。

#4.1.3仪器设备

（1）电子分析天平：精度0.1mg；（2）恒重干燥箱：控温精度±1℃；（3）碱式滴定管（50mL，A级）：容量允差±0.05mL；（4）酸度计：精度±0.01pH。4.1.4样品前处理（1）液态生物样品：准确吸取含溴量10~50mg的均匀样品，置于250mL锥形瓶中，加50mL水稀释，加2滴酚酞指示剂，若溶液呈红色，用0.1mol/L硝酸调节至红色褪去；若溶液无色，用0.1mol/L氢氧化钠调节至微红色，再用硝酸调节至红色褪去，此时pH范围在6.5~10.5之间。若样品pH超出范围，用硝酸或氢氧化钠调节至目标范围。（2）固态冻干生物样品：准确称取0.5~5g均匀样品（精确至0.0001g），置于250mL锥形瓶中，加50mL水充分溶解，按照上述方法调节pH。（3）含蛋白的生物样品：若样品蛋白浓度高于10g/L，需经脱蛋白处理：取样品加入等体积200g/L三氯乙酸溶液，混匀后4000r/min离心10min，取上清液用氢氧化钠调节pH至6.5~10.5后待测。4.1.5测定步骤调节好pH的样品溶液中加入1mL50g/L铬酸钾指示剂，在不断摇动下，用标定好的硝酸银标准滴定溶液滴定至溶液出现稳定的砖红色，且2分钟内不褪色即为终点，记录消耗硝酸银溶液的体积V1，同时做空白试验，记录空白消耗体积V0。

