哺乳动物环形RNA：表达、保守性与功能的深度剖析

哺乳动物环形RNA：表达、保守性与功能的深度剖析一、引言1.1研究背景与意义环形RNA（circRNA）作为一类具有闭合环状结构的非编码RNA，近年来在生命科学领域中逐渐崭露头角。自1976年首次被发现以来，circRNA长期被视为转录过程的副产物或“垃圾RNA”而未受到足够重视。然而，随着高通量测序技术的迅猛发展以及生物信息学分析方法的不断革新，越来越多的circRNA被鉴定和注释，其独特的生物学特性与重要的调控功能也逐渐为人们所认知，circRNA的研究已成为RNA生物学领域中最具活力的前沿方向之一。在哺乳动物中，circRNA广泛存在于各种组织和细胞类型中，并且呈现出高度的组织特异性与发育阶段特异性表达模式。例如，在哺乳动物的大脑中，circRNA的表达水平显著高于其他组织，且在神经元的发育和分化过程中发挥着不可或缺的作用。在胚胎发育阶段，特定的circRNA表达谱变化与细胞的增殖、分化和器官形成密切相关，这表明circRNA在哺乳动物的正常生理过程中扮演着至关重要的角色。circRNA参与了多种关键的生物学过程，如转录调控、miRNA海绵作用、蛋白质相互作用以及翻译调控等。在转录调控方面，circRNA可以通过与RNA聚合酶Ⅱ或其他转录因子相互作用，影响基因的转录起始、延伸和终止，从而精细地调控基因表达水平。作为miRNA海绵，circRNA能够通过竞争性结合miRNA，解除miRNA对其靶基因的抑制作用，进而间接调控基因表达，形成了复杂的ceRNA（竞争性内源RNA）调控网络。circRNA还可以与蛋白质相互作用，影响蛋白质的定位、活性和稳定性，参与细胞信号传导通路的调控。部分circRNA甚至能够通过内部核糖体进入位点（IRES）依赖或非依赖的方式进行翻译，产生具有生物学功能的多肽或蛋白质，进一步拓展了其在生物学过程中的功能多样性。对哺乳动物circRNA的深入研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值。在理论层面，有助于我们更全面、深入地理解基因表达调控的复杂网络和分子机制，揭示生命过程的本质和规律。circRNA的发现和研究为我们认识遗传信息的传递和调控提供了新的视角，补充和完善了传统的中心法则，使我们对基因表达调控的认识从线性思维向非线性思维转变。在应用方面，circRNA具有作为疾病诊断和预后生物标志物的巨大潜力。由于其在不同组织和疾病状态下的特异性表达，circRNA可以作为高度灵敏和特异的生物标志物，用于疾病的早期诊断、病情监测和预后评估。以肿瘤为例，许多肿瘤相关的circRNA已被鉴定，其表达水平的异常变化与肿瘤的发生、发展、转移和耐药密切相关，有望成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。circRNA还在药物研发和基因治疗领域展现出广阔的应用前景，为开发新型的治疗策略和药物提供了新的方向。1.2研究目的与方法本研究旨在系统、全面地分析哺乳动物环形RNA的表达谱、保守性和功能，具体研究目的如下：通过整合已有的相关文献和公共数据库中的circRNA表达谱数据，涵盖不同组织、不同发育阶段以及疾病状态下的表达信息，运用先进的生物信息学分析方法和统计学手段，深入探究不同类型circRNA在不同哺乳动物物种中的表达模式和动态变化趋势，绘制出高精度的circRNA表达谱图谱，为后续的功能研究提供坚实的数据基础。利用多种生物信息学工具和算法，对多个哺乳动物物种的circRNA序列进行全面比对和深入的进化分析，计算保守分数，评估其保守性程度。通过与已有的物种标准基因组序列进行同源性检测，精确计算不同物种间circRNA的共享比例，并对共享基因进行详细的功能注释，从而深入揭示circRNA在物种进化过程中的保守性特征和功能保留情况，为理解circRNA的进化起源和生物学意义提供重要线索。综合运用体外实验和生物信息学方法，深入研究circRNA的功能机制。借助miRNA海绵机制、蛋白质相互作用和调控转录等关键手段，利用基因功能数据库和功能分析工具，对circRNA在细胞过程中的功能进行深入挖掘和全面解析。通过RNA免疫沉淀（RIP）、荧光素酶报告基因实验、基因敲除和过表达等实验技术，验证circRNA与miRNA、蛋白质之间的相互作用关系，阐明其在细胞信号传导、代谢调控、增殖分化等生物学过程中的具体功能和分子机制。在研究过程中，将采用以下研究方法：利用生物信息学方法，从公共数据库（如GEO、ENCODE等）中收集和整理circRNA表达谱数据，运用数据预处理、差异分析和绘图等技术，对数据进行系统分析和可视化展示。通过NCBI、Ensembl等数据库获取多个哺乳动物物种的基因组序列和circRNA注释信息，利用BLAST、ClustalW等比对工具和PhyML、MrBayes等进化分析软件，进行序列比对和进化分析，计算保守分数和进化距离，构建系统发育树，评估circRNA的保守性。采用RNA免疫沉淀（RIP）、RNApull-down、荧光素酶报告基因实验等技术，验证circRNA与miRNA、蛋白质之间的相互作用关系。利用基因敲除、过表达、RNA干扰等实验手段，研究circRNA对细胞生物学功能的影响，通过细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等实验，检测细胞表型的变化，揭示circRNA的功能机制。二、哺乳动物环形RNA的表达谱分析2.1表达谱数据收集为全面解析哺乳动物中环形RNA（circRNA）的表达谱，我们从多个公共数据库和相关文献中广泛收集表达谱数据。在公共数据库方面，着重检索了GEO（GeneExpressionOmnibus）、ENCODE（EncyclopediaofDNAElements）等综合性数据库。以GEO为例，通过设定关键词“哺乳动物circRNA表达谱”，并结合特定的物种、组织、发育阶段及疾病状态等筛选条件，获取了大量相关的高通量测序数据和芯片数据。