生物制品铵盐测定指南（试行）

生物制品铵盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗、重组蛋白类制品、血液制品、抗毒素/抗血清类制品、细胞治疗产品相关原料及制剂、生物制品生产用原辅材料（如细胞培养液、缓冲液、透析液等）中铵盐含量的测定。本指南不适用于本身配方中添加铵盐作为活性成分、稳定剂的制品，此类制品可参考本指南调整前处理方法后开展测定，检测结果仅作过程监控使用；含高浓度三羟甲基氨基甲烷（Tris）、硫柳汞的样品不建议采用纳氏试剂法测定，以避免基质干扰导致结果偏差。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0706铵盐测定法

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

JJG178-2007紫外、可见、近红外分光光度计检定规程

JJG823-2014离子色谱仪检定规程

3术语和定义

3.1铵盐：本指南中铵盐指样品中以游离态NH₄⁺存在、以及在弱碱性条件下可转化为NH₄⁺的结合态铵的总量，结果可选择以NH₄⁺或NH₃计，二者换算系数为1.0588（即1μgNH₄⁺相当于1.0588μgNH₃）。

3.2纳氏试剂法：指利用碱性条件下铵根与碘化汞钾反应生成黄棕色络合物、通过比色定量的检测方法，适用于基质简单的样品快速筛查。

3.3苯酚-次氯酸盐法（靛酚蓝法）：指利用碱性条件下铵根在催化剂作用下与苯酚、次氯酸钠反应生成靛蓝色靛酚蓝、通过比色定量的检测方法，适用于中等基质复杂度的样品准确定量。

3.4离子色谱法：指利用阳离子交换柱分离铵根、通过抑制型电导检测器定量的检测方法，为铵盐测定的仲裁方法，适用于所有基质样品的准确定量及争议结果复核。

4基本要求

4.1人员要求

所有从事铵盐测定的人员应经过生物制品检测操作、无氨实验规范、仪器操作及数据分析专项培训，考核合格后方可上岗；实验过程中应严格遵守无氨操作要求，避免体表汗液、呼出气体对样品造成污染。

4.2环境要求

铵盐测定应在专用无氨实验室开展，实验室不得存放氨水、铵盐类试剂、含氮化肥等易挥发含氨物质；实验用通风橱不得与开展氨水挥发类实验的通风橱共用；实验室进风需经过除氨活性炭过滤装置处理，实验过程中应关闭门窗，避免空气对流引入外源性氨污染。

4.3实验用水要求

所有实验用水应符合GB/T6682-2008规定的一级水标准，且需经过除氨处理，即无氨水。无氨水可采用以下两种方式制备：（1）超纯水仪加装专用除氨柱，出水25℃电导率≤0.055μS/cm；（2）向普通蒸馏水中加入0.1mL/L优级纯浓硫酸，重新蒸馏，弃去前后各10%馏出液，收集中间馏分。无氨水需每日验证合格后方可使用，验证方法为：取10mL无氨水加入1mL纳氏试剂，摇匀静置10min后，420nm波长处1cm比色皿测定吸光度≤0.030。

4.4器皿要求

所有接触样品、试剂的器皿（包括比色管、移液枪头、离心管、容量瓶、进样瓶等）均不得使用含氮洗涤剂（洗衣粉、洗洁精等）清洗，应采用10%（v/v）优级纯盐酸浸泡≥24h，取出后用无氨水冲洗至少6次，倒置在无氨环境中自然晾干，禁止使用抹布擦拭内壁；实验过程中尽量采用聚四氟乙烯塞、玻璃塞，避免使用橡胶塞、乳胶管等含氮高分子制品，防止析出氨污染样品。

5方法选择原则

5.1纳氏试剂法：检测范围为0.05μg/mL~5μg/mL，操作简便、检测周期短，适用于重组蛋白原液、透析后样品、无铝佐剂灭活疫苗、生产用缓冲液等基质简单的样品快速测定。

5.2苯酚-次氯酸盐法：检测范围为0.02μg/mL~2μg/mL，灵敏度高、特异性优于纳氏试剂法，适用于血液制品、抗血清、含低浓度稳定剂的半成品、细胞培养液等中等基质复杂度样品的准确定量。

