生物制品支原体检查指南（试行）

生物制品支原体检查指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗、重组治疗性蛋白制品、细胞治疗产品、基因治疗产品、血液制品等生物制品的生产用原辅材料（包括细胞基质、动物血清、胰蛋白酶、细胞因子、基础培养基、补料培养基、一次性生产耗材浸出液）、细胞库检定（主细胞库、工作细胞库、极限代次细胞库）、生产过程中间品、原液、半成品及成品的支原体质量控制检查，同时适用于生产环境监控、工艺验证、污染溯源场景下的支原体检测。2基本要求2.1人员要求所有参与支原体检验的人员需经过生物安全、无菌操作、支原体检验专项培训，考核合格后方可上岗，每年需参加至少1次支原体检验能力验证并取得合格结果。检验人员需熟知支原体生物学特性、不同检验方法的原理与局限性、交叉污染防控要求，操作过程严格遵守无菌操作规范。2.2环境与设施支原体检验需在与常规微生物检验区物理分隔的独立区域开展，洁净度级别为C级背景下的A级单向流保护，生物安全防护等级不低于二级。检验区需设置独立的通风系统，压力为负压，避免气溶胶扩散。不同检验方法的操作需分区：培养法与指示细胞培养法共用制备区，核酸扩增法需设置独立的试剂准备区、样本处理区、扩增区、产物分析区，各区物品单向流转，不得交叉使用。2.3器具与试剂所有接触样本的可重复使用器具需经无支原体验证的灭菌程序处理：干热灭菌250℃≥30min或180℃≥2h，湿热灭菌121℃≥30min，每季度用支原体质控菌株验证灭菌效果。一次性耗材需选择取得无第三方支原体认证的产品，每批耗材抽样做支原体阴性验证。检验用试剂需在有效期内使用，每批新购入的培养基、核酸检测试剂盒需做适用性验证，符合要求后方可投入使用。涉及活支原体操作的试剂需专人管理，使用后高压灭菌处置。2.4样本采集与保存样本采集需在B+A级洁净环境下操作，避免外源性污染。不同类型样本采样量要求：细胞库/生产用细胞样本取培养上清≥10mL、细胞悬液≥5mL；血清/胰酶等原辅材料每批采样≥20mL；中间品/原液采样≥10mL；成品根据剂型采样，注射剂取不少于3支/瓶，总样本量≥5mL。样本保存需根据检验方法确定：用于培养法、指示细胞培养法的样本需2~8℃保存，24h内完成检验，若无法及时检验需置于-70℃保存，存放期限不超过7d，禁止反复冻融；用于核酸扩增法的样本可置于-70℃保存，存放期限不超过3个月，冻融次数不超过2次。所有样本需标注唯一标识，同步采集同批次空白采样基质作为阴性对照样本。3检验方法及操作规范3.1培养法（金标准方法）3.1.1方法原理支原体可在专用的富营养液体、固体培养基中生长，通过观察液体培养基的浑浊、pH变化，以及固体培养基上典型的“油煎蛋”样菌落形态，判定样本中是否存在活支原体。该方法为《中国药典》规定的法定放行检验方法，适用于细胞库检定、原辅材料入厂检验、核酸法阳性结果确证。3.1.2培养基与质控菌株培养基可选择商业化支原体专用培养基或自制培养基，每批培养基需做灵敏度验证：接种≤100CFU的肺炎支原体（ATCC15531）、口腔支原体（ATCC23714）、鸡毒支原体（ATCC15302）3种质控菌株，生长率≥90%方可使用。固体培养基琼脂浓度控制在0.8%~1.0%，适配支原体的低黏附生长特性。3.1.3操作步骤①样本前处理：含抗生素的样本需做1:10稀释或加入对应中和剂，如β-内酰胺酶中和青霉素、多粘菌素中和剂中和氨基糖苷类抗生素，中和后需做基质毒性验证，加入10~100CFU质控菌株的回收率≥70%方可进入下一步。含佐剂、细胞碎片的样本需3000r/min离心5min，取上清接种。②接种：每支10mL装液体培养基接种1mL样本，设置2支平行样本，同时接种阳性对照（1mL含10~100CFU质控菌株的基质液）、阴性对照（1mL空白采样基质）。