生物制品不溶性微粒检查指南（试行）

生物制品不溶性微粒检查指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗类、抗毒素及抗血清类、血液制品类、重组蛋白及单克隆抗体类、细胞与基因治疗类、多肽类生物制品的静脉注射液、肌内注射液、注射用无菌粉末、注射用浓溶液、眼用液体制剂的不溶性微粒检查，其他给药途径的生物制品可参照执行。本指南为试行版本，若与国家药品标准、药品监管部门发布的正式指导原则冲突，以官方法定文件为准。2规范性引用文件《中华人民共和国药典》2025年版四部通则0903不溶性微粒检查法；《美国药典》USP<788>ParticulateMatterinInjections；《欧洲药典》EP2.9.19ParticulateContamination:Sub-visibleParticles；国家药监局《生物制品质量控制技术指导原则》。3术语与定义3.1不溶性微粒：指生物制品中存在的非有意添加、不溶于制剂基质、粒径通常≥1μm的颗粒性杂质，其中粒径在1μm~100μm范围内的为亚可见不溶性微粒，是本指南的主要检查对象。3.2外源性微粒：指生产、储存、检验过程中从外部环境引入的微粒，包括玻璃屑、橡胶塞脱落物、纤维、金属屑、环境尘埃等。3.3内源性微粒：指生物制品自身成分或处方组分产生的微粒，包括蛋白聚集物、辅料微晶、降解产物、核酸团聚物、细胞碎片等。3.4光阻法：基于微粒通过激光束时阻挡光线产生的电信号强度与微粒体积成正比的原理，对微粒数量和粒径进行计数的方法。3.5显微计数法：将供试品中的微粒截留在微孔滤膜上，通过显微镜观测对微粒数量、粒径、形态进行统计分析的方法，为不溶性微粒检查的仲裁方法。4检查基本要求4.1人员要求所有从事不溶性微粒检查的人员需经过专项培训，考核合格后方可上岗。培训内容包括不溶性微粒检查的方法原理、操作规范、污染防控要求、数据处理规则、仪器校准与维护方法，需具备识别常见微粒污染来源、判定检验结果有效性的能力。4.2环境要求检查操作需在ISO14644-1Class5级（即我国A级洁净度，静态下≥0.5μm微粒≤3520个/m³、≥10μm微粒≤29个/m³）的垂直流层流罩内进行，层流罩需定期校准，风速控制在0.36m/s~0.54m/s范围内。每次试验前需对操作环境的微粒本底进行监测，确认符合洁净度要求后方可开展试验。4.3器具要求所有接触供试品的器具（包括容量瓶、注射器、移液枪头、过滤装置、镊子、培养皿等）均需采用无微粒级材质，优先使用一次性无微粒器具。可重复使用的器具需经如下预处理：采用经0.22μm微孔滤膜过滤的注射用水超声清洗3次，每次10min，随后置于无尘烘箱中105℃烘干，冷却后存放于无尘密封容器中备用，存放周期不超过72h。4.4试剂要求试验所用稀释剂（包括0.9%氯化钠注射液、5%葡萄糖注射液、制剂空白基质等）需经0.22μm聚醚砜（PES）微孔滤膜双重过滤，试验前需进行空白计数：每10ml稀释剂中≥10μm的微粒数≤10个、≥25μm的微粒数≤2个，符合要求后方可使用。5检查方法选择原则5.1光阻法适用范围适用于澄清透明、无色或浅色、黏度≤10mPa·s、无乳浊、无混悬颗粒的生物制品，包括低浓度蛋白注射液、疫苗注射液、小分子多肽注射液等。光阻法检测速度快、重复性好，适合大批量样品的常规检查。5.2光阻法不适用范围存在明显乳浊或混悬特性的制剂（如脂质体产品、微球制剂、脂肪乳剂）、高黏度制剂（黏度>10mPa·s的高浓度单抗制剂、多糖类生物制品）、深色制剂、易产生气泡的制剂，均不得采用光阻法直接测定，避免出现假阳性结果。5.3显微计数法适用范围适用于所有类型的生物制品不溶性微粒检查，尤其是光阻法不适用的制剂类型。当光阻法测定结果不符合规定或存在争议时，需采用显微计数法进行仲裁。此外，需要对微粒来源进行鉴别、形态分析时，也需采用显微计数法结合拉曼光谱、偏光显微镜、红外光谱等技术开展分析。