DNA甲基化样本处理及检测技术专家共识总结2026

DNA甲基化样本处理及检测技术专家共识总结2026DNA甲基化是人类常见和重要的表观遗传学修饰之一，在人体多种生理与病理过程中发挥着重要作用，作为新型疾病标志物展现出了巨大潜力。DNA甲基化检测涉及的样本类型多样、过程复杂，其检测流程尚缺乏统一标准。因此，建立DNA甲基化样本处理及检测技术共识，对推动该领域技术开发、临床转化和应用具有重要价值。本共识由中国中西医结合学会检验医学专业委员会、中华医学会检验医学分会分子诊断学组、北京中西医结合学会精准医学专业委员会共同编写，汇聚了来自检验医学、病理学等多个相关领域专家的观点和经验，详细阐述了DNA甲基化的定义、样本的采集和前处理、核酸提取和转化、甲基化检测、结果报告等要点，并从中凝练出14条共识意见。作为一种主要的表观遗传学修饰，DNA甲基化（methylation）可在不改变DNA序列的前提下调控基因表达

［

1,2］

。DNA甲基化在发育、衰老等多种正常生物学过程中发挥重要作用。DNA甲基化紊乱与癌症、神经退行性疾病、自身免疫性疾病等多种疾病的发生发展密切相关

［

3,4］

。其中，DNA甲基化异常是癌症发生的重要诱因之一。癌症相关DNA高甲基化现象主要发生在基因启动子区域CpG岛，癌症相关DNA低甲基化则表现为基因组范围内甲基化水平广泛性降低。鉴于DNA甲基化水平变化具有早期改变、动态可逆、相对稳定的优势

［

5］

，其作为新型生物标志物具有巨大潜力。目前，DNA甲基化检测已可实现对多种疾病的筛查与诊断，尤其在肿瘤的早期筛查、临床诊断、复发监测与疗效评估中得到了最为广泛的应用

［

6］

。近年来，国内甲基化检测领域已陆续发布多部权威共识，为临床规范化应用提供了重要指导。其中，中华医学会检验医学分会发布了《血液游离DNA甲基化肿瘤标志物实验室检测与临床应用专家共识（2025版）》

［

7］

，重点针对游离DNA（cell-freeDNA，cfDNA）甲基化检测的实验室标准化流程提出了系统要求；中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会亦发布了《肿瘤DNA甲基化标志物检测及临床应用专家共识（2024版）》

［

8］

，对肿瘤甲基化标志物的筛选、验证及临床应用路径进行了全面规范。此外，针对宫颈癌这一特定癌种和特定靶标，中国中西医结合学会检验医学专业委员会等机构也发布了关于甲基化检测的《子宫颈癌PAX1联合JAM3双基因甲基化检测流程、报告及临床应用专家共识》

［

9］

，进一步细化了临床操作与报告规范。尽管已有多部共识为临床提供了框架，但因DNA甲基化的检测涉及样本采集、处理、核酸提取、转化处理、扩增检测及结果报告等多个复杂环节，不同临床实验室在检测平台、方法学、质量控制及结果解读方面存在显著差异，影响检测结果互认，DNA甲基化样本处理和检测技术环节尚未形成统一规范。为进一步规范DNA甲基化检测流程，提升检测质量，保障临床应用的准确性与可靠性，中国中西医结合学会检验医学专业委员会、中华医学会检验医学分会分子诊断学组、北京中西医结合学会精准医学专业委员会等领域专家结合国内外新近研究进展、行业指南及我国实验室实际情况，围绕DNA甲基化检测的全流程管理，共同起草本共识，提出具有可操作性的技术要求和质量控制建议，旨在为临床实验室开展DNA甲基化检测项目提供标准化指导意见，推动该技术在临床实践中的规范化应用，最终为患者提供精准的检测结果。制定方案一、共识发起机构与专家组成员本共识由中国中西医结合学会检验医学专业委员会、中华医学会检验医学分会分子诊断学组、北京中西医结合学会精准医学专业委员会牵头制定。2025年3月启动，经专家组多次讨论形成初稿，通过3次函询/专家研讨会，针对推荐意见进行投票评级，于2025年12月完成定稿。本共识专家组成员均提交了利益冲突声明表，不存在与本共识直接相关的利益冲突。二、使用者与应用的目标人群本共识适用于医疗机构的临床实验室、第三方检测实验室、生物技术公司或体外诊断企业、高校、科研院所等机构从事DNA甲基化检测产品研发与检测的医务工作者或科技人员等，旨在为DNA甲基化样本标准化处理及检测提供参考。三、基本框架构思与确定专家组通过会议讨论、函询等形式，明确了DNA甲基化检测的临床样本处理与检测技术领域的核心问题，经多次讨论与修改，最终就本领域的4个关键问题——甲基化检测样本采集与前处理、核酸提取与转化、甲基化检测、检测报告，形成了14条推荐意见。四、证据的检索与评价围绕最终以上四个关键问题，根据DNA甲基化检测所涉及的不同临床样本来源与检测技术进行梳理，检索美国PubMed数据库、美国WebofScience数据库、中国知网、万方数据知识服务平台及维普中文科技期刊数据库等文献数据库并整合国内外研究进展，最终选择155篇文献作为本共识的依据。本共识制定采用德尔菲法和共识会议法，首先梳理国内外相关文献、行业标准与临床实践数据，形成初步推荐意见条目；随后采用德尔菲法设计专家调查问卷，投票选项设置为同意、不确定、不同意，以有效投票同意率作为共识达成与推荐强度的判定依据：同意率>90%判定为强推荐，70%~90%判定为弱推荐，同意率<70%视为未达成共识，不纳入正式推荐意见。对首轮投票存在分歧的条目，进一步组织专家线上/线下专题会议集中研讨、充分交流意见并修订完善，最终形成统一共识条文。本共识证据质量评价采用国际通用的推荐分级的评估、制定与评价（gradesofrecommendation，assessment，development，andevaluation，GRADE），将证据分为4级：高，进一步研究几乎不可能改变效应估计的可信度；中，进一步研究可能影响效应估计可信度或改变结论；低，进一步研究极可能影响效应估计可信度且很可能改变结论；极低，对效应估计可信度严重不足，真实效应与现有估计可能存在明显差异。推荐强度分为强推荐、弱推荐两级。共识内容一、DNA甲基化的定义DNA甲基化过程通过以S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferases，DNMTs）的催化作用下，将甲基基团（CH