#4.1.6

式中：X——样品中溴离子的质量分数，%；

c——硝酸银标准滴定溶液的浓度，mol/L；

V1——样品滴定消耗硝酸银溶液的体积，mL；

V0——空白滴定消耗硝酸银溶液的体积，mL；

79.904——溴离子的摩尔质量，m——取样量（液态样品为g，固态样品为g），g。

结果保留两位有效数字，溴盐含量大于1%时保留三位有效数字。

4.2方法二：离子色谱法（适用于低含量溴盐测定，准确定量）

#4.2.1原理

样品经前处理去除有机物后，注入离子色谱仪，溴离子随流动相进入阴离子交换柱，基于不同阴离子在交换柱上的保留时间不同实现分离，经电导检测器检测，以保留时间定性，外标法定量，计算样品中溴离子含量。4.2.2试剂与材料所有试剂均为优级纯，试验用水为电阻率≥18.2MΩ·cm的一级去离子水，经0.22μm水相滤膜过滤脱气。（1）溴离子标准储备溶液（1000mg/LBr⁻）：同4.1.2（1）。（2）溴离子标准中间溶液（10mg/LBr⁻）：准确吸取1.0mL溴离子标准储备溶液置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，4℃储存有效期1个月。（3）溴离子标准系列工作溶液：分别准确吸取溴离子标准中间溶液0.5mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成浓度为0.05mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L的标准系列溶液，临用前配制。（4）碳酸钠储备溶液（0.25mol/L）：称取26.5g无水碳酸钠，溶于水后定容至1000mL，摇匀，经0.22μm滤膜过滤后使用，4℃储存有效期3个月。（5）碳酸氢钠储备溶液（0.25mol/L）：称取21.0g碳酸氢钠，溶于水后定容至1000mL，摇匀，经0.22μm滤膜过滤后使用，4℃储存有效期3个月。（6）淋洗液（4.5mmol/L碳酸钠+0.8mmol/L碳酸氢钠）：准确吸取18.0mL碳酸钠储备溶液和3.2mL碳酸氢钠储备溶液，置于1000mL脱气水中，混匀，现用现配。若使用高压淋洗系统，可根据仪器型号调整淋洗液浓度，保证溴离子峰与相邻峰分离度大于1.5。（7）庚烷磺酸钠溶液（20mmol/L，用于蛋白沉淀）：称取4.3g庚烷磺酸钠，加水溶解定容至1000mL。（8）0.22μm水相微孔滤膜、预处理OnGuardIIRP柱（用于去除有机物）。4.2.3仪器设备（1）离子色谱仪：配备阴离子交换柱、抑制型电导检测器、自动进样器；（2）电子分析天平：精度0.1mg；（3）高速离心机：转速可达12000r/min；（4）pH计：精度±0.01pH；（5）溶剂过滤器。4.2.4样品前处理（1）液态样品：准确吸取均匀样品，加水稀释使溴离子浓度落在标准曲线线性范围内（0.05~2.0mg/L）。对于总蛋白含量低于5g/L的样品，取稀释后的溶液过OnGuardIIRP柱（活化方式：10mL甲醇冲洗，再用20mL水冲洗平衡），弃去前3mL流出液，收集后续流出液经0.22μm水相滤膜过滤后，装入进样瓶待测。对于总蛋白含量高于5g/L的样品，取1mL样品加入1mL20mmol/L庚烷磺酸钠溶液，混匀后12000r/min离心10min，取上清液稀释后再过RP柱和滤膜待测。（2）冻干样品：准确称取0.1~1g均匀样品（精确至0.0001g），加水溶解并定容至10mL，摇匀后按照上述步骤处理。（3）注意：样品前处理过程必须避免溴化物污染，所有容器均需先用硝酸浸泡12小时，再用去离子水冲洗干净烘干后使用。4.2.5测定步骤（1）色谱参考条件：阴离子交换柱（IonPacAS11-HC，4mm×250mm，柱温30℃）；保护柱（IonPacAG11-HC，4mm×50mm）；淋洗液：4.5mmol/L碳酸钠+0.8mmol/L碳酸氢钠等度洗脱，流速1.2mL/min；抑制器电流：80mA；进样量：25μL。（2）标准曲线绘制：将溴离子标准系列工作溶液依次注入离子色谱仪，记录色谱图，测量溴离子峰面积，以溴离子浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程，要求相关系数r≥0.999。