在ENCODE数据库中，利用其提供的强大的数据检索工具，按照严格的标准筛选出高质量的circRNA表达谱数据集。在文献检索方面，借助WebofScience、PubMed等权威学术搜索引擎，以“哺乳动物circRNA表达谱”“circRNAtissue-specificexpression”“circRNAdevelopment-stageexpression”“circRNAdisease-relatedexpression”等为检索词，进行全面且细致的文献搜索。对检索到的文献进行严格的筛选和评估，优先选择采用先进实验技术（如高通量测序技术、芯片技术等）和科学实验设计的研究论文。对于数据质量高、样本量充足且具有代表性的文献，提取其中的circRNA表达谱数据，并详细记录实验方法、样本来源、数据处理方式等关键信息，以确保数据的可靠性和可重复性。经过全面的数据收集和整理，我们共获取了涵盖小鼠、大鼠、人类、猴子等多种哺乳动物的circRNA表达谱数据。这些数据包括了不同组织（如大脑、肝脏、心脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪等）、不同发育阶段（如胚胎期、胎儿期、新生儿期、幼年、成年、老年等）以及多种疾病状态（如癌症、神经系统疾病、心血管疾病、代谢性疾病等）下的circRNA表达信息，为后续深入的表达模式分析奠定了坚实的数据基础。2.2表达模式分析2.2.1物种特异性表达通过对不同哺乳动物物种circRNA表达谱数据的深入分析，发现circRNA在物种特异性表达方面呈现出独特的特征。在进化历程中，不同物种的circRNA表达谱存在显著差异。例如，在人类和小鼠这两个常用的模式生物中，虽然部分circRNA具有一定的保守性，但仍有大量circRNA呈现出物种特异性的表达。研究表明，人类特异性表达的circRNA可能参与了人类独特的生理过程和疾病发生发展机制，如在神经系统发育和认知功能方面，人类特异性circRNA可能发挥着关键的调控作用。而小鼠特异性表达的circRNA则可能与小鼠的特定生理特性和适应性进化相关，在小鼠的生长发育、免疫调节等方面具有重要功能。进一步的研究发现，circRNA的物种特异性表达与物种的进化地位和生理特性密切相关。在灵长类动物中，随着进化等级的升高，circRNA的表达谱逐渐呈现出更加复杂和多样化的趋势。一些在低等哺乳动物中未检测到或低表达的circRNA，在高等灵长类动物中呈现出高表达状态，这些circRNA可能与灵长类动物的高级认知功能、复杂的社会组织等特征的进化相关。这种物种特异性表达模式表明，circRNA在不同物种的进化过程中可能经历了适应性选择，其表达谱的差异反映了物种在进化过程中对不同环境和生理需求的适应策略。2.2.2组织特异性表达对circRNA在不同组织中的表达谱进行分析，发现其具有显著的组织特异性表达模式。在哺乳动物的各个组织中，circRNA的表达水平和种类存在明显差异。以大脑组织为例，circRNA的表达水平显著高于其他组织，且存在大量大脑特异性表达的circRNA。这些大脑特异性circRNA在神经元的发育、分化、突触形成和神经信号传导等过程中发挥着重要作用。研究发现，一些circRNA在大脑的特定区域（如海马体、前额叶皮质等）呈现出高表达，与学习、记忆、情绪等高级神经功能密切相关。例如，circRNA-CDR1as在大脑中高度表达，作为miR-7的海绵，通过调控miR-7的活性，影响神经元的存活、分化和突触可塑性。在肝脏组织中，circRNA的表达谱也具有独特的特征。一些circRNA参与了肝脏的代谢调控、解毒功能和细胞增殖等过程。例如，circRNA-HIPK3在肝脏中表达，通过与miR-124等miRNA相互作用，调节肝脏细胞的生长和代谢相关基因的表达。在心脏组织中，circRNA在心肌细胞的收缩、心脏发育和心血管疾病的发生发展中发挥着重要作用。研究表明，circRNA-ANRIL在心脏组织中表达，与心血管疾病的风险相关，可能通过调控相关基因的表达影响心脏的功能和疾病进程。这种组织特异性表达模式表明，circRNA在不同组织中可能参与了特定的生物学过程和生理功能的调控，其表达谱的差异为深入理解组织特异性的生理和病理机制提供了重要线索。2.2.3发育阶段特异性表达分析circRNA在哺乳动物不同发育阶段的表达谱，发现其表达呈现出动态变化的特征，具有明显的发育阶段特异性。在胚胎发育早期，circRNA的表达谱相对简单，但随着胚胎的发育和分化，circRNA的种类和表达水平逐渐增加。在胚胎干细胞向不同组织细胞分化的过程中，特定的circRNA表达谱变化与细胞的分化命运密切相关。例如，在神经干细胞向神经元分化的过程中，一些circRNA的表达水平显著上调，这些circRNA可能参与了神经元分化的调控，促进神经干细胞向神经元的定向分化。在出生后的发育过程中，circRNA的表达谱继续发生变化。在幼年阶段，circRNA的表达与生长发育相关，参与了细胞增殖、组织器官的生长和功能完善等过程。随着年龄的增长，在成年阶段，circRNA的表达谱相对稳定，但仍有一些circRNA在特定组织或生理状态下发生表达变化，参与维持成年个体的生理平衡和应对环境变化。在老年阶段，circRNA的表达谱又发生了显著改变，一些circRNA的表达失调与衰老相关的生理功能衰退和疾病发生密切相关。例如，在衰老过程中，大脑中一些circRNA的表达异常，可能参与了神经退行性疾病的发生发展，如阿尔茨海默病和帕金森病等。这种发育阶段特异性表达模式表明，circRNA在哺乳动物的发育进程中发挥着重要的调控作用，其表达谱的动态变化与发育过程中的细胞分化、组织器官形成和功能完善等生物学过程密切相关。2.2.4疾病状态下的表达变化研究发现，circRNA在多种疾病状态下的表达发生显著改变，为疾病的诊断、治疗和发病机制研究提供了新的视角。在癌症领域，circRNA的表达谱在肿瘤组织与正常组织之间存在明显差异。例如，在胃癌组织中，通过高通量测序和芯片技术发现了大量差异表达的circRNA。