肿瘤浸润淋巴细胞产品质量控制指南（试行）

肿瘤浸润淋巴细胞产品质量控制指南（试行）一、范围本指南规定了肿瘤浸润淋巴细胞（TumorInfiltratingLymphocytes,TIL）产品生产全过程的质量控制要求，包括原辅材料质量控制、过程质量控制、终产品质量控制、储存运输质量控制、稳定性考察要求，适用于自体TIL产品研发、生产及注册申报阶段的质量控制，供抗肿瘤细胞治疗产品注册申请人、生产企业参照执行。异基因TIL产品可在本指南基础上调整后适用。二、规范性引用文件本指南引用以下文件的相关条款，未注明日期的引用文件，其最新版本适用于本指南：1.《中华人民共和国药品管理法》（2019年版）2.《药品生产质量管理规范》（2010年修订版）3.《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》（国家药监局2017年第14号公告）4.《中华人民共和国药典》（2025年版）三部5.《生物制品质量控制分析方法验证技术指导原则》（国家药监局2020年第43号公告）三、术语和定义1.肿瘤浸润淋巴细胞：指从自体肿瘤组织中分离得到，经体外活化、扩增培养得到的，以T淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体，用于过继性细胞治疗。2.原代分离TIL：指从手术切除或穿刺活检获得的肿瘤组织块、消化后的肿瘤细胞悬液中首次分离得到的淋巴细胞，未经大规模扩增培养。3.终产品TIL：指完成体外活化、扩增、收获、洗涤、制剂制备后的可用于回输患者的TIL产品。4.活细胞率：指终产品中活细胞占总细胞数的百分比，按照台盼蓝染色法或流式细胞术测定。5.无菌检查：用于检查产品是否存在外源性活微生物污染的试验，按照《中国药典》三部要求执行。四、原辅材料质量控制（一）起始原材料1.肿瘤组织：患者自体肿瘤组织作为起始原材料，需满足以下要求：来源：应明确患者身份标识，留存患者完整的知情同意书、病史记录、术前病原学检测结果；术前需完成乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）1/2型、梅毒螺旋体（TP）、巨细胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）、人类嗜T淋巴细胞病毒（HTLV）1/2型的血清学/核酸检测，所有检测结果阴性方可投入生产；阳性结果需记录风险评估结果，制定风险控制措施。取材要求：实体瘤取材重量不低于0.5g，穿刺活检样本单条长度不小于1cm，样本体积不低于0.1cm³；取材后需在4h内转运至细胞制备实验室，转运温度维持在2-8℃，转运过程需避免挤压、反复冻融；外观要求无坏死、无严重血凝块、无明显脂肪组织污染，病理确认肿瘤组织占比不低于60%。接收标准：记录组织来源、重量、转运时间、温度，外观检查合格、病原学检测合格后方可接收，不合格组织予以废弃并记录。2.外周血单个核细胞（PBMC）饲养层：采用第三方来源PBMC作为饲养层时，需符合以下要求：供体符合国家献血者健康检查要求，病原学检测同上述肿瘤组织供体要求，核酸检测结果全部阴性；冻存细胞活细胞率复苏后不低于85%，无菌检查合格，支原体检查阴性。如采用自体PBMC饲养层，需满足自体病原学检测要求，活细胞率复苏后不低于80%。（二）原辅材料分级控制1.关键原辅材料：包括细胞培养基、重组细胞因子（IL-2、IL-15、OKT3等）、解离酶、血清/血清替代物、冻存保护剂，需满足以下要求：重组细胞因子：应为符合GMP要求生产的药用级原料，纯度不低于95%，比活性符合规定，宿主蛋白残留不高于100ng/剂量，DNA残留不高于10ng/剂量，无菌、支原体、内毒素检查合格，内毒素不高于0.5EU/mL。细胞培养基：优先采用无血清、无动物源成分培养基，需提供配方来源，无支原体、病毒污染，批间差检测合格，促细胞扩增能力符合规定，每批次内毒素不高于0.5EU/mL。组织解离酶：采用重组解离酶，禁止使用动物源性粗提酶，纯度不低于90%，无支原体、外源性病毒污染，内毒素不高于0.5EU/mg。冻存保护剂：采用药用级二甲基亚砜（DMSO），纯度不低于99.5%，内毒素不高于0.1EU/mL，无菌检查合格。