5.3离子色谱法：检测范围为0.01μg/mL~100μg/mL，准确度高、抗干扰能力强，适用于所有基质样品的测定，含铝佐剂疫苗、含Tris/硫柳汞/高浓度氨基酸的样品、仲裁试验必须采用本方法。

6通用样品前处理要求

6.1取样要求

所有样品应采集平行双份，取样过程采用无氨专用器皿、枪头，取样量根据预估铵盐含量确定，尽量使待测液中铵浓度落在标准曲线中间区间（即曲线范围的20%~80%区间），以降低测定误差。

6.2不同基质样品前处理

6.2.1澄清无蛋白、无佐剂样品：如透析液、成品注射液、脱蛋白缓冲液等，可直接取样测定，若含盐量过高可先采用无氨水适当稀释。

6.2.2含蛋白样品：如重组蛋白原液、血液制品、抗血清等，可采用蛋白沉淀法处理：取1mL样品加入0.1mL100g/L硫酸锌溶液，摇匀后加入0.05mL250g/L氢氧化钠溶液，摇匀静置10min，4℃条件下12000r/min离心10min，取上清液待测；也可采用10kD分子量截留的超滤管超滤，取超滤液待测，超滤管使用前需用无氨水冲洗3次，验证无氨残留后方可使用。

6.2.3含铝佐剂样品：如铝佐剂吸附疫苗，取1mL样品加入0.2mL2mol/L优级纯盐酸，摇匀后静置30min使铵根完全解吸附，12000r/min离心15min，取上清液用2mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.5~7.5，待测。

6.2.4高浊度、有色样品：如细胞裂解液、发酵液，可加入0.1g经无氨水冲洗3次并烘干的活性炭，摇匀静置10min，过滤取上清液，需提前验证活性炭对铵根的吸附率≤5%，否则应采用蒸馏法处理：将样品调至酸性，加热蒸馏去除挥发性有机物，再调至弱碱性蒸馏，收集馏出液待测。

7检测方法操作规范

7.1纳氏试剂法

7.1.1原理

碱性条件下，样品中的铵根与纳氏试剂（碘化汞钾）反应生成黄棕色络合物，该络合物的吸光度与铵根浓度成正比，在420nm波长处比色定量。

7.1.2试剂

（1）纳氏试剂：称取16.0g氢氧化钠，溶于50mL无氨水中，冷却至室温；另称取7.0g碘化钾和10.0g碘化汞，溶于少量无氨水中，将此溶液在搅拌下缓慢注入氢氧化钠溶液中，用无氨水稀释至100mL，贮存于棕色聚乙烯瓶中，密封避光4℃保存，有效期1个月；静置过夜后取上清液使用，沉淀部分不得混入试剂。

（2）500g/L酒石酸钾钠溶液：称取50.0g酒石酸钾钠（KNaC₄H₄O₆·4H₂O）溶于100mL无氨水中，加热煮沸至体积剩余约70mL以去除氨，冷却后用无氨水定容至100mL，4℃保存，有效期3个月。

（3）铵标准储备液（1000μg/mL，以NH₄⁺计）：优先采购有证标准物质，也可自行配制：取优级纯氯化铵于105℃烘干2h，置于干燥器中冷却至室温，准确称取3.8190g，用无氨水溶解后加入1mL优级纯盐酸防腐，定容至1000mL，4℃保存，有效期6个月。

（4）铵标准工作液（10μg/mL）：临用前取铵标准储备液用无氨水逐级稀释配制。

7.1.3操作步骤

（1）标准曲线绘制：取7支50mL比色管，分别加入0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL铵标准工作液，对应铵根质量分别为0、0.5、1、2、5、10、20μg，加无氨水补足至50mL刻度线；依次加入1mL酒石酸钾钠溶液，充分摇匀后加入1mL纳氏试剂，摇匀后室温（15℃~30℃）静置10min；采用1cm比色皿，以零浓度管为空白，在420nm波长处测定吸光度，以铵根质量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，相关系数应≥0.999。

（2）样品测定：取适量前处理后的样品液（铵根质量控制在0.5μg~20μg之间），加入比色管中，用无氨水补足至50mL刻度线，按照与标准曲线相同的步骤操作，测定吸光度，从标准曲线中查得对应铵根质量。