一些circRNA在肿瘤组织中高表达，如hsa_circ_0001666，可能通过发挥miRNA海绵作用，调控相关基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；而另一些circRNA在肿瘤组织中低表达，可能失去了对肿瘤发生发展的抑制作用。这些差异表达的circRNA具有作为胃癌诊断和预后生物标志物的潜力，通过检测其表达水平，可以辅助早期诊断、病情监测和预后评估。在神经系统疾病中，circRNA的表达失调也与疾病的发生发展密切相关。在阿尔茨海默病患者的大脑中，一些circRNA的表达异常，如circRNA-Aβ从APP基因Aβ编码区产生，可能通过调节糖原合酶激酶3β（GSK-3β）水平，影响tau蛋白的磷酸化和神经原纤维缠结的形成，从而在阿尔茨海默病的发病机制中发挥重要作用。在帕金森病中，也发现了相关circRNA的表达变化，可能参与了多巴胺能神经元的损伤和疾病进程。这些研究表明，circRNA有望成为神经系统疾病诊断和治疗的新靶点，通过调节其表达水平或功能，可能为神经系统疾病的治疗提供新的策略。此外，在心血管疾病、代谢性疾病等其他病症中，circRNA的表达也发生了相应的改变，与疾病的病理生理过程相关。例如，在心血管疾病中，circRNA-ANRIL的表达与动脉粥样硬化的发生发展相关；在糖尿病中，一些circRNA的表达变化可能参与了胰岛素分泌和糖代谢的调控。这些发现为深入理解疾病的发病机制和开发新的治疗方法提供了重要的线索和潜在的靶点。三、哺乳动物环形RNA的保守性分析3.1序列比对与进化分析为了深入探究哺乳动物环形RNA（circRNA）的保守性，我们利用先进的序列比对工具和进化分析软件，对多个哺乳动物物种的circRNA序列展开了全面且细致的分析。在序列比对阶段，选用了BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）和ClustalW等经典且高效的比对工具。BLAST凭借其快速搜索和高效比对的特点，能够在大规模的序列数据库中迅速找出与目标circRNA序列具有相似性的序列，为后续的深入分析提供了广泛的候选集。ClustalW则擅长进行多序列比对，通过对多个物种的circRNA序列进行全局比对，可以精确地识别出保守区域和变异位点，为进化分析奠定了坚实的数据基础。以人类、小鼠、大鼠、猴子等多种哺乳动物的circRNA序列为例，将这些序列输入到BLAST工具中，设定合适的比对参数，如期望阈值（E-value）、匹配得分和错配罚分等，以确保比对结果的准确性和可靠性。通过BLAST搜索，获取与每个circRNA序列高度相似的其他物种的序列信息，构建初步的序列比对集合。在此基础上，利用ClustalW进行多序列比对。在ClustalW比对过程中，采用渐进比对策略，首先对序列进行两两比对，计算它们之间的相似性得分，然后根据相似性程度逐步合并比对，最终生成包含所有物种circRNA序列的多序列比对结果。通过可视化工具，如Jalview等，可以直观地展示多序列比对的结果，清晰地呈现出保守区域和变异位点在不同物种间的分布情况。在进化分析方面，运用PhyML和MrBayes等专业的进化分析软件，基于多序列比对结果构建系统发育树。PhyML采用最大似然法（MaximumLikelihood，ML），通过计算不同进化模型下的似然值，寻找最能解释序列数据的进化树拓扑结构和分支长度，具有计算速度快、准确性高的优点。MrBayes则基于贝叶斯推断（BayesianInference）方法，通过对进化树空间进行随机搜索，同时考虑多个进化参数，能够更全面地评估进化树的不确定性，提供更加稳健的进化分析结果。将多序列比对结果导入到PhyML软件中，选择合适的进化模型，如GTR+G（GeneralTime-ReversiblemodelwithGamma-distributedratevariation）模型，该模型能够充分考虑核苷酸替换的速率差异和位点间的速率异质性，更准确地反映circRNA序列的进化过程。通过多次迭代计算，得到最优的系统发育树拓扑结构和分支长度。将相同的数据导入到MrBayes软件中，设置合适的先验参数和运行参数，如链的数量、迭代次数、抽样频率等，进行贝叶斯推断分析。通过对多个独立运行结果的合并和分析，获得系统发育树的后验概率分布，评估不同进化分支的可信度。通过系统发育树的分析，可以清晰地了解不同物种circRNA之间的进化关系。例如，如果某些circRNA在进化树上形成了紧密的聚类，且它们的序列相似性较高，表明这些circRNA在进化过程中具有较高的保守性，可能起源于共同的祖先，并在不同物种的进化历程中保留了相似的序列特征和功能。相反，如果某些circRNA在进化树上的位置较为分散，且序列差异较大，则说明它们在进化过程中经历了较大的变异，可能具有物种特异性的功能或进化命运。3.2保守性评估指标3.2.1共享比例计算计算不同物种间环形RNA（circRNA）的共享比例是评估其保守性的重要指标之一。共享比例的计算方法基于已有的物种标准基因组序列和通过序列比对得到的circRNA同源序列信息。首先，利用生物信息学工具，如BEDTools等，将不同物种的circRNA注释信息与标准基因组序列进行精确的映射和定位，确定每个circRNA在基因组上的起始位置、终止位置和外显子组成等关键信息。通过序列比对，找出不同物种间具有高度相似性（通常设定一定的序列相似性阈值，如90%以上）的circRNA同源序列。以人类和小鼠为例，假设在人类基因组中鉴定出了1000个circRNA，在小鼠基因组中鉴定出了800个circRNA。通过序列比对和同源性检测，发现其中有200个circRNA在人类和小鼠中具有高度相似的序列，即它们是同源的circRNA。则人类和小鼠间circRNA的共享比例为200/min(1000,800)*100%=25%。这里采用min(1000,800)作为分母，是为了消除物种间circRNA数量差异对共享比例计算的影响，使得不同物种对之间的共享比例具有可比性。