3）转移至DNA分子特定碱基位点，该过程可以发生在胞嘧啶的C5位、腺嘌呤的N6位以及鸟嘌呤的N7位。人类基因组约80%的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（cytosine-phosphate-guanine，CpG）二核苷酸序列会发生甲基化，其DNA甲基化过程主要由DNMT1、DNMT3a和DNMT3b催化，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）是最常见的甲基化修饰。除5mC外，人体细胞的甲基化修饰形式还包括5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC），5-甲酰胞嘧啶（5-formylcytosine，5fC）和5-羧基胞嘧啶（5-carboxylcytosine，5caC），5hmC/5fC/5caC均为5mC去甲基化过程的中间物，研究表明这三者在胚胎发育、肿瘤微环境中具有潜在研究价值

［

10,11］

，但与疾病发生发展的因果关系以及对临床诊疗的应用价值尚未得到大样本临床研究的证实，因而其临床应用场景尚待探索、临床意义解读缺乏共识性依据。同时，这些衍生修饰在细胞内的含量极低：5hmC在多数组织中约为5mC的万分之一至千分之一（神经元中5hmC显著升高，可占胞嘧啶总量的0.4%~0.7%），5fC与5caC比5hmC低100~1000倍

［

12,13］

，缺乏适用于临床常规应用的标准化检测技术。基于上述背景，为确保本共识的临床针对性、实用性及证据可靠性，避免因修饰类型界定模糊导致解读偏差，本共识中所提及的“DNA甲基化”特指DNA中5mC修饰。5hmC/5fC/5caC等衍生修饰与疾病的相关性仍处于研究与数据积累阶段，尚缺乏成熟标志物，以及标准化的检测手段，暂不纳入本共识的讨论范畴。未来，随着临床研究证据的积累与临床检测技术（例如：单分子测序技术）的突破，共识范围可以得到进一步拓展，本共识将及时修订和更新，从而实现对各类甲基化修饰的全面临床应用指导。二、样本采集与前处理DNA甲基化检测可采用的样本类型包括组织、血液、尿液、痰液、肺泡灌洗液、粪便、分泌物等

［

14,15］

。疾病的不同病程阶段显著影响样本甲基化标志物的含量，例如：癌症早期患者体液样本中的甲基化标志物通常是痕量水平的

［

16,17,18］

，亚硫酸氢盐的化学转化步骤会导致DNA发生降解和片段化

［

19,20］

。以上因素会较大程度影响DNA甲基化检测技术的性能。因此，DNA甲基化检测对于样本的采集和前处理要求较高。针对特定检测项目，样本的采集及前处理过程均需遵循相应产品说明书的要求，并在本实验室建立严格的操作规程。影响机体甲基化水平的药物会干扰甲基化检测的结果。例如：受检者在检测前服用去甲基化药物（例如：阿扎胞苷等）会造成体内DNA甲基化水平降低

［

21］

，故在采集前宜明确受检者的用药情况，避免采集此类样本。（一）血液样本血液样本主要用于提取cfDNA，以进行非侵入性DNA甲基化检测。此外，全血样本基因组DNA也可用于DNA甲基化检测，其采集与处理过程与常规基因检测通用。本部分内容主要就cfDNA检测时血液标本的采集与处理进行规范。1.样本类型选择：血浆与血清均可作为cfDNA的来源。研究发现，尽管血清中cfDNA含量高于血浆，但其产量不稳定

［

22］

；同时，由于凝血过程中会发生细胞破裂，血清中所提取的cfDNA受核基因组DNA污染的风险较高。相比之下，血浆cfDNA产量更加稳定，被核基因组DNA污染的可能性较小，被推荐应用于cfDNA甲基化检测

［

23,24］

。2.样本量：循环cfDNA甲基化检测首先需要提取到足量的cfDNA，一般来说，血液样本量越大，从分离血浆中获得的cfDNA产量越高。目前，肿瘤相关的cfDNA甲基化检测项目通常推荐采集8~10ml外周全血，并从中分离3~4ml血浆用于后续检测

［

25,26］

。必要时，应根据检测方法的原理以及灵敏度要求调整样本量，以提升微量靶点检出率。3.血液抗凝剂的选择：抗凝剂能够通过抑制血凝块形成防止细胞破裂，避免核基因组DNA污染cfDNA。最广泛使用的血液抗凝剂包括乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、肝素和柠檬酸葡萄糖溶液（acid-citratedextrose，ACD）

［

27］

。研究表明肝素可对定量PCR（quantitativePCR，qPCR）产生剂量依赖性干扰

［

28］

。EDTA和ACD能够通过抑制DNA酶活性来保持cfDNA的稳定性，因而更适用于甲基化检测

［

29］

。目前，EDTA仍然是临床检验与研究中最为常用的抗凝剂，血液采集中常使用K

2EDTA真空采血管。4.样本质量控制：血液样本发生溶血时释放的各类酶等物质可干扰PCR反应，破碎细胞释放出的细胞基因组DNA也会对cfDNA造成污染，因此进行cfDNA甲基化检测时应严格避免溶血。除溶血外，黄疸样本可呈现黄色或黄绿色，脂血分离的血浆可呈现浑浊性状，此类样本会对cfDNA的提取效率产生影响，使其产量明显降低