6光阻法操作规程6.1样品制备6.1.1样品数量：同一批号样品需至少抽取3个独立包装单元，若包装单元装量≥10ml，直接采用单包装样品测定；若包装单元装量<10ml，需合并至少6个包装单元的内容物，使总测定体积不少于20ml。6.1.2样品预处理：首先采用无尘无绒擦拭纸蘸取75%乙醇擦拭样品容器外壁，除去表面污染物，在层流罩内小心开启容器，避免玻璃屑、铝屑等异物落入供试品中。开启后首先观察供试品性状，若存在明显可见异物，需单独记录并剔除该样品。若供试品存在温度依赖性析出物，需按照说明书规定的温度条件放置至完全溶解，确认无可见结晶后再进行测定。供试品需采用温和方式脱气：可置于40℃水浴中超声2min，或静置10min排去气泡，避免剧烈震荡导致蛋白聚集或产生新的气泡。6.1.3稀释处理：若供试品蛋白浓度≥50mg/ml，或基质背景干扰较大，可采用经空白检查合格的稀释剂进行梯度稀释，稀释倍数需经过预实验确认，确保稀释后供试品的微粒计数在线性范围内，记录稀释倍数以便后续结果校正。6.2仪器校准与检查光阻法微粒检测仪需每6个月采用粒径为10μm、25μm的聚苯乙烯乳胶标准微粒进行校准，校准误差需控制在±5%以内，仪器重大维修后需重新校准。每次试验前需开展仪器自检，确认流动池清洁、光路正常、管路无气泡后，方可开展试验。6.3空白测定取预处理合格的稀释剂，按照供试品测定方法连续测定3次，每次进样体积不少于5ml，弃去第一次测定数据，取后两次的平均值作为空白计数结果，符合4.4规定的空白要求后方可进行供试品测定。若空白计数超标，需更换稀释剂或对仪器管路、流动池进行清洁，直至空白符合要求。6.4供试品测定将制备好的供试液缓慢注入仪器进样口，避免引入气泡，每次进样体积不少于5ml，连续测定3次，弃去第一次测定数据（排除管路残留污染的干扰），取后两次的计数结果计算平均值。每个样品需平行测定2份，两份结果的相对标准偏差（RSD）需≤20%，否则需重新测定。6.5结果计算若供试品未稀释：每1ml供试品中某一粒径范围的微粒数=两次有效测定的平均计数/进样体积。若供试品经过稀释：每1ml供试品中某一粒径范围的微粒数=（供试品测定平均计数-空白平均计数）×稀释倍数/进样体积。7显微计数法操作规程7.1样品制备样品数量、预处理、稀释要求与光阻法一致，总测定体积不少于5ml。7.2滤膜与装置准备7.2.1滤膜选择：采用白色网格型聚碳酸酯微孔滤膜，孔径为0.45μm，直径为25mm，滤膜网格需清晰无缺损，无固有微粒。7.2.2滤膜预处理：将滤膜置于经0.22μm过滤的注射用水中浸泡24h，或超声清洗3次，每次5min，确保除去滤膜表面的固有微粒。7.2.3过滤装置预处理：将玻璃过滤漏斗、不锈钢支撑网、夹具采用经0.22μm过滤的注射用水冲洗3次，每次10ml，组装后进行空白过滤试验：取20ml空白稀释剂过滤，晾干后计数，≥10μm微粒≤5个、≥25μm微粒≤2个，符合要求后方可使用。7.3供试品过滤将5ml制备好的供试液加入过滤漏斗中，开启真空泵，控制抽滤速度为1ml/min~2ml/min，避免流速过快导致微粒穿过滤膜。待供试液即将抽干时，用1ml空白稀释剂冲洗漏斗内壁3次，确保所有微粒转移至滤膜上，抽干后用无微粒镊子小心取下滤膜，置于无尘培养皿中，在洁净环境下25℃~30℃自然晾干，避免高温烘干导致制剂组分结晶。7.4显微计数将晾干的滤膜置于生物显微镜载物台上，首先采用100倍放大倍率（10×物镜、10×目镜），沿滤膜网格逐格观测，计数所有粒径≥10μm的微粒；随后采用200倍放大倍率，计数所有粒径≥25μm的微粒。计数过程中需排除滤膜固有缺陷、空气中的落尘等干扰，若发现微粒形态异常，可采用偏光显微镜、显微拉曼光谱进行成分鉴别。7.5结果计算每1ml供试品中某一粒径范围的微粒数=该粒径范围的总计数/供试品过滤体积。若供试品经过稀释，需扣除空白计数后乘以稀释倍数。