共享比例与物种亲缘关系密切相关。一般来说，物种亲缘关系越近，它们之间circRNA的共享比例越高。这是因为在进化过程中，亲缘关系近的物种从共同祖先继承了相似的基因序列和调控元件，circRNA作为基因表达的产物，也会在一定程度上保留相似性。例如，在灵长类动物中，人类与猴子的亲缘关系较近，它们之间circRNA的共享比例通常高于人类与小鼠等非灵长类动物之间的共享比例。研究表明，人类与黑猩猩的circRNA共享比例可高达90%以上，而人类与小鼠的circRNA共享比例则相对较低，通常在20%-30%左右。这种共享比例的差异反映了物种在进化过程中的分歧程度和遗传距离，为研究物种进化和circRNA的演化提供了重要线索。3.2.2功能注释分析对共享基因进行功能注释是深入探究环形RNA（circRNA）保守性与功能保留之间关系的关键步骤。功能注释过程主要借助于现有的基因功能数据库和生物信息学分析工具。常用的基因功能数据库包括GeneOntology（GO）、KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes（KEGG）等。GO数据库从生物过程、分子功能和细胞组成三个层面全面地对基因进行注释，为理解基因的生物学功能提供了系统的框架。KEGG数据库则侧重于基因参与的代谢途径和信号传导通路的注释，有助于揭示基因在生物体内的生理和病理过程中的作用机制。首先，利用BLAST等工具将共享的circRNA序列与数据库中的已知基因序列进行比对，找出与之同源的已知基因。将这些同源基因的功能注释信息转移到共享的circRNA上。例如，如果某个共享的circRNA与GO数据库中注释为“参与细胞增殖调控”的基因具有高度同源性，则可以初步推测该circRNA可能也参与细胞增殖调控相关的生物学过程。对于一些在数据库中没有直接同源基因的circRNA，可以通过分析其序列特征、与其他分子（如miRNA、蛋白质等）的相互作用关系等，利用生物信息学预测工具进行功能预测。如通过预测circRNA上的miRNA结合位点，结合miRNA的已知靶基因和功能，推测circRNA可能参与的生物学过程。通过对共享基因的功能注释分析，发现许多保守性较高的circRNA在不同物种中具有相似的功能。例如，在多个哺乳动物物种中保守存在的circRNA-CDR1as，在不同物种中都被证实可以作为miR-7的海绵，通过竞争性结合miR-7，调控miR-7下游靶基因的表达，参与神经系统发育、细胞增殖和分化等生物学过程。这表明circRNA在进化过程中，不仅序列保守性得以保留，其功能也具有一定的保守性。进一步分析发现，保守性与功能保留之间存在正相关关系。即circRNA的保守性越高，其在不同物种中保留相似功能的可能性越大。这是因为在进化选择压力下，具有重要生物学功能的circRNA序列更容易被保留下来，以维持物种的正常生理功能和生存适应性。3.3保守性与功能的关联高度保守的环形RNA（circRNA）在不同物种中往往具有相似的功能，这一现象揭示了circRNA在进化过程中功能的稳定性和重要性。以circRNA-CDR1as为例，它在人类、小鼠、大鼠等多种哺乳动物中都呈现出高度的保守性。在不同物种中，circRNA-CDR1as都能与miR-7特异性结合，充当miR-7的分子海绵。在神经系统发育过程中，circRNA-CDR1as通过吸附miR-7，解除miR-7对其靶基因的抑制作用，从而调控一系列与神经发育相关基因的表达，促进神经元的分化和成熟。这种在不同物种中功能的一致性表明，circRNA-CDR1as在神经系统发育中具有不可或缺的作用，其保守的序列和功能在进化过程中被严格保留下来，以确保神经系统正常发育这一基本生物学过程在不同物种中得以稳定实现。保守性对circRNA功能稳定性的影响主要体现在以下几个方面。首先，保守的序列为circRNA与其他分子（如miRNA、蛋白质等）的特异性相互作用提供了结构基础。circRNA上特定的序列模体（motif）决定了其能否与特定的miRNA或蛋白质结合，以及结合的亲和力和特异性。在进化过程中，这些关键的序列模体被高度保守地传承下来，保证了circRNA在不同物种中能够与相同或相似的分子相互作用，从而行使相似的功能。例如，circRNA上保守的miRNA结合位点能够精确地识别并结合特定的miRNA，形成稳定的RNA-RNA相互作用复合物，实现对miRNA活性的调控。其次，保守性有助于维持circRNA的二级和三级结构，进而稳定其功能。circRNA的结构对于其功能的发挥至关重要，不同的结构域可能参与不同的生物学过程。保守的序列在折叠过程中能够形成相似的二级结构（如茎环结构、发夹结构等）和三级结构（如空间构象），这些稳定的结构保证了circRNA在细胞内能够正确定位、与其他分子相互作用，并执行其生物学功能。例如，一些具有保守结构域的circRNA能够特异性地结合到细胞核内的特定区域，参与基因转录调控；而另一些具有特定结构的circRNA则在细胞质中与蛋白质结合，参与蛋白质的运输和定位等过程。此外，保守性使得circRNA在进化过程中能够逃避有害突变的积累，保持其功能的完整性。在物种进化过程中，基因组不断受到各种突变的影响，但对于具有重要功能的circRNA，自然选择会倾向于保留那些维持其功能的保守序列，淘汰有害突变。这使得保守的circRNA能够在长期的进化历程中保持相对稳定的功能，为物种的生存和繁衍提供保障。例如，如果某个circRNA在调控细胞周期进程中具有关键作用，其保守的序列能够确保在不同物种中都能准确地行使这一功能，避免因突变导致细胞周期紊乱，进而影响个体的发育和生存。四、哺乳动物环形RNA的功能分析4.1miRNA海绵机制4.1.1miRNA结合位点预测预测环形RNA（circRNA）上miRNA结合位点主要借助生物信息学方法，其过程和原理基于RNA-RNA相互作用的基本理论。