［

30］

。建议应在血液离心后观察血浆颜色和性状，并拒绝接收溶血、黄色/黄绿色或不透明的血浆样本

［

31,32］

。5.血浆分离及保存：首先，血浆分离宜尽快在4h内完成。新鲜采集的血液在普通EDTA管中储存超过4h会使血浆中核基因组DNA含量显著升高

［

33,34,35,36］

；在cfDNA专用采血管中储存能够防止细胞破裂，采血后可无需立即处理，可室温下稳定保存2~14d不等（因不同采血管品牌而异）直至离心，且cfDNA质量不受影响

［

37,38,39,40］

。血浆离心方法可能对cfDNA产量与质量造成影响，一些研究推荐采用两次不同转速的离心过程分离血浆，即初始低速离心（800~1900×

g，10min）用于沉淀血细胞，随后进行高速离心（14000~16000×

g，10min）以清除残留细胞碎片并提高cfDNA纯度

［

41,42］

。另一些研究推荐采用两次等转速的低速离心（例如：1600×

g，10min）分离血浆

［

43］

。对于需要高纯度cfDNA的应用（例如：甲基化测序）或低丰度循环肿瘤DNA检测，推荐采用低速加高速两次离心的方案，可有效去除细胞碎片与基因组DNA污染

［

44］

；对基于PCR的甲基化检测［例如：甲基化特异性PCR（methylationspecificPCR，MSP）、甲基化荧光定量PCR（也称MethyLight）］，两次等速低速离心在质控合格前提下亦可满足临床检测要求。将离心得到的上层血浆转移到保存管中，转移时应避免吸取到细胞层，否则将导致细胞基因组DNA污染cfDNA。保存管中的血浆如不能在短时间内用于检测，应于-20℃或-80℃保存，并尽量减少冻融次数。专家共识意见1：血液标本的cfDNA得率受到样本量、样本类型、采集管、样本质量、离心处理方法影响较大，实验室应根据项目要求及实地情况制定并严格遵循样本采集和处理的标准化操作规程。常规建议采集8~10ml外周血分离血浆用于cfDNA甲基化检测。建议采用EDTA抗凝管进行样本采集并尽快（4h内）离心分离血浆；如采血后无法在4h内离心，建议使用cfDNA专用采血管采集和保存血液样本。溶血、黄疸和脂血样本应被视为不合格样本，如遇此类样本，宜立即联系临床进行重新采样。分离得到的血浆应尽快进行检测，短时间无法检测应于-20℃或-80℃保存（证据等级：高，推荐等级：强推荐）。尿液样本尿液是泌尿系统肿瘤无创检测的重要样本来源。尿液中的脱落肿瘤细胞DNA以及cfDNA对包括膀胱癌在内的尿路上皮癌等恶性肿瘤的早期诊断具有重要的临床价值。1.样本类型选择：采用不同方法处理尿液所获取的DNA来源不同。尿液中既含有细胞来源的DNA，也含有cfDNA

［

45,46］

。通过离心方法以及免疫捕获或过滤方法获得脱落细胞，可用于提取细胞来源的DNA

［

47,48,49,50,51,52］

。通过离心获得的尿上清液，可用于提取cfDNA

［

53］

。目前，已商品化的肿瘤相关尿液甲基化检测产品主要采用尿沉渣样本提取脱落细胞来源的DNA进行检测。需要注意的是，离心获得的尿沉渣中既包含肿瘤细胞也包含正常细胞，因此存在肿瘤细胞DNA被正常细胞基因组稀释的可能，导致假阴性。尿液沉淀中的特定成分可能对于下游PCR反应存在抑制作用

［

54］

。2.样本量：基于尿液的甲基化检测项目通常需要对50~100ml尿液进行离心以获得足量的尿沉渣

［

55,56］

，离心过程需要采用大型离心设备，因而会降低检测通量和效率，建议在保证检测准确性的同时选择效率更高的技术。部分技术可采用1~2ml尿液实现对尿路上皮癌的精准诊断，其处理过程不进行尿液离心，核酸来源于脱落细胞与cfDNA，检测方式比较便捷，但对标志物的性能、DNA提取效率要求较高

［

45,46］

。3.样本质量控制：采用尿液样本进行DNA甲基化检测前，应对尿液样本进行质量控制，避免其中混入血液和粪便等非尿液成分，女性应避免生理期采样。推荐采集晨尿以获得足够的脱落细胞。4.样本保存：室温条件下的尿液易受到微生物污染，如果采样后不能立即处理，推荐加入保存剂。研究推荐采用终浓度为40mmol/L的EDTA作为保存剂

［

57］

，尿液中的DNA可在室温下稳定保存7d

［

58,59］

，可在4℃稳定保存7d

［

60,61］

。此外，建议使用抑菌剂来抑制样本中的潜在细菌污染

［

59］

。加入了保存剂和抑菌剂的尿液样本可实现常温运输，但其常温保存运输时限应严格遵循操作规程要求。尿液样本若短时间内不能进行DNA提取，宜保存于低温环境。有研究显示将尿液DNA置于-20℃或-80℃下28d，无论是否添加EDTA保存剂，人源DNA均能得到有效保存

［

59］

，但也有研究显示尿液DNA在-20℃温度下放置28d，人源DNA会显著降解

［

60］

。因此，具体保存温度和时限应遵循说明书要求并经实验室内部验证。专家共识意见2：建议采集晨尿进行检测，尿液样本应避免非尿液成分与微生物污染，女性应避免生理期采样。建议采用含有EDTA和抑菌剂的保存液储存尿液样本（证据等级：高，推荐等级：强推荐）。（三）粪便样本粪便样本含有丰富的消化道上皮脱落细胞，在结直肠癌早期筛查及辅助诊断中具有关键应用价值。采用粪便提取核酸检测结直肠癌甲基化标志物面临多重挑战。首先，粪便中的DNA主要来源于细菌，结肠黏膜脱落细胞的DNA仅占粪便回收总DNA的0.01%~0.1%