8结果判定标准8.1静脉注射用生物制品8.1.1光阻法判定标准：①标示装量≥100ml的大容量注射液：每1ml中≥10μm微粒数≤25个，≥25μm微粒数≤3个；②标示装量<100ml的小容量注射液、注射用无菌粉末、注射用浓溶液：每个独立包装单元中≥10μm微粒数≤6000个，≥25μm微粒数≤600个。8.1.2显微计数法判定标准：①标示装量≥100ml的大容量注射液：每1ml中≥10μm微粒数≤12个，≥25μm微粒数≤2个；②标示装量<100ml的小容量注射液、注射用无菌粉末、注射用浓溶液：每个独立包装单元中≥10μm微粒数≤3000个，≥25μm微粒数≤300个。8.2非静脉注射用生物制品肌内注射、皮下注射用生物制品的不溶性微粒限值可参照静脉注射用标准执行，若处方特性确需放宽限值，需提供充分的安全性评估数据，经药品监管部门批准后可执行注册标准。8.3眼用液体制剂每1ml中≥10μm微粒数≤50个，≥25μm微粒数≤5个。8.4细胞与基因治疗产品需采用染色法、流式细胞法等排除活细胞、细胞碎片的干扰，每1ml供试品中≥10μm的外源性及内源性非细胞微粒数≤100个，≥25μm的微粒数≤10个。8.5特殊说明若生物制品注册标准中规定了更严格的不溶性微粒限值，以注册标准为准。若测定结果超出限值，需首先排除检验过程中的污染，重新取双倍数量的样品复验，复验仍不合格的，判定为不符合规定。9污染防控与异常情况处理9.1污染防控要求9.1.1人员防控：操作人员需穿戴全套无尘服、无粉乳胶手套、N95口罩、无尘帽，不得佩戴首饰、美甲，操作过程中不得说话、不得将身体任何部位暴露在层流罩的供试品上方，避免唾液、皮屑、毛发等污染供试品。9.1.2环境防控：层流罩内不得放置与试验无关的物品，每次试验结束后需采用无尘擦拭纸蘸取75%乙醇擦拭层流罩内壁、台面，每周对层流罩的高效过滤器进行检漏，每3个月更换初效过滤器，每年更换高效过滤器。9.1.3器具防控：一次性器具不得重复使用，可重复使用的器具需单独清洗、单独存放，避免交叉污染，不同批次样品的试验器具不得混用。9.2异常情况处理9.2.1空白计数超标：首先检查稀释剂是否合格，随后检查仪器管路、流动池、过滤装置是否存在残留污染，更换稀释剂或对器具进行重新清洗后再次测定，直至空白符合要求。9.2.2样品测定结果波动大：首先检查供试品是否存在气泡，进样过程中是否引入了空气，随后检查供试品是否存在蛋白聚集、结晶析出等情况，重新脱气或复溶后再次测定。9.2.3结果超出限值：首先排查检验过程的污染，若确认检验过程无问题，需对微粒进行成分鉴别，追溯污染来源：外源性微粒需追溯生产过程的包装材料相容性、生产设备磨损情况、洁净环境控制情况；内源性微粒需优化处方工艺、储存条件、运输条件，避免蛋白聚集或辅料结晶。10方法学验证要求对首次开展不溶性微粒检查的品种，需开展方法学验证，验证内容包括：10.1专属性：确认方法不会将制剂中的有意组分（如脂质体、微球、细胞等）计为杂质微粒，或可通过前处理方法排除上述组分的干扰。10.2精密度：取同一份供试品平行测定6次，测定结果的RSD≤20%。10.3回收率：向供试品中加入已知数量的10μm、25μm标准微粒，回收率需在80%~120%范围内。10.4定量限：确认方法可准确计数的最低微粒浓度≤1个/ml。10.5耐用性：考察不同操作人员、不同仪器、不同批次滤膜对测定结果的影响，结果的RSD≤25%。11记录与报告要求11.1试验记录需包含以下内容：试验日期、试验人员、仪器型号及校准有效期、环境洁净度监测数据、样品信息（名称、批号、规格、生产单位、抽样数量）、样品预处理方法、稀释倍数、空白测定结果、每次测定的原始计数、平均值、判定结果、异常情况及处理措施。11.2检验报告需明确依据的检查方法、判定标准，列明不同粒径范围的微粒计数结果，明确给出是否符合规定的结论。12特殊品种检查细则12.1高浓度蛋白制剂（蛋白浓度≥100mg/ml）：优先采用显微计数法检查，若采用光阻法需进行充分的稀释，稀释倍数不低于10倍，避免蛋白分子团聚导致的假阳性结果。12.2脂质体