（4.2.6结果计算

式中：X——样品中溴离子的质量分数，%；

ρ——从标准曲线查得样品溶液中溴离子的浓度，mg/L；

V——样品定容体积，mL；

f——样品稀释倍数；

m——取样量，g。

#4.2.7检出限与定量限

本方法检出限为0.01mg/L，定量限为0.05mg/L，以质量计，液态样品检出限为0.0001%，固态样品检出限为0.0005%。

4.3方法三：分光光度法（适用于痕量溴盐测定，设备要求低）

#4.3.1原理

在酸性条件下，溴离子被氯胺T氧化生成溴单质，溴单质与酚红发生溴代反应，生成四溴酚红，在酸性条件下四溴酚红呈黄色，用乙酸乙酯萃取后，在波长590nm处测定吸光度，吸光度与溴离子浓度在一定范围内呈线性关系，外标法定量。4.3.2试剂与材料所有试剂均为优级纯，试验用水为一级去离子水。（1）溴离子标准储备溶液（100mg/LBr⁻）：准确吸取10mL1000mg/L溴离子标准储备溶液，置于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，4℃储存有效期6个月。（2）溴离子标准系列工作溶液：分别准确吸取溴离子标准储备溶液0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，置于50mL比色管中，加水稀释至10mL，配制成浓度为0μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL的标准系列，临用前配制。（3）乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH4.6）：称取16.4g无水乙酸钠，溶于适量水，加入12.0mL冰乙酸，加水定容至500mL，用酸度计校正pH。（4）氯胺T溶液（2g/L）：称取0.2g氯胺T，加水溶解定容至100mL，储存于棕色瓶中，4℃保存有效期1周。（5）硫代硫酸钠溶液（25g/L）：称取2.5g硫代硫酸钠，加水溶解定容至100mL，现用现配。（6）酚红溶液（100mg/L）：称取25mg酚红，加0.5mL0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解，加水定容至250mL，摇匀。（7）乙酸乙酯：光谱纯。4.3.3仪器设备（1）紫外可见分光光度计：波长精度±1nm；（2）恒温水浴锅：控温精度±0.5℃；（3）涡旋振荡器；（4）电子分析天平：精度0.1mg。4.3.4样品前处理（1）液态样品：准确吸取含溴量0~25μg的均匀样品，置于50mL比色管中，加水稀释至10mL。若样品含有蛋白，加入1mL200g/L三氯乙酸沉淀蛋白，离心取上清液，用氢氧化钠调节pH至中性后，定容至10mL待测。（2）冻干样品：准确称取0.1~1g均匀样品，加水溶解定容至10mL，蛋白含量高的样品按上述方法脱蛋白后待测。4.3.5测定步骤（1）向盛有样品溶液和标准系列溶液的比色管中，分别加入2mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，摇匀后加入0.5mL酚红溶液，摇匀，再加入0.4mL氯胺T溶液，立即盖塞摇匀，放置10min。（2）放置结束后，加入0.4mL25g/L硫代硫酸钠溶液，摇匀，终止氧化反应，开盖放置5min除去多余氯气。（3）加入10.0mL乙酸乙酯，涡旋振荡提取2min，3000r/min离心5min，分离有机相，将有机相转入1cm比色皿，以空白试剂（零浓度标准溶液）为参比，在波长590nm处测定吸光度。（4）以溴离子质量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程，要求相关系数r≥0.998。将样品吸光度代入标准曲线，计算样品中溴离子质量。

#4.3.6

式中：X——样品中溴离子的质量分数，%；

m1——从标准曲线查得样品中溴离子的质量，μg；

m——取样量，g。

#4.3.7检出限与定量限

本方法检出限为0.05μg/mL，定量限为0.17μg/mL，以质量计检出限为0.00005%，满足痕量溴盐检测需求。

##5方法验证要求

实验室首次采用本指南方法或更换仪器设备、人员变动时，需进行方法验证，验证线性范围：滴定法线性范围为5~100mgBr⁻，相关系数r≥0.995；离子色谱法线性范围为0.05~2.0mg/L，r≥0.999；分光光度法线性范围为0~25μg准确度：溴盐含量在0.1%以上的样品，加标回收率应在95%105%之间；溴盐含量在0.001%0.1%之间的样品，回收率应在90%110%之间；溴盐含量低于0.001%的样品，回收率应在85%115%之间。精密度：重复性相对标准偏差（RSD）：滴定法≤1.0%，离子色谱法≤3.0%，分光光度法≤4.0%；再现性相对标准偏差：滴定法≤2.0%，离子色谱法≤5.0%，分光光度法≤6.0%。检出限、定量限需满足本指南对应方法的要求，验证方法：连续测定11份空白样品，计算吸光度或峰面积的标准偏差SD，检出限LOD=3×SD/b（b为标准试剂质量控制：所有基准试剂必须在有效期内，标准储备液每6个月重新配制，标准工作溶液临用前配制，避免溴离子吸附容器壁造成浓度偏差。容器污染控制：所有玻璃容器必须用1+9硝酸溶液浸泡12小时以上，再用一级去离子水冲洗3次以上，烘干后使用，避免环境中的溴化物污染样品。测定高浓度样品后，必须对容器充分清洗，再进行下一个样品处理。滴定法偏差控制：铬酸钾指示剂浓度必须准确，浓度过高会造成终点提前，浓度过低会造成终点滞后，本指南规定100mL滴定溶液中加入1mL50g/L铬酸钾为最佳浓度；滴定过程必须匀速摇动，避免局部硝酸银过量造成终点误判；样品pH必须控制在6.5~10.5之间，酸性条件下铬酸根会转化为重铬酸根，碱性条件下银离子会生成氧化银沉淀，均会造成结果偏差。离子色谱法偏差控制：淋