［

62］

。其中，肿瘤细胞仅占脱落细胞的1%，在肿瘤早期阶段其数量更少

［

62,63］

。因此，从粪便中稳定提取尽可能多的人类基因组DNA，同时确保将非人类基因组DNA背景控制在较低水平，是提高结直肠癌筛查相关DNA甲基化检测灵敏度和特异度最为关键的环节

［

58］

。粪便中存在的抑制物可干扰下游PCR反应。例如：某粪便甲基化检测技术要求受检者在取样前1~2d必须停用干扰下游反应的药物（例如：盐酸小檗碱等）

［

64］

。因此，粪便采集需要严格遵循相关项目说明书要求，如产品说明书与共识建议存在冲突，应以产品说明书为准，并经实验室验证后执行。1.样本类型的选择：有研究比较了不同粪便制备方法对核酸提取及检测结果的影响

［

65］

，包括固体粪便、固体粪便与保存液混合后的均质化粪便上清、固体粪便与保存液混合后的均质化粪便的沉渣。结果显示，使用均质化粪便上清时甲基化检测结果可重复性以及人源DNA占比最优

［

65］

。因此，建议使用均质化的粪便上清作为检测样本。2.样本量：现有基于粪便的DNA甲基化检测根据项目不同需要采集质量在0.8~15.0g不等的粪便样本。粪便须遵循产品说明书与保存液按规定比例混合重悬，离心取上清。离心参数须根据说明书要求设置，可采用低速离心（例如：4200r/min，30min或5000r/min，10min）或高速离心方案（例如：12000r/min，2~3min）

［

64,65,66］

，即制成均质化粪便悬液，检测过程需要使用1.8至数十毫升不等体积的粪便悬液

［

64，67,68,69］

。对于样本量需求较大的项目，为获取均质化的粪便上清需要使用大型离心设备，会降低检测通量和检测效率。建议在保证检测准确性的同时选择检测效率更高的技术。3.样本质量控制：采用粪便样本进行甲基化检测前，应对样本量和性状进行质量控制。样本过多或过少、水样便、黏液便或混入了其他非粪便成分的样本均应被视为不合格样本，须重新采样。4.样本保存：为防止细菌DNA酶破坏粪便样本中的人类DNA，应使用Tris-EDTA缓冲液避免DNA大量降解，还能够稀释粪便来源的PCR抑制剂，有效降低其对后续扩增反应的干扰

［

70,71,72］

。此外，应同时加入抑菌剂以抑制细菌滋生。加入了缓冲液和抑菌剂的粪便样本通常可实现常温运输，其常温保存运输时限应严格遵循操作规程要求。粪便样本若短时间内不能进行DNA提取，应保存于-20℃或-80℃，并尽量减少冻融次数。专家共识意见3：建议采用均质化的粪便上清作为甲基化检测样本类型。粪便样本过多或过少、水样便、黏液便或混入了其他非粪便成分的样本均应被视为不合格样本。粪便样本采集后应立即保存在含有EDTA和抑菌剂的专用保存液中（证据等级：高，推荐等级：强推荐）。（四）组织样本组织样本作为肿瘤分子病理检测的金标准材料，能够提供最完整的肿瘤基因组学和表观遗传学信息，在实体瘤原发灶诊断、分子分型和治疗靶点检测中具有不可替代的价值。组织样本的采集和保存：为确保组织中的DNA质量，手术或活检获得的新鲜组织应在离体30min内置于预冷DNA稳定保存液或以液氮速冻，长期保存应置于-80℃以下；石蜡包埋组织样本建议选择1年内制备的蜡块，切片厚度8~10μm

［

73］

。为确保获取足够的肿瘤细胞，开展检测前应在病理医师指导下选取肿瘤细胞富集区域，避开坏死、黏液和炎性改变区域。专家共识意见4：新鲜组织应在离体30min内置于预冷DNA稳定保存液或液氮中速冻，长期保存需-80℃以下。石蜡包埋组织样本应选择1年内制备的蜡块，建议在病理医师指导下选取肿瘤细胞富集区域进行检测（证据等级：高，推荐等级：强推荐）。（五）体液与分泌物样本临床常用于甲基化检测的体液与分泌物标本包括胸腹水、脑脊液、肺泡灌洗液、痰液、宫颈分泌物等，此类标本均含有脱落细胞DNA或cfDNA。体液与分泌物样本的采集和前处理：应使用专用防污染采集器采集晨起深部痰液，采集后立即置于含DNA保护液的采样管中，经黏液溶解剂处理并离心以去除黏液成分，沉淀物采用蛋白酶K和二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）联合消化用于DNA提取。肺泡灌洗液需在支气管镜引导下灌注生理盐水收集，如果肺泡灌洗液中含较多血液，可先对样本进行抗凝处理，随后可通过离心收集脱落细胞用于DNA提取，或参考血液样本处理方式，离心后取上清用于cfDNA提取

［

74,75］

。当前临床实践中，胸腹水、脑脊液等体液标本的甲基化检测需求日益增加，其前处理原理（离心富集细胞或上清提取cfDNA）与肺泡灌洗液相似

［

76,77］

。采集宫颈分泌物应采用专用采样刷在宫颈转化区（鳞柱交界区）旋转获取细胞，保存于具有核酸稳定效果的细胞保存液中（例如：含EDTA的保存液），离心收集脱落细胞用于DNA提取。专家共识意见5：痰液样本应采用晨起深部痰液。肺泡灌洗液、胸腹水、脑脊液样本中若含有较多血液，需要对样本进行抗凝处理。采集宫颈分泌物应采用专用采样刷在宫颈转化区（鳞柱交界区）旋转采集细胞（证据等级：中，推荐等级：强推荐）。三、核酸提取和转化（一）核酸提取样本类型和质量直接决定了核酸的含量与质量，因而需要相应的核酸提取与富集方法。应根据不同的样本类型和检测项目采用适当的或项目说明书中所声明的提取方法。如产品说明书与共识建议存在冲突，应以产品说明书为准，并经实验室验证后执行。在使用前应全面评估提取方法的有效性和可重复性，同时应考虑研究目的和临床需求，权衡每种方法的优势和局限性，以实现最佳结果。高效的提取方法应具备简单、快速、稳定的特点，同时最好兼顾自动化，以确保提取的基因组DNA或cfDNA具有稳定的得率和较高的质量。临床中最常用的提取方法包括乙醇沉淀法、硅胶膜吸附柱法和磁珠法。乙醇沉淀法成本低，但耗时较长，且回收率偏低；硅胶膜吸附柱法实验流程简单，操作快速，适用于手工提取

