药品检验检测方法验证指南（试行）

药品检验检测方法验证指南（试行）1目的与适用范围本指南为药品注册申报、生产过程质量控制、成品放行检验、检验方法变更后确认等环节的药品检验检测方法验证提供统一技术指导，规范验证工作流程，保证检验结果准确可靠。本指南适用于化学药、中药与天然药物、生物制品中各类检验项目的方法学验证，包括鉴别试验、杂质检查、含量测定、溶出/释放度测定、物理常数测定、指纹图谱测定、生物学活性测定等。凡符合以下情形之一的检验方法，均应按照本指南开展验证：新建立的非法定检验方法；法定方法超出原规定适用范围；法定方法发生实验室条件下的参数调整；处方工艺、原料来源发生变更后，原有检验方法需要确认适用性的。2验证基本要求验证实施前需完成前置准备工作，满足以下要求后方可开展试验：（1）检验方法已完成开发研究，明确方法原理、操作流程、系统适用性参数要求，所有操作步骤形成规范的SOP初稿；（2）预先起草验证方案，明确验证项目、试验设计、可接受标准、人员职责、数据处理要求，验证方案需经企业技术负责人或质量负责人签字批准后方可实施；（3）所用仪器设备经计量检定/校准合格，关键性能参数（如色谱柱理论板数、天平精度、紫外检测器波长准确度）符合方法要求，确认状态正常；（4）所用试剂、试药、溶剂符合分析级别要求，对纯度有要求的需使用色谱纯或基准级；对照品优先使用中检院等法定机构提供的法定对照品，自行制备的工作对照品需完成全项标定，纯度、水分、杂质含量符合要求，标定结果满足使用要求；（5）试验人员经方法操作培训考核合格，熟悉方法原理和操作要点；（6）所有验证试验开展前需先进行系统适用性试验，系统适用性不符合要求的，试验数据无效。色谱法系统适用性通用要求为：主峰理论板数不低于方法规定值，拖尾因子控制在0.9~1.2之间，相邻峰分离度符合要求，连续进样5针，主峰面积相对标准偏差（RSD）≤2.0%。3验证项目与技术要求3.1专属性专属性是指在其他潜在成分（如辅料、杂质、降解产物、中间体）存在的情况下，方法能够准确、特异性区分或测定目标物的能力，是方法可靠性的基础。试验设计要求：（1）鉴别试验：制备不含目标物的阴性样品（如制剂的空白辅料混合物、原料药的杂质混合样品），同时制备含目标物的阳性样品，分别按照方法操作，考察结果的特异性；（2）含量测定与杂质测定：需开展强制降解试验，考察降解条件下主成分与杂质的分离情况，强制降解条件一般包括：酸降解（0.1~1mol/L盐酸，室温或加热放置）、碱降解（0.1~1mol/L氢氧化钠）、氧化降解（3%~30%过氧化氢）、高温降解（60~105℃放置）、光照降解（4500lx±500lx放置），降解程度控制为主成分降解5%~20%，避免过度降解影响杂质分离考察；分别测定降解前后样品，考察目标峰的纯度与分离度。可接受标准：（1）鉴别试验：阴性样品无阳性响应，阳性样品检出目标物，结果判断明确；（2）含量测定：色谱法要求主成分峰与相邻杂质峰分离度≥1.5，主成分峰纯度符合要求（纯度因子不低于990，无其他成分共流出）；容量法要求空白滴定消耗体积不超过被测样品消耗体积的1%，无基质干扰；（3）杂质测定：所有已知杂质、未知杂质与主峰及其他相邻杂质的分离度≥1.5，不干扰杂质检出与定量。3.2准确度准确度指测定结果与真实值或参考值的接近程度，一般用加样回收率表示，反映方法的系统误差。试验设计要求：采用加样回收法，在空白基质中加入已知量的被测物，按照方法操作测定，计算回收率。对于含量测定，一般制备3个浓度水平，分别为限度浓度的80%、100%、120%，每个浓度平行制备3份供试品；对于杂质定量测定，浓度范围覆盖定量限至限度的120%，一般设置定量限、100%限度、120%限度3个浓度，每个浓度平行测定3份；对于基准容量法，直接用基准物质测定回收率。