T-CVMA 289-2025 抗猪SIgA单克隆抗体的制备及纯化操作规程

T/CVMA289—2025抗猪SIgA单克隆抗体的制备及纯化操作规程Operatingprocduresforpreparationandpurificationofmonoclonal2025-9-30发布2025-9-30实施中国兽医协会发布I请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利本文件起草单位：兆丰华生物科技（福州）有限公司、兆丰华生物科技（南SIgA是由2个单体IgA、J链和分泌片（1本文件规定了利用BALB/c雌性小鼠（SPF级）进行抗猪SIgA单克隆抗体的制备、纯化的要求。2规范性引用文件GB/T35892实验动物福利抗SIgA抗体：抗猪SIgA单克隆抗体（MonoclonalantibodyagainstporciSIgA：分泌型免疫球蛋白A（Secretoryimmuno5主要试验材料5.2试剂与耗材5.2.1抗原。pET32a-SC重组蛋白，制备方法见附录A。25.2.4离心管（1.5mL，无菌）。5.2.8细胞培养板（6孔、24孔、485.2.9细胞计数板。5.2.21ProteinG亲和层析柱。3强免疫，当抗体滴度大于105时，融合前2~3d腹腔注射抗原，1007.2.1取上述免疫合格的小鼠，消毒处理后，无菌采集脾脏组织，对脾脏用不含血7.4.1将上述处理好的B细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞按照4:1~5:1的数量比例混匀后，150g离心），），4及亚克隆。将筛选鉴定为阳性的克隆细胞再按照采用免疫荧光试验（以下简称“IFA”）将上述标记的荧光判定为阳性，未出现绿色荧光判定为阴性。IFA检测），8抗SIgA抗体的纯化滤管进行浓缩置换处理，抗体浓度≥1mg/mL，无菌过滤后，-80℃保存，保存期1年。5A.1免疫用抗原基因片段参考序列（SC1，Ge5’GAATTCAAGCTTTTATTTACTGCCACCGCCCTGACCCACACTACACCACTACCGCTTGCCGGACCTTCGCCATCTTTAACTGCGCGATCTTCTGCAATCAGAATCCAGCAGCACTTCATTTTCGGTTTCGCGTGCACGCGGTTCAATGGCATCTGGGCTGCATTTGCCAGGCGTGCATCGCCGCTACCTTTTGCTTTCTGTTCAACTGCAACATACCGCCGGTTTCACCATAATGCAGGCCATCTTTCACACCGCACCAATACCAACCTTCGTCTGAACCGGATTCAGATTCAGGCTGATGATCTGAGATTTTTTATCACAATTAACAATGACCTTCATCCTGGCTCGGCAGGGCGCGACAACCGGTATTGCTCCACTTGCACCAATATGTAACTATAAAATTTGCACGGAAAATGACAGCTCAGTTTCAGGGTTTCGCCAACCCATGCGGCATTTTCCGGCAGTTTCAGATTCGGTTCGCCTTCAACAATTTTCAGTTCAACGGGACTATCTTCATTGGTCAGGCACCAATAAAAGCCTGCATCACGATTGGTCAGCTGATACGGTGAAGGTGCCATTACCCGGTTCTTCATACAGTGCCAGGCGACCTTCATACTGTTCATTAACCAGACCACTGCTTTCAACCAGCTGCGGACAGCGGCCATTTTCATTTTCTTCCCAGCGGCACCATTTCAGACTATTGGTTTCTTTCGGATTATACGGACAGGTCACTGCAACGCTACCGCCCCACGAACCACACTGCTGCGCGGCGGAATCATGGTATCTTCATTAATAAACAGCTGCACCGGCCAGCCTTCTTTCGGTTCGCCATCCGGATGTGCACCACACAGATAATGACCTTTACGCAGGCCGGTGATATGAACGCTAAAATGACTATTTTCTTTCGGGGTCAGCAGAACCTTCAAAATCCTGGGCTTTTTTGCCCAGGGTGTTAATAACCACATTACAGGTTTTACCATTTTAGCTGACACAGAAATTTTGCCACATTGGCCATTTCCTGACCCAGGGCACAATCAAAGACCGCGCAGATCGCCATAGATCAGTTCCGGTTCCGGTTTCAGCACCTGCAGATCGGCGCTTCATCGCCTGCCTGACAAATATAGATGCCGGCATCGCGCAGCTGAATGCGGTTAATAACAAAACTAAAAACCAGCTGATTGGTGCCCTGAATACTCAGATGGGCGCGGTTGGTAAAGTTGTTAATAACCATTGCTATCAATAACCAGCACACGAATCTGACCCAGTTTTTTATACACGCCTGGGCATTTTCGCTTTTAAACGGGCAATTAATGGTCACGGTACTACCCAGATCTGCGGCATGCACATCGCCAATCTGACCCGGGCCCTGACTAACTTCCAGGCTCACATCAAAACTCGGCTACTAATGCCCAGACCACATTTATACAGACCGCTGTCACCACGGGTCAGATGACCCATAACAAAGGTGCCATTTTCCGGAAAATTGGTCAGATTTGCGCGACCCTTATAATCTTATAGCCTTCACTGCTAATCAGGGTGGTGCAGCGACCTTTTGCACCAATACGACACCAATACGGCTATGACGATTCACACTGGTGGCCGGATAATAACAACGAATACTCACACTACTACCTTCCACACTGCTAACATCCTGCGGGCCAAAAATCGGGCTCTTGAATTCTAAAAGCTT-3’A.2免疫用抗原制备方法6A.2.3重组蛋白的纯化A.2.3.2平衡。用缓冲液A（8mol/L脲pH8.0）平衡镍柱,直至电导率、pH值等A.2.3.3上样。将上述处理好的上清液进行上样。A.2.3.4洗杂。用缓冲液B（含0.02mol/L咪唑的缓冲液A）进行洗杂，直至电导率、pH值等参数不A.2.3.7水洗。用纯化水冲洗镍柱，直至电导率、pH值等参数不变。7pET32a-SC重组蛋白抗体水平的测定碳酸盐缓冲液（pH9.6）、PBS缓冲液（pH7.2）、洗涤液（PB）：B.2.2PBST洗涤3次，300μL/孔，加入2B.2.5PBST洗涤3次，300μL/孔，拍干，加入1:2000稀释的羊抗鼠IgG-HRP抗体，100μL/孔，37℃B.2.6PBST洗涤3次，300μL/孔，拍干，加入TMB显色液，100μL/孔，室温（25℃,可用水浴或温B.2.7显色结束后，立即加入2mol/LH2SO4，50μL/8C.2.1处死小鼠后，无菌注射DMEM液体培养基5mL，轻揉小鼠腹部1~2m计数，按8×105个/mL细胞密度进行铺板，37℃、59D.2.1重组杆状病毒rBV-SC接毒后48h（MOI=1），PBS洗板3次，200μ室温固定15min，PBS润洗3次，200µLD.2.4加入羊抗鼠IgG-FITC（1:200）50μL/孔，37D.2.5PBS洗板3次，200μL/孔，拍干后，置荧光显微镜观察结果pFastBac表达载体，感受态细胞（DH5α、DH10Bac）、T4连体（Anti-His）、昆虫细胞培养基、LB液受态细胞中，以pFastBac通用引物进行E.2.1.2取鉴定结果正确的菌株接种到含氨苄青霉素（10µg/mL）的LB液体培养基中，37℃~18h，进行质粒的提取，命名为：pFastBac-SC。48h后，4℃冰箱中放置1~2d，挑取白色菌落进行鉴定，同时挑取蓝色菌落进行对照，