［

74,75］

。磁珠法能匹配核酸提取仪进行自动化提取，提取产物纯度高、质量稳定，能够减少批次间差异，且可以处理大批量样本。此外，通过将特异性探针连接到磁珠上，特异性地捕获提取目的基因，可减少非目的基因的干扰。为避免基因组DNA的污染，提取纯化cfDNA与基因组DNA的处理区域应物理分开

［

78］

。对提取DNA的浓度和质量的评估通常可以采用Nanodrop分光光度计、Qubit荧光定量仪、DNA片段分析仪等常规方法。cfDNA在血清、血浆、脑脊液、粪便、尿液、唾液、胸水、腹水和肺泡灌洗液等样本中广泛存在

［

79］

，但含量普遍极低、个体间差异大、片段化严重

［

80,81］

，健康人血液cfDNA浓度可在1~100ng/ml范围内

［

82,83］

，癌症患者循环cfDNA浓度范围可在数ng/ml至数千ng/ml之间

［

23］

，鉴于癌症患者cfDNA浓度范围区间较大，可使用健康人cfDNA浓度初步评估核酸提取效果，若健康人cfDNA浓度偏高，则提示结果可能存在异常。另外，DNA片段分析能够反映提取cfDNA的质量，理想的片段长度应呈现约146~166bp的主峰。片段长度增大主要因白细胞基因组DNA释放导致，可通过qPCR法检测扩增片段长度<80bp和>250bp的DNA含量进行分析前质量控制。正常情况下健康个体DNA片段>250bp/<80bp的比值范围为0.3~0.8，该比值升高提示存在细胞基因组污染，比值降低提示cfDNA降解

［

84］

。尿液cfDNA呈现与循环cfDNA不同的片段化模式，其中大部分片段较短（80~112bp）

［

85］

。专家共识意见6：进行DNA甲基化检测时，推荐采用基于磁珠法的DNA提取方法。建议通过DNA浓度和片段大小分析对提取到的DNA进行质量控制（证据等级：中，推荐等级：强推荐）。（二）甲基化转化常用的甲基化检测技术通常需要基于甲基化转化后的DNA序列开展，甲基化转化是通过一定的处理，将甲基化和未甲基化的DNA转化成不同的序列，从而实现二者的区分。主流的DNA甲基化转化技术包括基于化学处理的亚硫酸氢盐转化和基于酶促反应的酶法转化。基于甲基化敏感性限制性内切酶（methylation-sensitiverestrictionendonuclease，MSRE）-PCR法的甲基化检测技术则不需要对DNA模板进行转化处理。1.亚硫酸氢盐转化法亚硫酸氢盐转化法是甲基化检测的金标准预处理方法，转化效率通常在99%以上，效率高、速度快。不过，该方法同时存在DNA片段化严重、转化后序列复杂性降低（未甲基化的C占大多数且全部转化为T，序列复杂度降低不利于后续引物探针设计）的缺点

［

86,87］

。亚硫酸氢盐转化法的效率与DNA投入量、序列复杂程度、GC含量等因素密不可分，DNA模板量过高、序列GC含量高以及复杂的二级结构易导致转化不完全

［

88,89,90］

，使用时需要根据项目的实际情况选择合适的转化方案以保证转化效率。可通过荧光定量PCR检测LambdaDNA中未甲基化C的转化率评估亚硫酸氢盐转化法的转化效率。常规的亚硫酸氢盐转化法需耗时数小时，近年来新报道的超快速转化法是在常规亚硫酸氢盐转化法基础上通过优化盐离子体系将转化反应缩短到5~10min

［

91］

，最终使整个转化实验在30min内完成，但该方法的长期稳定性有待确认，目前仍缺少大规模的应用验证研究。实际应用中，亚硫酸氢盐转化实验的各步骤均需要严格控制：亚硫酸氢盐转化液的质量非常关键，因其对氧气较为敏感，活性成分易被氧化失效，开封后应尽快使用，未用完的残液不建议留存使用，以确保转化效率；长时间高浓度亚硫酸氢盐处理、严苛的pH环境均可能导致DNA降解，进而降低转化产物得率，因此建议在预实验阶段系统优化反应条件，以实现转化效率、DNA降解程度与特异性转化产物产量之间的平衡。同时，亚硫酸氢盐转化产物的脱磺、纯化过程不充分可能导致下游PCR实验失败。在有条件且性能验证通过的前提下，建议采用磁珠法结合自动化仪器完成此过程。2.酶促转化法：目前主流的酶促转化法大致分成两类大类，反向酶法转化［例如：酶法甲基化测序（enzymaticmethylsequencing，EM-seq）

［

92］

］和正向酶法转化法［例如：TET辅助吡啶硼烷测序（TET-assistedpyridineboranesequencing，TAPS）

［

93］

］。反向转化是将非甲基化的C转化为U，甲基化的C保持不变，正向转化是将甲基化的C转化为U，非甲基化的C保持不变。和化学法相比，酶促法相对温和，对DNA的损伤更小，转化效率与亚硫酸氢盐转化法相当，均能达到99%以上