首先，需要获取circRNA的完整序列信息，这些序列数据可从公共数据库（如circBase、NCBI等）中获取，也可通过对特定样本进行高通量测序并经过严格的生物信息学分析流程（包括数据预处理、circRNA识别和注释等）得到。在获取circRNA序列后，利用专门的miRNA结合位点预测工具，如TargetScan、PicTar和miRanda等。这些工具的原理大多基于miRNA与靶RNA之间的碱基互补配对原则。以TargetScan为例，它主要通过扫描circRNA序列，寻找与miRNA种子区域（通常为miRNA5'端的2-8个核苷酸）完全互补配对或具有高度互补性的序列片段。在匹配过程中，会考虑到碱基配对的稳定性、热力学参数以及结合位点在不同物种间的保守性等因素。对于具有较高保守性的结合位点，其与miRNA结合的可能性和生物学意义往往更大。例如，在对circRNA-CDR1as的研究中，通过TargetScan预测发现其序列上存在多个与miR-7种子区域高度互补的位点，这些位点在不同哺乳动物物种中具有较高的保守性，为后续验证其与miR-7的相互作用提供了重要线索。PicTar则采用更为复杂的算法，它不仅考虑miRNA种子区域的互补性，还综合分析整个miRNA与circRNA序列的配对情况，以及周围序列的结构特征和进化保守性。通过构建复杂的数学模型，PicTar能够更准确地预测miRNA在circRNA上的结合位点，并对不同结合位点的结合亲和力进行量化评估。miRanda工具则侧重于从热力学角度出发，计算miRNA与circRNA结合时的自由能变化，自由能越低，表明结合越稳定，结合位点的可靠性越高。通过综合运用这些工具，可以更全面、准确地预测circRNA上的miRNA结合位点，为深入研究circRNA的miRNA海绵机制奠定基础。4.1.2海绵作用验证实验为了验证环形RNA（circRNA）对miRNA的海绵作用，通常采用荧光素酶报告基因实验等方法，这些实验设计精巧，能够直观地揭示两者之间的相互作用关系。以荧光素酶报告基因实验为例，首先构建荧光素酶报告基因载体。将circRNA中预测含有miRNA结合位点的序列克隆到荧光素酶报告基因的3'UTR（非翻译区）下游，同时设置阴性对照，如将结合位点进行突变或使用不含结合位点的序列。将构建好的报告基因载体与相应的miRNAmimic（模拟内源性miRNA的双链RNA分子）或miRNAinhibitor（抑制miRNA活性的反义寡核苷酸）共转染到合适的细胞系中，常用的细胞系包括HEK293T细胞、HeLa细胞等。在细胞内，若circRNA能够与miRNA结合，形成RNA-RNA复合物，那么miRNA就无法正常结合到荧光素酶报告基因的3'UTR上，从而解除对荧光素酶表达的抑制作用。转染一定时间（通常为48-72小时）后，收集细胞，使用荧光素酶检测试剂盒检测细胞内荧光素酶的活性。如果实验组（共转染circRNA报告基因载体和miRNAmimic）的荧光素酶活性显著高于阴性对照组（如共转染突变结合位点的报告基因载体和miRNAmimic），则表明circRNA能够有效地吸附miRNA，发挥海绵作用，解除miRNA对荧光素酶报告基因的抑制，使得荧光素酶表达增加，荧光信号增强。例如，在对circHIPK3的研究中，通过将circHIPK3中与miR-124结合位点的序列克隆到荧光素酶报告基因载体中，并与miR-124mimic共转染HEK293T细胞。结果显示，实验组的荧光素酶活性明显高于对照组，有力地证明了circHIPK3可以作为miR-124的海绵，结合miR-124并抑制其活性。除了荧光素酶报告基因实验，还可以结合其他实验方法进一步验证。如RNA免疫沉淀（RIP）实验，利用AGO2抗体（AGO2是miRNA-RISC复合物的核心组成部分）进行免疫沉淀，将与miRNA结合的RNA复合物沉淀下来。通过qPCR检测沉淀中的circRNA含量，如果circRNA能够与miRNA结合形成复合物，那么在AGO2免疫沉淀复合物中应该能够检测到较高水平的circRNA，从而间接证明circRNA与miRNA之间的相互作用。还可以进行RNApull-down实验，将生物素标记的miRNA与细胞裂解液孵育，然后使用链霉亲和素磁珠捕获与miRNA结合的RNA，通过qPCR或RNA测序鉴定捕获到的circRNA，进一步验证两者的结合关系。通过多种实验方法的综合运用，可以更全面、可靠地验证circRNA对miRNA的海绵作用。4.2蛋白质相互作用4.2.1互作蛋白筛选利用RNA免疫沉淀（RIP）、蛋白质印迹（Westernblot）等技术筛选与环形RNA（circRNA）相互作用的蛋白质，实验流程严谨且相互关联。RNA免疫沉淀（RIP）实验是筛选互作蛋白的关键技术之一。首先，准备针对目标circRNA结合蛋白的特异性抗体。这些抗体可以是商业化的抗体，也可以通过免疫动物制备得到。将细胞裂解，释放出细胞内的RNA-蛋白质复合物。在裂解过程中，需要使用合适的裂解缓冲液，以保证复合物的完整性，同时加入RNase抑制剂，防止RNA被降解。将细胞裂解液与特异性抗体孵育，抗体能够特异性地识别并结合目标蛋白，形成抗体-蛋白-RNA复合物。加入ProteinA/G磁珠，磁珠能够与抗体结合，从而将抗体-蛋白-RNA复合物富集沉淀下来。通过多次洗涤磁珠，去除未结合的杂质。使用蛋白酶K消化复合物中的蛋白质，释放出与目标蛋白结合的RNA。对释放的RNA进行纯化，然后通过qPCR或RNA测序技术，检测其中是否存在目标circRNA。如果检测到circRNA，则表明目标蛋白与circRNA存在相互作用。蛋白质印迹（Westernblot）技术则用于进一步验证和鉴定互作蛋白。在RIP实验获得与circRNA结合的蛋白质复合物后，将复合物进行SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离。SDS-PAGE能够根据蛋白质的分子量大小将其分离开来，使不同的蛋白质在凝胶上呈现出不同的条带。通过电转印技术，将凝胶上的蛋白质转移到固相膜（如PVDF膜或NC膜）上。将膜与一抗孵育，一抗能够特异性地识别目标互作蛋白。