血清：仅允许在原代培养阶段使用，需采用符合GMP要求的胎牛血清，无外源性病毒、支原体污染，内毒素不高于0.25EU/mL，批次不超过3次/产品周期，使用前需完成支原体、无菌检查。鼓励采用血清替代物替代胎牛血清。2.辅助原辅材料：包括缓冲液、洗涤液、离心管、培养瓶、培养袋等，需满足医用级要求，无热原、无菌，内毒素不高于0.5EU/容器，符合GB15980-1995《一次性使用医疗用品卫生标准》要求。五、生产过程质量控制（一）原代分离阶段1.肿瘤组织处理：所有操作在A级洁净区进行，环境监测满足悬浮粒子≤3520个/m³（≥0.5μm）、浮游菌≤1CFU/m³、沉降菌≤1CFU/4h/φ90mm平皿要求；组织剪碎至1-2mm³碎块，或采用梯度消化法获得单细胞悬液，消化时间控制在30-60min，温度37℃。2.淋巴细胞分离：采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，离心参数400g，20min，温度20-25℃，分离后吸取白膜层，洗涤3次去除解离酶和红细胞。3.过程检测：原代分离后检测活细胞率，要求≥70%，细胞回收率不低于1×10⁶个活细胞/g肿瘤组织（实体瘤手术样本）；无菌取样做无菌检查、支原体检查，阴性方可进入扩增阶段。（二）扩增培养阶段1.活化阶段：原代TIL接种至培养体系，添加OKT3、IL-2进行活化培养，培养温度37℃，二氧化碳浓度5%，湿度≥90%；培养第3-5天更换培养基，观察细胞生长状态，记录细胞倍增时间。2.大规模扩增阶段：活化后的TIL接种至扩增体系，采用密闭式培养系统生产，过程中每2-3天更换培养基，监测葡萄糖消耗、乳酸浓度，要求培养体系中乳酸浓度不超过20mmol/L，葡萄糖浓度不低于1mmol/L，超过阈值及时补充培养基。3.过程控制要求：细胞密度控制：接种密度维持在1×10⁶-5×10⁶活细胞/mL，扩增末期最高密度不超过3×10⁶活细胞/mL。培养环境监测：封闭式培养系统无需每日环境监测，每批次培养过程中至少监测1次洁净区环境，开放式培养每日监测环境，异常结果及时记录并采取纠偏措施。过程检测：每批次培养第7天、第14天分别取样检测活细胞率，要求不低于75%，检测无菌、支原体，检测T细胞比例，要求CD3⁺细胞比例逐次上升，终末扩增前CD3⁺比例不低于60%；如有异常，启动偏差调查。（三）收获与制剂制备阶段1.收获要求：扩增达到预定细胞量（最低不低于1×10⁹个活细胞/剂量，推荐2×10⁹-1×10¹⁰个活细胞/剂量）后收获，收获过程采用封闭式管道连接，避免开放操作，洗涤3次去除残留培养基、细胞因子、游离DMSO。2.制剂配制：收获后的细胞重悬于规定的载体溶液（生理盐水+人血白蛋白或专用细胞输注载体），混匀后分装至输注袋或冻存管，明确患者标识、产品批号、制备日期。3.过程检测：制剂混匀后取样，检测细胞密度、活细胞率，要求活细胞率不低于80%，总活细胞量符合处方要求，偏差超过±10%需启动偏差调查；取样进行无菌检查、支原体检查，待检测结果出具后放行产品。六、终产品质量控制（一）放行检验项目及合格标准终产品需完成以下项目检验，全部符合要求方可放行：检验项目检验方法合格标准外观性状目视检查均匀悬浮液，无凝块、无异物、无变色，冻存产品为均匀冻块，无裂纹细胞计数与活细胞率流式细胞术/台盼蓝染色法总活细胞数≥1×10⁹活细胞/剂量，活细胞率≥80%，细胞数偏差在处方量的±15%以内细胞表型分析流式细胞术CD3⁺T细胞比例≥70%，其中CD8⁺效应T细胞比例≥30%；调节性T细胞（CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺）比例≤10%；符合产品注册申报的预设范围细胞功能测定干扰素-γ（IFN-γ）ELISpot试验/胞内染色流式细胞术肿瘤特异性抗原刺激后，IFN-γ分泌细胞数/阳性比例不低于预设阈值（一般要求刺激后反应孔斑点数是阴性对照的3倍以上，或阳性细胞比例不低于1%）；细胞毒性试验对自体肿瘤细胞杀伤率不低于20%（效靶比10:1）无菌检查《中国药典》三部通则1101薄膜过滤法无任何微生物