［

92，94］

。酶促转化法的转化效率可通过荧光定量PCR或者测序法检测DNA中未甲基化C或者甲基化C的转化率进行评估。与亚硫酸氢盐转化法相比，酶促转化法产生的DNA片段更长，序列复杂性更高，但研究显示其回收率可能会显著低于亚硫酸氢盐转化

［

86,87］

。此外，酶促转化法所用的酶和试剂对保存和运输条件要求苛刻，转化效率易受保存和使用条件影响，操作流程繁琐且耗时更长，因此该方法还需要进一步地优化升级。专家共识意见7：DNA转化效果直接影响检测结果的可靠性，实验室应根据待处理DNA的情况制定并严格遵循DNA转化步骤的标准化操作规程。推荐使用目前最为成熟、稳定的预处理方法——亚硫酸氢盐转化法（证据等级：高，推荐等级：强推荐）。（三）质控品设置原则DNA甲基化检测流程相对复杂，涉及了核酸提取、转化、PCR扩增检测、建库测序等环节，因此质控品设置非常重要，然而目前尚缺乏共识。提取质控监控核酸提取质量，保障DNA得率、纯度与完整性，满足后续实验要求。转化质控可监测转化效率，避免转化过度和转化不完全，亚硫酸氢盐/酶促转化环节需设置甲基化质控品（确保转化完全）与未甲基化质控品（确保无过度转化），可采用商品化的完全甲基化与未甲基化标准品作为质控品，也可采用实验室自制的经严格质控与有效性验证的质控品。检测质控（阳性质控、阴性质控、空白对照质控）确保仪器状态正常、扩增效率正常、检测信号线性和结果重复性合格。建议根据具体检测技术对全流程设置严格阴性与阳性质控品，贯穿各环节，从而监测整个过程的实验质量，质控品的失控或缺失应直接判定实验无效。四、甲基化检测（一）检测方法1.甲基化特异性PCR（methylationspecificPCR，MSP）甲基化特异性PCR实验设计简单、快速，能够定性检测基因上任意一组CpG位点的DNA甲基化状态。其针对亚硫酸氢盐转化后的DNA序列，采用两对特异性引物，引物序列内至少涵盖一个或多个CpG二核苷酸，一对引物匹配发生甲基化的序列（M引物），另一对引物匹配未发生甲基化的序列（U引物），在两个反应体系中分别扩增相应甲基化与未甲基化DNA序列

［

95,96］

。传统的MSP法在PCR结束后采用琼脂糖电泳定性分析扩增产物，使用M引物扩增出PCR产物表明存在甲基化DNA片段，而使用U引物扩增出PCR产物则表明存在未甲基化DNA片段；为达到半定量目的，MSP法可结合荧光染料（例如：SYBRGreen）通过直接读取PCR反应过程中的荧光值与Ct值来计算甲基化水平，也称为qMSP法。目前，MSP法主要用于科研和样本初筛，在临床诊断上应用较少，一方面因为MSP法只能半定量或定性检测甲基化状态，另一方面MSP法易由于引物错配等原因产生假阳性或假阴性结果，尤其当其应用于福尔马林固定、石蜡包埋组织样本

［

97,98］

。2.甲基化荧光定量PCR（也称MethyLight）与MSP法相比，同样基于亚硫酸氢盐转化后DNA序列进行检测的甲基化荧光定量PCR（MethyLight）法是一种适用于分子诊断的甲基化检测技术

［

99］

，目前已广泛应用于多种癌症的临床筛查与诊断，包括结直肠癌、肝癌、胃癌、肺癌等

［

100,101,102,103］

。该方法适用于CpG岛特定甲基化位点/区域的检测，需要针对转化后的靶基因设计包含甲基化位点的特异性引物对以及能够特异性识别扩增子内一组CpG位点甲基化序列的TaqMan™荧光探针，联合参照基因引物对与荧光探针，进行PCR扩增检测，根据靶DNA甲基化序列与参照基因的Ct值进行计算与判断。MethyLight法的检测灵敏度高

［

104］

，同时操作简单、价格低廉，可满足临床大样本检测的需求

［

105］

。MethyLight法的外部质控品使用尚缺乏共识，不同项目分别采用了模拟样本、核酸等对全流程或部分环节进行质量控制。其质控品设置参照“质控品设置原则”。专家共识意见8：甲基化荧光定量PCR（也称MethyLight）适用于针对靶基因特定甲基化位点/区域的检测，其基于荧光定量PCR平台进行检测，成本低、速度快，适合临床实验室应用（证据等级：高，推荐等级：强推荐）。3.甲基化敏感性限制性内切酶（MSRE）-PCR法使用MSRE消化切割DNA是一种低成本、易操作的方法。实际应用中，可使用一对甲基化敏感的和甲基化不敏感的同裂酶，主要是HpaII和MspI，二者均识别并切割相同序列5′-CCGG-3′，也可只使用一种MSRE（例如：HpaII、HhaI、BstUI、AciI）进行切割。经过MSRE处理的DNA样本可以采用测序、芯片及荧光定量PCR等方法进行后续检测

［

106,107,108,109,110,111］

。MSRE-PCR法的优势是无需亚硫酸氢盐转化，避免了转化过程对DNA的破坏，对起始DNA的输入量要求不高，但是该方法仅可以提供MSRE特异性CpG位点的甲基化信息，且不适合用于处理高度片段化的cfDNA样本

［

112］

。另外，由于该方法完全依赖于MSRE识别甲基化序列位置，受到MSRE种类的制约，覆盖率相对较低。MSRE-PCR法可采用模拟样本、甲基转移酶处理的核酸等对全流程或部分环节进行质量控制。其质控品设置参照“质控品设置原则”。专家共识意见9：推荐MSRE-PCR法应用于有合适酶切位点的DNA甲基化检测，因其依赖于MSRE对于甲基化序列的识别，不推荐其用于cfDNA样本检测（证据等级：中，推荐等级：弱推荐）。4.数字PCR数字PCR是对低丰度DNA进行精确定量的高灵敏度的方法，其检测灵敏度低至0.01%甚至更低