加入二抗，二抗能够与一抗结合，并带有可检测的标记（如HRP辣根过氧化物酶）。通过底物显色（如ECL化学发光法）或荧光成像等方法，检测膜上与目标互作蛋白对应的条带。如果在膜上检测到特异性条带，则进一步证实了目标蛋白与circRNA的相互作用，并可以通过与已知分子量标准蛋白对比，确定互作蛋白的分子量大小。还可以结合RNApull-down实验进行互作蛋白的筛选。将体外转录并标记的circRNA与细胞裂解液孵育，circRNA会与细胞内与之相互作用的蛋白质结合。使用链霉亲和素磁珠捕获标记的circRNA及其结合的蛋白质复合物，经过洗涤去除未结合的杂质后，对捕获的蛋白质进行SDS-PAGE分离和蛋白质鉴定（如质谱分析），从而全面地筛选出与circRNA相互作用的蛋白质。4.2.2对蛋白质功能的影响环形RNA（circRNA）与蛋白质相互作用后，能够对蛋白质的功能产生多方面的调节作用，深刻影响细胞的生物学过程。在蛋白质定位方面，circRNA可以改变蛋白质在细胞内的分布位置。例如，某些circRNA与信号转导蛋白相互作用后，能够调控其从细胞质向细胞核的转运过程。研究发现，circRNA-ANRIL可以与转录因子E2F1结合，影响E2F1在细胞核内的积累和活性。在正常情况下，E2F1在细胞核内发挥促进细胞周期进程的作用。当circRNA-ANRIL与E2F1结合后，阻碍了E2F1向细胞核的转运，使其滞留在细胞质中，无法正常激活下游与细胞周期相关基因的转录，从而抑制细胞周期的进展，对细胞的增殖和分化产生影响。在蛋白质活性调节方面，circRNA能够直接或间接地影响蛋白质的酶活性、结合活性等。以酶活性为例，一些circRNA可以作为蛋白质的别构调节剂，与酶结合后，改变酶的空间构象，从而影响酶的催化活性。在代谢途径中，circRNA可能与关键代谢酶相互作用，调节其活性，进而影响整个代谢通路的通量。如circRNA可以与参与糖代谢的酶结合，改变其对底物的亲和力和催化效率，调控糖代谢的速率，维持细胞内能量平衡。在蛋白质结合活性方面，circRNA可以影响蛋白质与其他分子的相互作用。例如，circRNA与转录因子相互作用后，可能改变转录因子与DNA结合位点的亲和力，影响基因的转录起始和延伸过程，进而调控基因表达。circRNA还可以通过与蛋白质相互作用，调节蛋白质之间的相互作用网络，影响信号传导通路的激活和传递。例如，在细胞增殖信号通路中，circRNA与通路中的关键信号蛋白结合，干扰其与上下游蛋白的相互作用，阻断信号传导，抑制细胞的增殖。4.3转录调控4.3.1对基因转录的影响环形RNA（circRNA）在细胞核内对基因转录过程发挥着重要的调控作用，其调控机制复杂且精细。circRNA可以通过与转录因子相互作用，影响转录因子与DNA的结合能力，从而调控基因转录的起始。一些circRNA能够特异性地结合到转录因子上，改变转录因子的空间构象，使其无法正常识别和结合到基因启动子区域的顺式作用元件上。研究表明，circRNA-EIF3J可以与转录因子SP1结合，抑制SP1与基因启动子区域的结合，从而下调相关基因的转录水平。在细胞周期调控相关基因的转录过程中，circRNA-EIF3J与SP1的结合导致SP1无法激活细胞周期相关基因的转录，使细胞周期进程受到抑制。circRNA还可以通过与RNA聚合酶Ⅱ相互作用，影响转录的延伸和终止。circRNA可能与RNA聚合酶Ⅱ形成复合物，改变其在DNA模板上的移动速度和稳定性，进而影响转录的效率和准确性。在某些基因的转录过程中，circRNA与RNA聚合酶Ⅱ结合后，阻碍了其沿着DNA模板的顺利移动，导致转录延伸受阻，基因转录产物的合成减少。circRNA还可能参与转录终止的调控，影响转录终止信号的识别和转录复合物的解离，从而影响基因转录的完整性。circRNA还可以通过调节染色质的结构和状态来间接影响基因转录。染色质的开放性和可及性是基因转录的重要前提，circRNA可以与染色质修饰酶或染色质重塑复合物相互作用，改变染色质的修饰状态和结构，进而调控基因转录。例如，circRNA可以招募组蛋白修饰酶，使特定基因区域的组蛋白发生甲基化、乙酰化等修饰，改变染色质的松紧程度，影响转录因子和RNA聚合酶与DNA的结合，从而调控基因转录。在胚胎干细胞分化过程中，circRNA通过调节染色质修饰，影响与分化相关基因的转录，促进细胞向特定方向分化。4.3.2相关调控元件分析环形RNA（circRNA）上参与转录调控的顺式作用元件和反式作用因子种类繁多，它们共同构成了复杂的调控网络，精细地调节着基因表达。在顺式作用元件方面，circRNA上存在一些特殊的序列模体（motif），这些模体可以与转录因子或其他调控蛋白特异性结合，从而影响circRNA自身的转录以及其对其他基因转录的调控。例如，一些circRNA上含有富含GC的序列模体，这些模体可以与转录因子SP1等结合，促进circRNA的转录。在某些基因座上，circRNA的转录起始位点附近存在特定的顺式作用元件，它们可以招募RNA聚合酶Ⅱ及相关转录因子，启动circRNA的转录过程。circRNA上还可能存在一些增强子样元件或沉默子样元件，这些元件可以通过与其他调控蛋白相互作用，远距离调控基因的转录。增强子样元件可以增强基因转录的活性，而沉默子样元件则可以抑制基因转录。反式作用因子在circRNA介导的转录调控中也起着关键作用。转录因子是一类重要的反式作用因子，它们可以识别并结合circRNA上的顺式作用元件，调控circRNA的转录以及circRNA对其他基因转录的影响。除了转录因子，一些非编码RNA结合蛋白（RBPs）也参与了circRNA的转录调控。这些RBPs可以与circRNA相互作用，影响circRNA的结构和功能，进而调节转录过程。例如，某些RBPs可以与circRNA结合，促进circRNA与转录因子或RNA聚合酶Ⅱ的相互作用，增强转录活性；而另一些RBPs则可能抑制circRNA与相关调控蛋白的结合，抑制转录。