7.1.4结果计算

按式（1）计算样品中铵盐含量：

式中：

X——样品中铵盐含量，单位为μg/mL（液体样品）或μg/g（固体样品）；

m——从标准曲线查得的测定液中铵根质量，单位为μg；

V₁——样品前处理后定容总体积，单位为mL；

V₂——测定时取用的前处理上清液体积，单位为mL；

Vs——样品取样体积（液体，单位为mL）或取样质量（固体，单位为g）。

7.1.5注意事项

（1）样品中余氯会与纳氏试剂反应生成沉淀干扰测定，可加入0.5mL3.5g/L硫代硫酸钠溶液去除，用淀粉碘化钾试纸验证无余氯后再测定；

（2）钙镁离子浓度超过100mg/L时会产生浑浊，可适当稀释样品或增加酒石酸钾钠加入量掩蔽干扰；

（37.2苯酚-次氯酸盐法（靛酚蓝法）7.2.1原理碱性条件下，铵根在亚硝基铁氰化钠催化作用下，与苯酚、次氯酸钠反应生成靛蓝色的靛酚蓝，该物质的吸光度与铵根浓度成正比，在630nm波长处比色定量。

7.2.2试剂

（1）苯酚溶液：称取5.0g新蒸馏的无色苯酚溶于少量无氨水中，加入0.1g亚硝基铁氰化钠，溶解后用无氨水定容至100mL，棕色瓶4℃避光保存，有效期1个月。

（2）次氯酸钠使用液：取市售次氯酸钠原液（有效氯含量约10%），用无氨水稀释至有效氯浓度3.5g/L，用2mol/L氢氧化钠溶液调pH至12.0，临用前配制，有效氯浓度采用碘量法标定。

（3）铵标准储备液、工作液同7.1.2。

7.2.3操作步骤

（1）标准曲线绘制：取7支10mL比色管，分别加入0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mL铵标准工作液，对应铵根质量分别为0、0.2、0.5、1、2、5、10μg，加无氨水补足至2mL刻度线；依次加入1mL苯酚溶液，充分摇匀后加入1mL次氯酸钠使用液，摇匀后置于37℃水浴显色30min，取出冷却至室温；采用1cm比色皿，以零浓度管为空白，在630nm波长处测定吸光度，以铵根质量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，相关系数应≥0.999。

（2）样品测定：取适量前处理后的样品液（铵根质量控制在0.2μg~10μg之间），加入比色管中，用无氨水补足至2mL刻度线，按照与标准曲线相同的步骤操作，测定吸光度，从标准曲线中查得对应铵根质量。

7.2.4结果计算

同7.1.4。

7.2.5注意事项

（1）反应体系pH应控制在10.5~11.5之间，pH偏低会导致显色不完全，pH偏高会出现浑浊，前处理后上清液需预先调pH至中性后再测定；

（2）样品中含氧化性物质会氧化苯酚导致显色变浅，可加入0.1mL10g/L抗坏血酸溶液消除干扰。7.3离子色谱法7.3.1原理样品经前处理去除大分子杂质后，进入离子色谱系统，通过阳离子交换色谱柱分离，抑制型电导检测器检测，根据保留时间定性，峰面积定量。

7.3.2仪器与试剂

（1）仪器：离子色谱仪（带抑制型电导检测器）、阳离子交换柱（推荐CS12A或等效柱）、OnGuardIIRP固相萃取柱、0.22μm水系无氨微孔滤膜。

（2）20mmol/L甲烷磺酸淋洗液：移取1.6mL优级纯甲烷磺酸，用无氨水稀释至1000mL，经0.22μm微孔滤膜抽滤，超声脱气15min后使用；采用淋洗液自动发生器的仪器可直接配置对应浓度淋洗液。

（3）铵标准储备液：优先采购阳离子混标有证标准物质，也可采用7.1.2规定的储备液。

（4）系列标准工作液：临用前将铵标准储备液用无氨水稀释为0.01、0.05、0.1、0.5、1、10、100μg/mL的系列浓度标准溶液。

7.3.3操作步骤

（1）前处理：样品经沉淀、离心等前处理后，取上清液依次通过0.22μm微孔滤膜、RP固相萃取柱（弃去前3mL流出液），收集后续流出液待测；含盐量过高的样品需适当稀释，使钠、钾离子浓度不超过1000μg/mL，避免出现平头峰干扰分离。