［

113,114］

，在cfDNA甲基化检测方面具有较大优势。Yue等使用数字PCR的方法检测

SDC2基因的甲基化，其灵敏度高达98.17%

［

115］

。Tiago等使用微滴式数字PCR的方法进行多癌（肺癌、乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌）检测，其灵敏度和特异度分别为60.1%和87.4%

［

116］

。实际应用中，液滴生成失败、生成不均一、卡液、气泡等原因会对数字PCR检测结果造成影响。由于数字PCR检测灵敏度极高且涉及开盖操作，临床实验室需要严格的PCR实验室功能分区（包括试剂准备区、样本处理区、扩增检测区）以避免核酸片段污染。同时，操作过程中应严格遵守标准化操作流程，并注重每批次实验的质量控制，质控品的设计可参照MethyLight法或MSRE-PCR法，质控品设置参照“质控品设置原则”。数字PCR实验室应常规化开展环境核酸污染监测，监测频率根据各实验室检测项目与室内质控结果评估确定。专家共识意见10：对甲基化水平精确定量或低丰度DNA进行甲基化检测时，推荐采用数字PCR法（证据等级：中，推荐等级：强推荐）。5.甲基化特异性高分辨率熔解曲线法（methylationsensitivehigh-resolutionmelting，MS-HRM）甲基化特异性高分辨率熔解曲线法是一种基于荧光PCR平台开展的甲基化检测方法，其可利用亚硫酸氢盐转换后甲基化DNA序列和非甲基化DNA序列具有不同的熔解温度（meltingtemperature，T

m）来实现二者的区分。在亚硫酸氢盐转化后，甲基化DNA序列和未甲基化DNA序列的CG碱基对含量差异很大，导致二者T

m值存在显著差异。MS-HRM可通过将样本PCR产物的熔解曲线图谱与不同甲基化比例的参考品的熔解曲线图谱进行比较，来实现甲基化水平的定量

［

117,118］

。其质控品设置参照“质控品设置原则”。MS-HRM是一种检测低甲基化水平的灵敏技术，在检测因肿瘤异质性等原因造成甲基化水平较低的样本时具有优势

［

119］

。Spitzwieser等应用MS-HRM方法检测到乳腺癌患者

MGMT、

GSTP1、

DAPK1、

RASSF1A、

CCND2

和

HIN-1启动子区域存在的微小甲基化水平改变

［

120］

。另一项研究则使用MS-HRM方法检测

RASSF1A、

RUNX3、

MGMT、

CBLN4、

SFRP1、

SFRP2和

INA基因启动子的甲基化状态，并将其用于诊断脑部胶质瘤

［

121］

。除肿瘤外，MS-HRM法被应用于系统性红斑狼疮的辅助诊断

［

122］

。专家共识意见11：MS-HRM法能够灵敏地检出低甲基化水平基因，在具备HRM模块的荧光定量PCR平台进行检测，具有成本低、速度快、灵敏度高，适合推广临床实验室应用（证据等级：中，推荐等级：弱推荐）。6.焦磷酸测序焦磷酸测序是一种可对亚硫酸氢盐转化后的DNA模板进行定量DNA甲基化分析的测序方法。该方法适用性广，既可用于CpG贫乏区域，也可用于CpG富集区域的甲基化检测。其主要局限性在于仅能对较短的已知区域进行分析（常规检测长度约100~150bp）。新一代平台虽可扩展至200bp，但片段过长会显著降低检测准确性。通过在一个扩增子上设计多条测序引物或采用连续焦磷酸测序策略，可在一定程度上弥补这一不足

［

123,124］

。甲基化水平（甲基化率）依据焦磷酸测序信号峰图中，同一检测位点胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）的峰高比值进行定量计算

［

124］

。其质控品设置参照“质控品设置原则”。Bakkum-Gamez等通过焦磷酸测序，结合非侵入性样本采集技术，成功从阴道内卫生棉条采集的样本中鉴定了用于子宫内膜癌的早期诊断的甲基化标志物

［

125,126］

。Kottaridi等通过焦磷酸测序成功分析了正常子宫内膜与子宫内膜癌样本中

GALR1启动子区域13个CpG位点的平均甲基化程度差异

［

127］

。在另一项研究中，Irahara及其同事通过焦磷酸测序方法全面测定了结肠癌中

LINE-1的甲基化水平

［

128］

。焦磷酸测序的优势在于可准确定量单个连续CpG位点的甲基化频率，但该方法仅能对已知序列区域的甲基化水平进行检测。和基于荧光定量PCR平台的MethyLight技术相比，焦磷酸测序成本相对较高、对实验操作要求更为严格，数据分析流程也相对复杂，需借助专业软件与算法完成数据解析与结果判读。专家共识意见12：焦磷酸测序是对特定甲基化位点的甲基化比例进行定量的经典方法，推荐其作为临床特定位点甲基化检测的参照方法（证据等级：中，推荐等级：弱推荐）。7.全基因组重亚硫酸盐测序（wholegenomebisulfitesequencing，WGBS）全基因组重亚硫酸盐测序是一种具备单CpG分辨率的全基因组DNA甲基化分析技术，也是全基因组甲基化分析的金标准。WGBS在疾病相关甲基化标志物的筛选与鉴定中发挥着重要作用

［

129,130］

，然而，因其检测成本较高、实验流程复杂，难以应用于临床大规模检测。WGBS可产生高通量测序数据，从而基于测序深度对基因组中几乎所有胞嘧啶位点（部分重复序列区域除外）的甲基化水平进行定量。目前，研究者已开发出多种统计方法及生物信息学工具，用于WGBS数据的深度解析，以鉴定差异甲基化CpG位点（differentialmethylationCpGsite，DMC）和差异甲基化区域（differentiallymethylatedregions，DMR）