circRNA还可以通过与其他非编码RNA（如lncRNA、miRNA等）相互作用，形成复杂的RNA-RNA网络，共同调控转录过程。例如，circRNA可以与lncRNA相互作用，通过竞争结合相同的转录因子或调控蛋白，影响基因转录。circRNA与miRNA的相互作用也可能间接影响转录调控，如circRNA作为miRNA海绵，调节miRNA的活性，进而影响miRNA对其靶基因转录因子的调控作用，最终影响基因转录。通过对circRNA上顺式作用元件和反式作用因子的深入研究，可以更全面地揭示circRNA在转录调控中的分子机制。4.4在细胞过程中的功能4.4.1细胞增殖与分化环形RNA（circRNA）对细胞增殖和分化过程具有重要影响，其作用机制主要通过调控相关信号通路来实现。在细胞增殖方面，许多circRNA参与了细胞周期的调控。例如，circRNA-circ-FOXO3被发现能够与细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）和细胞周期蛋白A2（CCNA2）结合，形成三元复合物。在正常细胞增殖过程中，CDK2与CCNA2结合形成活性复合物，促进细胞从G1期进入S期。然而，当circ-FOXO3存在时，它与CDK2和CCNA2结合，抑制了CDK2-CCNA2复合物的活性，从而阻碍细胞周期的进程，抑制细胞增殖。研究表明，在肿瘤细胞中，下调circ-FOXO3的表达可以解除对CDK2-CCNA2复合物的抑制，促进肿瘤细胞的增殖；而在正常细胞中，过表达circ-FOXO3则可以抑制细胞的过度增殖，维持细胞的正常生长平衡。circRNA还可以通过调控生长因子信号通路来影响细胞增殖。例如，在表皮生长因子（EGF）信号通路中，circRNA-circ-EGFR可以与EGFR的mRNA相互作用，影响EGFR的表达和稳定性。当circ-EGFR与EGFRmRNA结合后，可能促进EGFRmRNA的降解，降低EGFR的表达水平。EGFR是EGF信号通路的关键受体，其表达水平的降低会减弱EGF信号的传导，抑制细胞的增殖。在乳腺癌细胞中，下调circ-EGFR的表达可以增加EGFR的表达，激活EGF信号通路，促进肿瘤细胞的增殖；而在正常乳腺上皮细胞中，circ-EGFR的正常表达可以维持EGF信号通路的适度激活，保证细胞的正常生长和分化。在细胞分化方面，circRNA也发挥着不可或缺的作用。以神经干细胞分化为例，circRNA-ciRS-7在神经干细胞向神经元分化过程中表达上调。ciRS-7可以作为miR-7的海绵，结合miR-7，解除miR-7对其靶基因的抑制作用。miR-7的靶基因中包含一些与神经分化相关的转录因子和信号分子，如PTEN等。当ciRS-7结合miR-7后，PTEN的表达增加，激活下游的PI3K-AKT信号通路，促进神经干细胞向神经元的分化。研究表明，在体外培养的神经干细胞中，过表达ciRS-7可以显著增加神经元的分化比例；而敲低ciRS-7则会抑制神经干细胞的分化，导致神经元生成减少。4.4.2细胞凋亡与应激反应环形RNA（circRNA）在细胞凋亡和应对氧化应激、热应激等过程中发挥着重要的功能，其作用机制复杂且多样。在细胞凋亡方面，circRNA可以通过调控凋亡相关信号通路来影响细胞的命运。例如，circRNA-circ-BIRC6在多种细胞类型中被发现与细胞凋亡密切相关。circ-BIRC6可以与凋亡抑制蛋白BIRC6的mRNA相互作用，稳定BIRC6的mRNA，增加BIRC6的表达水平。BIRC6是凋亡抑制蛋白家族的成员，能够抑制细胞凋亡信号通路的激活。当circ-BIRC6上调时，BIRC6的表达增加，抑制了caspase等凋亡执行蛋白的活性，从而抑制细胞凋亡。在肿瘤细胞中，circ-BIRC6的高表达可能赋予肿瘤细胞抗凋亡能力，促进肿瘤的生长和发展；而在正常细胞中，circ-BIRC6的适度表达可以维持细胞的存活和正常生理功能。circRNA还可以通过调节线粒体功能来影响细胞凋亡。线粒体是细胞凋亡的关键调控细胞器，circRNA可以与线粒体相关蛋白或RNA相互作用，影响线粒体的膜电位、活性氧（ROS）产生和凋亡相关蛋白的释放。例如，circRNA-circ-HIF1A五、案例分析5.1疾病相关案例5.1.1癌症中的环形RNA在癌症领域，环形RNA（circRNA）展现出与肿瘤发生、发展及转移密切相关的特性，为癌症研究提供了全新的视角和潜在的诊疗靶点。以肝癌为例，中南大学夏赞贤团队在肝细胞癌研究中取得重要进展。他们通过高通量测序及生物信息学数据挖掘，发现环状RNAcircMDK在肝癌组织和细胞中高表达。进一步研究揭示，circMDK存在m6A甲基化修饰，这种修饰使其能够招募m6AReader蛋白IGF2BP1，从而提高自身转录水平的稳定性，这也是circMDK在肝癌中上调的部分原因。生物信息学分析与实验验证表明，circMDK可通过海绵吸附miR-346和miR-874-3p，解除这两种miRNA对共同靶向基因ATG16L1的抑制作用，进而促进肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。这一发现为深入理解肝癌的发病机制提供了新的线索，也为肝癌的治疗提供了潜在的靶点，如开发针对circMDK的靶向治疗策略，可能为肝癌患者带来新的希望。中国科学院北京生命科学研究院赵方庆团队对肝细胞性肝癌（HCC）中circVAMP3的研究也具有重要意义。研究人员通过对20对肝癌及癌旁样本的RNA-seq数据挖掘，筛选出在肝癌中表达显著下调且母本基因变化不大的circVAMP3。circVAMP3由VAMP3基因的第3、4外显子反向剪接成环，与线性VAMP3基因表达模式截然不同，且与患者预后显著相关。功能实验证实，circVAMP3具有抑制HCC细胞增殖和迁移的作用。在机制研究方面，circVAMP3可作为分子骨架与CAPRIN1蛋白的RGG结构域结合，招募CAPRIN1-G3BP1复合物，促使蛋白聚集并发生相分离，在细胞中促进应激颗粒的形成。