可接受标准（按被测物含量水平划分）：（1）含量≥100%（原料药含量）：回收率98.0%~102.0%，RSD≤2.0%；基准容量法要求回收率99.7%~100.3%，RSD≤0.2%；（2）1%≤含量<100%：回收率95.0%~105.0%，RSD≤2.0%；（3）0.1%≤含量<1%：回收率90.0%~108.0%，RSD≤5.0%；（4）0.05%≤含量<0.1%：回收率80.0%~115.0%，RSD≤10.0%；（5）含量<0.05%：回收率70.0%~130.0%，RSD≤20.0%；杂质测定的可接受标准与同含量水平要求一致。3.3精密度精密度指在相同条件下对同一均匀供试品多次测定结果的接近程度，反映方法的随机误差，分为重复性、中间精密度、重现性三个层级。3.3.1重复性：指同一试验人员、同一仪器、相同试验条件下，短时间内连续测定的精密度。试验设计：与准确度试验一致，采用3浓度3份共9个测定结果，或直接对100%限度浓度的供试品平行测定10份，计算RSD。可接受标准与同含量水平的准确度RSD要求一致。3.3.2中间精密度：指同一实验室，不同试验人员、不同仪器、不同日期测定的精密度，考察日常检验中随机因素对结果的影响。试验设计：对同一均匀供试品，由不同人员在不同日期使用不同仪器测定，至少获得6个独立测定结果，或按照3浓度3份设计由不同人员完成试验，计算合并RSD。可接受标准：含量≥1%的合并RSD≤3.0%，0.1%≤含量<1%的合并RSD≤8.0%，含量<0.1%的合并RSD≤15.0%。3.3.3重现性：指不同实验室之间测定的精密度，用于注册申报、方法推广等场景。试验设计：由至少2家不同实验室按照相同方法对同一批供试品测定，计算不同实验室结果的RSD。可接受标准：含量≥1%的RSD≤4.0%，含量<1%的RSD≤15.0%。3.4线性与范围线性指被测物浓度（或量）与方法响应值之间呈线性关系的程度；范围指能够满足准确度、精密度要求的被测物浓度区间。试验设计要求：至少设置5个浓度梯度，覆盖预定范围的80%~120%，每个浓度至少测定2次，以浓度为横坐标、响应值为纵坐标绘制线性曲线，计算回归方程、相关系数（r）、截距，必要时开展残差分析评估线性偏差。可接受标准：含量测定中，紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法相关系数r≥0.9990，容量滴定法r≥0.9995；杂质测定中，含量范围大于100倍的r≥0.990，含量范围小于100倍的r≥0.995；截距绝对值不超过100%浓度水平响应值的2.0%，避免截距对定量结果产生显著影响。范围要求：含量测定范围至少为标示量的80%~120%；溶出度测定范围至少为标示量的70%~130%，缓释/控释制剂释放度范围至少为标示量的10%~125%；杂质测定范围至少为定量限到杂质限度的120%；鉴别试验不需要验证线性与范围。3.5检测限与定量限检测限（LOD）指方法能够检出目标物的最低浓度，不需要准确定量；定量限（LOQ）指方法能够准确定量目标物，且满足准确度、精密度要求的最低浓度，仅杂质检查需要验证该项目。常用方法为信噪比法：空白溶剂进样测定基线噪声，逐步降低供试品浓度，信噪比S/N=3时对应的浓度为LOD，S/N=10时对应的浓度为LOQ；采用标准偏差法计算时，公式为LOD=3.3σ/S，LOQ=10σ/S，其中σ为空白基质响应值的标准偏差，S为线性回归方程的斜率。