③培养与传代：接种后的液体培养基置于36℃±1℃、5%~10%CO₂的潮湿环境（或烛缸）中培养7d，观察液体培养基的浑浊度、酚红指示剂变色情况；之后取0.1mL液体培养物涂布固体平板，同时接种1支新的液体培养基，继续培养14d。④观察：固体培养基培养7d、14d时分别用40~100倍低倍镜观察菌落形态。3.1.4结果判定阴性对照无任何微生物生长、阳性对照固体培养基出现典型“油煎蛋”样菌落（直径10~100μm，中心致密嵌入培养基，边缘透明薄平）、液体培养基出现符合支原体生长的浑浊或pH变化时，实验有效：样本组液体培养基无异常变化、固体培养基无可疑菌落，判定为支原体阴性；样本组出现可疑菌落，需挑取菌落纯化后做生化鉴定（精氨酸分解、葡萄糖发酵试验）或核酸测序确证，确认为支原体的判定为阳性。3.1.5注意事项支原体菌落易与L型细菌菌落混淆，需通过传代确认：L型细菌传代后可恢复原有细菌形态，支原体传代后仍保持典型油煎蛋形态。0.22μm滤膜无法完全截留粒径0.2~0.3μm的支原体，所有过滤除菌的培养基需经过支原体检验后方可使用。3.2指示细胞染色法3.2.1方法原理利用DNA特异性荧光染料Hoechst33258与支原体核酸结合的特性，支原体污染的指示细胞经染色后，可在细胞质、细胞间隙观察到针尖状亮蓝色荧光信号，以此判定样本中是否存在活的细胞嗜性支原体。该方法检测周期短于培养法，适用于生产过程中间品监控、细胞培养收获液检验。3.2.2试剂与材料指示细胞选择无支原体污染的Vero细胞或3T3细胞，每批指示细胞使用前需做支原体阴性验证。Hoechst33258工作液浓度为1μg/mL，现配现用。3.2.3操作步骤①指示细胞接种：将指示细胞以1×10⁴个/cm²的密度接种于铺有盖玻片的6孔细胞培养板，置于37℃±1℃、5%CO₂环境中培养24h，待细胞贴壁率达到60%以上。②样本接种：每孔加入1mL处理后的样本，同时设置阳性对照（1mL含10~100CFU猪鼻支原体ATCC25021的细胞培养基）、阴性对照（1mL无支原体的细胞培养基），继续培养3~5d，待细胞汇合度达到80%~90%。③染色观察：弃去培养上清，用PBS洗涤2次，加入甲醇固定10min，弃去甲醇后加入Hoechst33258工作液，避光染色10min，PBS洗涤后用荧光显微镜观察，激发波长340~380nm，发射波长430~480nm。3.2.4结果判定阴性对照仅细胞核呈现均匀蓝色荧光、细胞质与细胞间隙无荧光信号，阳性对照细胞质与细胞间隙出现大量针尖状亮蓝色荧光信号时，实验有效：样本组无异常荧光信号，判定为阴性；样本组出现与阳性对照一致的荧光信号，判定为阳性。3.2.5注意事项需注意区分死细胞碎片的非特异性荧光：支原体荧光信号为均匀针尖状，分散于细胞质或细胞间隙，死细胞碎片荧光信号形态不规则、亮度不均。若样本存在细胞毒性导致指示细胞死亡，需将样本稀释后重新接种，或更换耐受性更强的指示细胞。3.3核酸扩增检测法3.3.1方法原理与分类通过扩增支原体高度保守的16SrRNA基因片段，实现支原体的定性/定量检测，包括普通PCR、荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）三类。该方法检测周期短（4~8h）、灵敏度高，适用于生产过程在线监控、紧急放行补充检验，需经过方法学验证与法定方法比对确认后方可用于放行检验。3.3.2方法学验证要求用于放行检验的核酸扩增法需完成以下验证：①特异性：可准确检测至少10种常见支原体（肺炎支原体、口腔支原体、发酵支原体、猪鼻支原体、鸡毒支原体、精氨酸支原体、唾液支原体、人型支原体、穿通支原体、解脲脲原体），与细菌、真菌、人/动物源细胞基因组无交叉反应；②检测限：≤10CFU/mL或≤100拷贝/mL，低浓度样本（10CFU/mL）的阳性检出率≥95%；③耐用性：操作人员、试剂批号、仪器型号发生小范围变动时，检测结果变异系数≤20%；④回收率：空白基质中加入10~100CFU/mL支原体的回收率为50%~150%。