进一步研究发现，circVAMP3通过应激颗粒抑制c-MycmRNA的翻译，从而抑制肝癌细胞的增殖和迁移。这一研究首次证实了环形RNA可以通过发挥分子骨架的功能促进相分离形成，进而调控肿瘤的增殖与迁移过程，为恶性肿瘤的研究提供了新的分子标志物和治疗靶点，也为肝癌的诊断和预后判断提供了新的思路，如可将circVAMP3作为肝癌诊断和预后评估的指标之一。在胰腺癌研究中，也有众多关于circRNA的重要发现。上海交通大学医学院瑞金医院沈柏用教授团队发现circPDK1在胰腺癌（PC）肿瘤组织和血清外泌体中高度丰富，且与PC不良生存率相关。研究表明，缺氧可增加PC细胞的外泌体分泌，circPDK1是PC中上调最多的circRNA。机制研究发现，HIF1A通过激活宿主基因PDK1上调circPDK1，circPDK1通过调节miR-628-3p/BPTF轴和降解BIN1激活c-myc，从而促进PC细胞的增殖、迁移和糖酵解。外泌体circPDK1在体外和体内均能显著促进PC细胞的相关恶性行为。这一研究表明外泌体circPDK1可能是PC诊断和预后的潜在生物标志物和治疗靶点，为胰腺癌的早期诊断和治疗提供了新的方向，如通过检测血清外泌体中circPDK1的水平来辅助胰腺癌的早期诊断。另一项关于胰腺癌的研究中，发现CircEYA3在胰腺导管腺癌（PDAC）组织和细胞中水平升高，且与PDAC患者预后密切相关。功能上，CircEYA3通过增加ATP合成促进能量产生，进而在体外和体内促进PDAC的进展。机制上，CircEYA3作为内源性miR-1294海绵，上调c-Myc的表达，发挥其致癌作用。这一发现为PDAC的预后预测和治疗提供了新的生物标志物和潜在靶点，如针对CircEYA3-miR-1294-c-Myc轴开发靶向治疗药物，有望为胰腺癌患者提供更有效的治疗手段。5.1.2神经系统疾病中的环形RNA在神经系统疾病领域，环形RNA（circRNA）的异常表达与功能失调在阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等疾病的发病机制中扮演着关键角色，为深入理解这些复杂疾病的病理过程提供了新的线索和潜在的治疗靶点。在阿尔茨海默病研究中，上海交通大学基础医学院王昊教授与上海中医药大学陈红专教授联合团队发现环状RNA分子circCwc27在AD脑库和AD模型小鼠脑中高表达。深入的机制研究表明，circCwc27通过与DNA/RNA结合蛋白Pur-α结合，将其滞留于细胞质中，阻碍Pur-α入核与下游AD相关基因启动子结合。这一过程促进了APP转录，导致β淀粉样蛋白（Aβ）生成增加，同时抑制了学习记忆相关基因转录，从而参与AD的发病机制。在AD模型小鼠脑内干扰circCwc27表达后，可显著缓解Aβ蛋白相关AD病理，减少胶质细胞活化和炎症因子释放，减轻突触功能损伤，改善学习记忆功能。这一研究成果为AD的治疗提供了新的潜在靶点，如开发针对circCwc27的干扰技术或药物，可能成为治疗AD的新策略。美国华盛顿大学医学院CarlosCruchaga教授研究团队对AD患者中circRNA的差异表达及其与AD临床和神经病理学严重程度的关系进行了全circRNA转录组分析。通过对两个独立的RNA-seq数据库中circRNA数据的调用和量化，研究人员发现circRNA的表达与AD的诊断、临床痴呆的严重程度和神经病理学的严重程度之间存在显著相关性。大多数circRNA-AD相关性与同源线性mRNA的表达或预估的脑细胞类型比例的变化无关，且某些circRNA的表达变化在AD的不同皮质区域具有一致性。研究还发现，在AD症状出现之前，circRNA在多个皮层区域表达已发生早期变化，且在常染色体显性遗传AD样本中同样存在circRNA表达变化。这表明circRNA有望成为AD临床早期诊断的新靶标，为AD的早期诊断提供了新的生物标志物，如通过检测特定circRNA的表达水平来实现AD的早期筛查和诊断。在帕金森病研究中，北京大学基础医学院张卫光教授团队揭示了circRNA分子circSV2b在PD发病过程中的重要作用及其作用机制。通过RNA测序，在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD小鼠模型中检测到33种差异表达的circRNA，进一步筛选和验证发现circSV2b在PD小鼠中显著下调。功能研究表明，circSV2b能够竞争性结合microRNA-5107-5p（miR-5107-5p），缓解其对靶基因Foxk1表达的抑制。Foxk1作为重要的转录因子，通过调控Akt1的转录影响细胞的氧化应激反应。因此，circSV2b通过这一机制正向调控Akt1的转录，进而抵抗氧化应激损伤。在PD小鼠中过表达circSV2b能够通过ceRNA-Akt1轴抵抗氧化应激损伤，改善PD小鼠的运动障碍和神经元损伤。此外，血清外泌体中circSV2b的显著变化有望成为PD诊断和治疗的新型生物标志物，通过检测血清外泌体中circSV2b的水平，可实现对PD的早期诊断、病情监测和疗效评估，为PD的临床诊断和治疗提供了新的手段。5.2发育相关案例在小鼠胚胎发育过程中，环形RNA（circRNA）呈现出动态变化的表达模式，在胚胎发育的关键节点发挥着不可或缺的调控作用，对深入理解胚胎发育的分子机制具有重要意义。中国科学院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲课题组、李劲松课题组及中国科学院上海营养与健康研究所杨力课题组通力合作，首次建立了特异敲低环形RNA的CRISPR-RfxCas13d/BSJ-gRNA系统，并利用此系统开展环形RNA的功能筛选研究，发现了一系列影响细胞增殖和参与小鼠胚胎植入前发育的环形RNA分子。在小鼠胚胎植入前发育阶段，研究人员通过该筛选体系鉴定出首个参与此过程的环形RNA。在胚胎发育早期，细胞增殖和分化迅速，circRNA的表达谱也随之发生显著变化。例如，一些circRNA在受精卵向囊胚发育的过程中表达上调，可能参与调控细胞周期相关基因的表达，