（2）标准曲线绘制：将系列标准工作液依次进样，进样体积25μL，以铵根浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，相关系数应≥0.9995。

（3）样品测定：待测液按照与标准溶液相同的进样体积进样，记录保留时间和峰面积，从标准曲线查得对应铵根浓度。

7.3.4结果计算

按式（2）计算样品中铵盐含量：

式中：

X——样品中铵盐含量，单位为μg/mL（液体样品）或μg/g（固体样品）；

C——从标准曲线查得的待测液中铵根浓度，单位为μg/mL；

n——样品总稀释倍数。

7.3.5注意事项

（1）每次进样结束后需用淋洗液冲洗系统10min以上，避免高浓度样品残留；

（2）样品中含甲胺、乙胺等小分子胺类物质时，应调整淋洗液浓度或更换色谱柱，确保铵根与杂质峰的分离度≥1.5，避免共流出干扰。

8方法学验证要求

开展铵盐测定前，应对所采用的方法进行验证，确保方法适用于对应基质样品的测定，验证内容及合格标准如下：

8.1准确度

采用加标回收法验证，分别向样品中加入高、中、低三个浓度的铵标准物质（加标后浓度分别落在标准曲线低限附近、中间区域、高限附近），每个浓度制备3份平行样，计算回收率。合格标准：纳氏试剂法、苯酚-次氯酸盐法回收率应在85%115%范围内；离子色谱法回收率应在90%110%范围内。

8.2精密度

8.2.1重复性：同一人员同一天制备6份平行样品测定，计算相对标准偏差（RSD），RSD应≤10%。

8.2.2中间精密度：由2名不同操作人员，在不同日期采用同一批次试剂、仪器分别测定6份平行样品，计算所有12份结果的RSD，RSD应≤15%。

8.3专属性

取样品基质中所有添加成分（如稳定剂、缓冲盐、佐剂、防腐剂等）按配方浓度配制空白基质溶液，进行测定，空白基质中铵盐检出量应低于方法定量限；若样品中含尿素、氨基酸等含氮物质，应向空白基质中加入最高浓度的对应物质，测定结果无明显铵根检出，或加标回收率符合要求，证明无干扰。

8.4检出限与定量限

采用信噪比法验证，以3倍信噪比对应的浓度为方法检出限，10倍信噪比对应的浓度为方法定量限。合格标准：纳氏试剂法检出限≤0.02μg/mL，定量限≤0.05μg/mL；苯酚-次氯酸盐法检出限≤0.01μg/mL，定量限≤0.02μg/mL；离子色谱法检出限≤0.005μg/mL，定量限≤0.01μg/mL。

8.5线性与范围

配制至少6个浓度梯度的标准溶液（含零浓度点），标准曲线的相关系数应满足：纳氏试剂法、苯酚-次氯酸盐法≥0.999；离子色谱法≥0.9995，线性范围应覆盖样品中可能的铵盐浓度范围。

9质量控制要求

9.1全程空白控制

每批实验应同步开展全程空白对照，即采用无氨水代替样品，按照与样品完全相同的前处理、测定步骤操作，空白值应符合要求：纳氏试剂法空白吸光度≤0.030；苯酚-次氯酸盐法空白吸光度≤0.020；离子色谱法空白铵根峰面积低于定量限对应峰面积。若空白值超标，说明存在外源性氨污染，应排查器皿、试剂、环境的污染来源，重新开展实验。

9.2标准曲线控制

每批实验应同步配制新鲜标准曲线，不得使用之前批次的标准曲线；连续测定超过24h的，应重新绘制标准曲线。

9.3质控样控制

每批实验应同步测定1份有证铵盐标准物质或内部质控样，测定值应落在质控范围的±2SD范围内；若连续测定≥10份样品，每测定10份样品应插入1次质控样，确保仪器状态稳定。质控样测定结果超出范围的，该批次所有样品测定结果无效，应重新开展实验。

9.4平行样控制

每个样品应至少测定2份平行样，平行样相对偏差应≤15%，若超出范围应重新取样测定。

10结果判定与报告