3.3.3操作步骤①核酸提取：选择经过验证的支原体核酸提取试剂盒，每样本加入全程内标（已知浓度的假病毒核酸），监测提取效率与PCR抑制情况，提取后的核酸需立即扩增或置于-20℃保存不超过24h。②扩增体系：20~50μL体系包含支原体特异性引物/探针、热启动Taq酶、dNTP、UNG酶、缓冲液，引物针对支原体16SrRNA基因保守区设计，覆盖98%以上的常见致病支原体。③扩增程序：预变性95℃3min，之后95℃15s、60℃30s，共40个循环，qPCR/dPCR在退火延伸阶段收集荧光信号。④对照设置：每次实验需设置空白对照（无核酸酶水）、阳性对照（含10~100拷贝的支原体阳性质粒）、基质对照（无支原体的同类型样本基质）。3.3.4结果判定空白对照无扩增、阳性对照Ct值在标定范围内、全程内标Ct值变异系数≤5%时，实验有效：样本无扩增曲线，判定为阴性；样本Ct值≤38，判定为阳性；样本Ct值38~40，需重复提取扩增，重复实验仍有扩增的判定为阳性，无扩增的判定为阴性。若样本全程内标无扩增，说明存在PCR抑制物，需将样本稀释后重新提取扩增。3.3.5污染防控要求每次实验结束后用0.1%次氯酸钠擦拭台面、75%乙醇擦拭仪器，各区紫外照射30min以上。UNG酶需加入扩增体系，防止扩增产物残留导致的假阳性。每季度开展一次环境气溶胶监控，用咽拭子擦拭台面、门把手、移液器表面，检测支原体残留。若需区分死活支原体，可在核酸提取前用10μmol/L叠氮溴化丙锭（PMA）处理样本，避光孵育10min后强光照射5min，共价结合死支原体的DNA阻断其扩增。4检验方法适用性验证所有用于放行检验的方法需在首次使用前、检验样本类型发生变更、生产工艺变更影响样本基质时开展适用性验证：4.1通用验证指标包括特异性、检测限、重复性、耐用性、回收率，需符合《中国药典》生物制品检验方法验证指导原则的要求。4.2不同方法的特殊验证要求培养法需验证样本中抑菌成分的中和效率，中和后质控菌株生长率≥70%；指示细胞培养法需验证样本的细胞毒性，最大耐受稀释度下指示细胞存活率≥80%；核酸扩增法需开展至少3批不同批次基质的交叉验证，低浓度样本阳性检出率≥95%。5阳性结果处置与溯源5.1实验室污染排查检出支原体阳性后立即暂停检验，首先排查实验室污染：检测当次阴性对照、环境拭子、试剂空白，若存在支原体污染，所有样本作废，对实验室彻底消毒后重新采样检验；若实验室相关对照均为阴性，判定为样本本身阳性，24h内上报质量部门与生产部门。5.2生产端溯源调查启动三级溯源流程：第一级排查原辅材料，追溯同批次血清、胰酶、细胞种子的支原体检验记录，抽样复检；第二级排查生产环境，检测洁净区空气沉降菌、人员表面、设备接触面、纯化水系统的支原体；第三级排查生产工艺，验证无菌操作流程、一次性耗材密封性、跨批次产品交叉污染防控措施的有效性。5.3污染消除与恢复所有污染的样本、培养物、中间品需经121℃30min高压灭菌后处置。生产区用1%次氯酸钠擦拭接触面、过氧乙酸熏蒸消毒，连续3次环境支原体检测阴性后方可恢复生产。污染涉及的批次产品全部报废，同步开展支原体去除工艺验证，新增的纳滤、低pH孵放、层析等工艺的支原体去除效率需≥4log值，验证合格后方可重启生产。6记录与报告管理所有检验原始记录需包含样本信息（名称、批号、采样日期、采样人、样本量）、检验信息（方法名称、培养基/试剂盒批号、质控菌株编号、培养/扩增参数、对照结果、样本结果）、检验人员与复核人员签字，记录保存期限不少于产品有效期后1年，且不少于5年，符合GMP存档要求。检验报告需明确标注检验方法、检验结果、是否符合标准，若为核酸法阳性需标注“需培养法确证”的备注。7特殊样本检验要求7.1