［

131,132,133］

。WGBS文库构建的常规方案对DNA模板起始量要求较高，通常需要200~500ng，最高可达5μg。传统WGBS流程为先进行DNA接头连接，再实施亚硫酸氢盐转化，该步骤会导致大量的DNA断裂，进而显著提高对DNA模板量的需求。目前，基于亚硫酸氢盐转化后接头连接（post-bisulfiteadaptortagging，PBAT）的WGBS技术和基于转座酶标记的WGBS（tagmentation-basedWGBS，T-WGBS）已成为常用的改良方案

［

134,135,136,137］

，二者对于DNA模板的需求量显著降低。其中，PBAT策略将亚硫酸氢盐转化置于文库构建之前，避免了亚硫酸氢盐引起的测序模板断裂，仅需100ng微量DNA即可完成WGBS建库与分析

［

134］

。T-WGBS则利用高活性Tn5转座酶片段化基因组DNA，并添加测序接头，可将DNA模板起始量降至20ng以下

［

137］

。其质控品设置参照“质控品设置原则”。8.简化代表性亚硫酸氢盐测序（reducedrepresentationbisulfitesequencing，RRBS）亚硫酸氢盐转化处理会导致DNA序列复杂度显著降低，进而使甲基化测序数据的比对冗余度显著上升。简化代表性亚硫酸氢盐测序只对基因组特定区域进行分析，约覆盖全基因组CpG位点的6%~12%，以启动子区和重复序列区域为主要检测目标，可有效缓解测序数据冗余问题

［

138］

。RRBS的核心实验流程为：在亚硫酸氢盐转换之前，采用限制性内切酶对基因组DNA进行切割，以富集富含CpG的目标片段，经典方案多使用MspI进行酶切，可产生长度多在50~300bp，末端富含CpG的酶切片段

［

138］

；随后完成文库构建与高通量测序。其质控品设置参照“质控品设置原则”。RRBS具有较高的检测灵敏度，适用于肿瘤异常甲基化谱或整体甲基化状态的快速筛选与分析

［

138］

。该方法尤其适用于传统基于亚硫酸氢盐测序方法难以解析的甲基化区域，以及多种肿瘤特征性改变的重复序列区域

［

139］

。由于RRBS可通过限制性酶实现对基因组中部分CpG富集区域靶向检测，可显著降低测序数据量，兼具时间成本优势；同时对DNA模板要求较低，仅需10~300ng即可完成稳定可靠的检测，且对样本DNA质量的要求相对宽松

［

138］

。受限于限制性内切酶的识别位点分布，RRBS无法覆盖基因组内全部CpG富集区域，部分区域因酶切位点密度不足而难以被有效检测。RRBS和WGBS的结果一致性高

［

140］

，对于能够被RRBS有效覆盖的目标区域，RRBS可作为WGBS的替代方案。多项研究已使用RRBS作为核心手段，用于肿瘤早筛与诊断相关新型甲基化标志物的筛选、模型构建及临床验证

［

141,142］

。9.质谱液相色谱-串联质谱（liquidchromatography-tandemmassspectrometry，LC-MS/MS）通过“基因组DNA完全酶解—液相色谱分离—多反应监测”三步，将基因组DNA中的5-甲基-2′-脱氧胞苷（5-methyl-2′-deoxycytidine，5-mdC）与未甲基化胞苷（2′-deoxycytidine，dC）分别定量，以5-mdC/（dC+5-mdC）摩尔百分比计算全局甲基化水平

［

143,144］

。该流程无需亚硫酸氢盐转化与PCR扩增，可避免扩增偏倚，但不具备位点特异性，无法实现对特定CpG位点的定位与定量分析。此外，PCR-LC-MS/MS法将PCR法与LC-MS/MS相结合，对PCR扩增产物进行高灵敏性、特异性的甲基化分析，从而实现对特定基因区域一组连续CpG的甲基化状态进行评估。基质辅助激光解析电离-飞行时间（matrix-assistedlaserdesorptionionizationtime-of-flight，MALDI-TOF）质谱能够检测特定CpG位点的甲基化状态。该方法基于亚硫酸氢盐转化后C/T间16Da的质量差异，能够实现单碱基分辨率的甲基化定量，其利用多重PCR在96孔板体系中可同步检测多达60个CpG位点，检测准确率>99%，是候选甲基化位点大样本队列验证经济高效的选择

［

144,145］

。质谱类检测方法普遍存在仪器购置与维护成本较高的问题，目前在DNA甲基化检测领域主要应用于基础与转化医学研究，较少用于临床检测。专家共识意见13：推荐WGBS、RRBS作为新型甲基化标志物的筛选方法。WGBS、RRBS及质谱法三种方法成本均较高、操作复杂，不推荐用于日常临床实践中的疾病筛查与诊断（证据等级：强，推荐等级：强推荐）。（二）结果报告不同检测技术检测的靶点数目与名称可能不同，因而检测结果的判定也不尽相同。为确保结果的完整性、可追溯性和可解释性，甲基化检测结果报告通常应包括以下几个关键部分：患者信息：姓名、性别、年龄、临床诊断等；样本信息：样本类型、样本编号、送检时间等；（3）检测信息：检测目的、检测方法、检测结果，检测时间、报告时间等；（4）结果的判定与解读；（5）实验室信息：实验室名称、联系电话、检测人员、审核人员。需要注意的是，甲基化检测用于疾病诊断时，只能作为辅助诊断手段，不能作为直接确诊的依据。当甲基化结果与临床诊断结果不一致，如甲基化结果阴性、金标准结果阳性时，则以金标准结果为准；如甲基化结果阳性、金标准结果阴性时，则建议结合影像学、肿瘤标志物等指标综合判断，必要时定期随访，随访策略需根据被检疾病特性、患者个体风险分层以及甲基化标志