可接受标准：根据ICHQ3A/Q3B要求，原料药杂质报告阈值为0.05%，制剂杂质报告阈值为0.1%，制剂日剂量大于2g时报告阈值为0.05%；要求LOD不高于报告阈值的30%，LOQ不高于报告阈值，且LOQ水平下测定的回收率、精密度符合对应含量水平的要求。3.6耐用性耐用性指方法参数发生微小变动时，测定结果不受影响的耐受能力，用于明确方法参数的控制要求，保证日常检验结果稳定。试验设计：针对方法中关键参数设置合理变动幅度，每次变动一个参数，考察结果的变化，常用参数变动幅度：流动相有机相比例变动±5%，流动相pH变动±0.2，色谱柱柱温变动±5℃，流速变动±0.2ml/min，检测波长变动±5nm，样品提取时间变动±5min，展开剂温度湿度变动±5%RH、±2℃。可接受标准：参数变动后，系统适用性符合要求，目标峰分离度≥1.5，含量测定结果偏差≤2.0%，杂质测定结果绝对值偏差≤0.1%，回收率、精密度符合原要求，即为耐用性合格；若某一参数变动后结果不符合要求，需在正式方法中明确该参数的严格控制范围，如“流动相pH控制为4.0±0.1”。4不同类型检验项目的验证组合要求不同检验项目无需开展全部验证项目，可根据项目类型选择对应验证项目，具体组合要求如下：（1）鉴别试验：验证项目为专属性、耐用性，无需验证准确度、精密度、线性、范围、检测限、定量限；（2）杂质限度检查（仅判断是否符合限度要求，不输出定量结果）：验证项目为专属性、检测限、耐用性，无需验证准确度、精密度、线性、定量限；（3）杂质定量测定：验证项目为专属性、准确度、精密度、线性、范围、定量限、检测限、耐用性，需全项目验证；（4）含量测定（原料药含量、制剂含量、溶出/释放度测定）：验证项目为专属性、准确度、精密度、线性、范围、耐用性，无需验证检测限、定量限；（5）物理常数测定（熔点、比旋度、pH、折光率）：验证项目为专属性、准确度、精密度、耐用性，无需验证线性、范围；（6）中药指纹图谱：验证项目为专属性、精密度、稳定性、耐用性、相似度，多成分定量指纹图谱需增加每个成分的准确度、线性验证。5验证结果判定与报告要求5.1结果判定：所有验证项目结果均符合预先设定的可接受标准，判定方法验证通过，该方法可用于预定用途；若单个项目不符合要求，需分析原因，调整方法参数后重新验证相关项目；若方法原理发生变更，需重新开展全项目验证。5.2验证报告要求：验证完成后需出具正式验证报告，内容包括：①方法概述，明确方法原理、操作流程；②验证依据与验证方案编号；③试验条件，包括仪器信息、对照品信息、试剂试药信息、试验人员与日期；④每个验证项目的原始数据、统计分析结果、图谱附件；⑤每个项目是否符合可接受标准的结论；⑥最终验证结论，明确方法是否适用；⑦质量负责人签字批准。已验证的方法在日常使用过程中，每年需开展一次方法性能确认，比对系统适用性、已知杂质含量、含量测定结果，确认方法性能稳定；若发生仪器重大变更、场地搬迁、处方工艺重大变更，需重新开展方法验证。6特殊类型药品检验方法的验证要求6.1中药与天然药物：①薄层鉴别：专属性要求阴性对照无干扰，斑点清晰；耐用性要求不同展开温度、湿度条件下，目标斑点Rf值偏差≤0.05，斑点清晰可辨；②指纹图谱：精密度要求共有峰相对保留时间RSD≤1%，相对峰面积RSD≤3%；耐用性要求参数变动后所有共有峰均能检出，相似度≥0.9；③多成分定量测定：每个目标成分均需单独验证线性、准确度、精密度，符合对应含量要求的可接受标准。6.2生物制品：①生物学活性测定：准确度要求回收率90%~110%，重复性RSD≤10%，中间精密度RSD≤15%；②SEC-HPLC