生长支原体检查《中国药典》三部通则1106培养法/核酸扩增法阴性内毒素检查《中国药典》三部通则1143凝胶限度法内毒素含量≤0.5EU/mL外源性病毒检测通用：PCR法/核酸测序；特异性：抗体检测/核酸检测HBV、HCV、HIV-1/2、CMV、EBV、HTLV-1/2核酸检测阴性；如有其他病毒污染风险，增加对应检测项目，结果全部阴性残余杂质检测流式细胞术/ELISA法残留宿主蛋白（异源饲养层供体蛋白）≤100ng/剂量；残留DNA（饲养层基因组DNA）≤10ng/剂量；残余胎牛血清蛋白≤50μg/剂量；残余IL-2≤10ng/剂量，残余DMSO≤1%（v/v）肿瘤细胞残留检测流式细胞术/数字PCR每1×10⁸个TIL中残留肿瘤细胞不高于1个，即残留率≤1×10⁻⁸遗传学稳定性检测G显带核型分析/染色体微阵列分析（CMA）无病理性染色体畸变，扩增倍数超过10⁹倍时需检验，结果异常需进行风险评估pH值检查电位法符合产品注册规定范围，一般为6.5-7.5标识检查目视检查标识清晰完整，包含患者姓名、ID号、产品批号、制备日期、有效期、储存条件、剂量信息，无错误每批次终产品必须完成上述所有放行检验项目，不得缺项；同一患者单次制备多袋产品，按照一个批次管理，至少抽检1袋完成全项检验，其余批次完成无菌、细胞计数、活细胞率检查。七、安全性特殊控制要求（一）肿瘤细胞残留控制TIL产品来源于肿瘤组织，分离过程中可能残留自体肿瘤细胞，必须严格控制残留量：采用针对患者肿瘤特异性突变或肿瘤特异性标志物的数字PCR或流式细胞术检测，残留量必须低于1×10⁻⁸，超过阈值不得放行；如检测结果处于临界值，需补充进行裸鼠致瘤试验，观察12周无肿瘤生成方可放行。（二）复制型病毒检测如采用病毒载体进行基因修饰（仅适用于基因工程改造TIL产品），需增加复制型病毒（RCL/RCR）检测，按照《中国药典》要求执行，结果阴性方可放行。（三）交叉污染控制生产过程同一洁净区同一时间仅处理一个患者的产品，所有操作工具一次性使用，更换患者产品操作前对环境进行彻底消毒，每批次生产结束后进行环境采样检测，未检出其他患者来源细胞/微生物方可开展下一批次生产。八、储存与运输质量控制（一）储存控制1.新鲜产品：制备完成后2-8℃储存，储存时间不超过24h，储存过程温度波动不超过±2℃，每2h记录一次温度。2.冻存产品：采用程序降温法降温，降温速率1℃/min降至-80℃，转移至气相液氮罐（-150℃以下）长期储存，储存过程实时监测温度，温度高于-130℃时报警并记录，及时采取转移措施；冻存产品储存有效期不超过2年，超过有效期不得放行使用。3.储存环境要求：液氮罐定期检漏，每批次冻存产品记录位置、编号，双人复核，避免错发。（二）运输控制1.新鲜产品运输：采用保温箱，维持2-8℃，运输时间不超过12h，放置温度记录仪全程记录温度，温度超出范围不得使用。2.冻存产品运输：采用干冰保温容器，维持温度低于-130℃，干冰填充量满足运输全程要求，放置温度记录仪全程记录，运输过程避免震动、倒置，到达接收地点后核对温度记录，合格方可入库。九、稳定性考察要求（一）考察类型1.实时稳定性考察：选取至少3个批次终产品，按照储存条件放置，分别在0个月、3个月、6个月、12个月、18个月、24个月取样检测，检测项目包括活细胞率、细胞表型、细胞功能、无菌、支原体、内毒素，评估储存有效期。2.运输稳定性考察：模拟实际运输条件，考察最长运输时间下产品质量变化，要求运输后活细胞率下降不超过5%，所有项目符合放行标准。3.冻融稳定性考察：冻存产品复苏后考察室温放置稳定性，要求放置4h活细胞率不低于75%，所有项目符合放行标准。（二）合格标准稳定性考察过程中任何一项指标不符合放行标准，需评估储存条件有效性，调整有效期或储存要求。十、方法学验证要求所有质量控制检测方法需按照《生物制品质量控制分析方法验证技术指导原则》完成验证，符合以下要求：1.细胞计数与活细胞率检测：准确度偏差不超过±10%，精密度RSD≤10%，定量下限不低于1×10⁵个/mL。2.流式细胞术表型分析：准确度偏差不超过±5%，精密度RSD≤8%，特异性符合要求。3.残留肿瘤细胞检测：灵敏度达到1×10⁻⁸，特异性符合要求，假阴