生物制品炽灼残渣测定指南（试行）

生物制品炽灼残渣测定指南（试行）1范围本指南适用于疫苗类、抗血清/单克隆抗体类、重组蛋白/多肽类、血液制品类、细胞治疗产品衍生制剂、体外诊断用生物制品原料及成品的炽灼残渣定量测定，可用于生物制品生产过程质量控制、成品放行检定、注册申报检验等场景。本指南不适用于未经过前处理的含高浓度不溶性无机佐剂且仅测定活性组分残渣的混悬类制剂，该类样品需先通过离心、过滤等方式分离无机佐剂后再对活性组分进行测定；若需测定混悬类制剂全品残渣，可直接取样测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0841炽灼残渣检查法《中华人民共和国药典》2025年版四部通则0832干燥失重测定法GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》《实验室生物安全通用要求》GB19489-20083术语和定义3.1炽灼残渣（生物制品领域）：指生物制品中的有机组分经加热炭化、高温氧化分解后，残留的无机硫酸盐类灰分，以质量百分含量表示，可反映生物制品中无机杂质的总含量水平。3.2炭化：指供试品经低温加热，使有机组分脱水、分解、碳化，转化为无定形碳质残渣的过程，需避免有机组分沸腾溢出或明火燃烧。3.3恒重：指供试品经连续两次炽灼、冷却、称重后，两次称重的差值≤0.3mg，此时可认为供试品中的挥发性组分已完全除去，重量达到稳定状态。3.4空白试验：指不加供试品，其余操作步骤、试剂用量均与供试品测定完全一致的试验，用于校正试剂、器皿、环境引入的杂质误差。4测定原理生物制品中的有机组分（包括蛋白质、核酸、多糖、脂质、有机缓冲剂、表面活性剂等）经低温加热炭化分解为挥发性组分逸出，残留的无机组分（包括金属离子、无机盐、无机杂质等）在浓硫酸作用下转化为热稳定性更高的硫酸盐，置于指定温度下高温炽灼至恒重后，通过计算残留硫酸盐质量占供试品初始质量的比例，即可得到供试品的炽灼残渣含量。对于含易挥发金属元素的供试品，可通过降低炽灼温度减少金属元素挥发损失，保证测定结果的准确性。5试剂与器材5.1试剂5.1.1浓硫酸：优级纯，密度1.84g/ml，H₂SO₄含量95%~98%，硫酸盐杂质含量≤0.0005%，每批次浓硫酸使用前需进行空白验证，确保引入的残渣含量≤0.1mg。5.1.2硝酸：优级纯，仅用于含难氧化有机组分（如高浓度细胞裂解液、石蜡包埋生物样品）的前处理，硝酸盐杂质含量≤0.0003%。5.1.3纯化水：符合GB/T6682-2008规定的一级水要求，电导率≤0.01mS/m（25℃），可氧化物质含量≤0.01mg/L。5.1.4干燥剂：变色硅胶或五氧化二磷，用于干燥器内吸湿，变色硅胶呈粉红色时需及时更换，五氧化二磷使用周期不得超过3个月。5.1.510%硝酸溶液：由优级纯硝酸与一级水按体积比1:9配制而成，用于坩埚的预处理清洗。5.2器材5.2.1高温马弗炉：控温范围室温~1000℃，温度精度±25℃，带程序升温功能，炉膛内部采用耐高温陶瓷材质，每年需由具备资质的计量机构进行温度校准，校准合格后方可使用。5.2.2坩埚：根据供试品基质选择材质：①常规无氟供试品可选用硬质石英坩埚或铂坩埚；②含氟离子的供试品必须使用铂坩埚，不得使用石英或瓷坩埚，避免氟化氢腐蚀坩埚引入杂质导致结果偏高；③含高浓度碱金属卤化物的供试品优先选用铂坩埚。坩埚规格为20ml~50ml，根据称样量选择，称样量≥5g时选用50ml坩埚，称样量<1g时选用20ml坩埚。5.2.3电子分析天平：感量0.1mg（万分之一精度），适用于称样量≥1g的供试品称量；感量0.01mg（十万分之一精度），适用于称样量<1g或预估残渣含量<0.05%的供试品称量。天平每年需进行计量校准，每次使用前需检查水平状态，并采用标准砝码进行误差校验，称量误差不得超过±0.1mg。5.2.4辅助器材：铂头坩埚钳（夹取铂坩埚时使用，避免引入金属杂质）、可调温电炉/电热板（控温范围室温~400℃，带通风罩）、玻璃干燥器（规格240mm~300mm，带密封硅胶圈）、耐高温陶瓷标记笔（耐温≥1000℃，用于标记坩埚编号）、通风橱（面风速≥0.5m/s，配备废气处理装置）、高压灭菌锅（用于感染性供试品的灭活处理）、涡旋混匀器（用于混悬类供试品的混匀）、高速离心机（转速≥12000r/min，用于含佐剂供试品的组分分离）。6操作前准备6.1坩埚预处理新采购的坩埚需先置于10%硝酸溶液中煮沸30min，取出后用一级水冲洗3次，每次冲洗用水量为坩埚容积的1/2，确保坩埚内壁残留的硝酸完全洗净。将洗净的坩埚置于阴凉处晾干后，放入马弗炉中，按照供试品测定所用的炽灼温度（如750℃）灼烧2h，关闭马弗炉电源，待炉温降至200℃左右时，用坩埚钳取出坩埚，先置于耐高温陶瓷垫板上冷却5min，再移入干燥器中密封冷却30min，精密称定重量。将坩埚再次放入马弗炉中同温度炽灼30min，重复冷却、称重步骤，直至连续两次称重差值≤0.3mg，即为恒重，记录恒重后的坩埚空重W₀，将恒重后的坩埚置于干燥器中备用，存放时间不得超过72h，超过72h需重新进行恒重处理。6.2环境准备天平室温度控制在20±5℃，相对湿度≤60%，室内无气流扰动、无振动源、无腐蚀性气体，避免对称量结果造成干扰。马弗炉放置于独立的高温操作区域，周围1m范围内不得放置易燃易爆物品，操作区域配备灭火毯、干粉灭火器等消防器材。供试品前处理操作需在二级生物安全柜或通风橱内进行，涉及感染性样品的操作需符合GB19489-2008的生物安全要求。6.3人员准备操作人员需经过炽灼残渣测定专项培训，掌握生物制品前处理要点、高温设备操作规范、生物安全防护要求，经理论和实操考核合格后方可上岗。操作过程中需穿戴实验服、耐酸手套、护目镜、防护口罩，涉及感染性样品的操作需穿戴一次性防护服、鞋套、N95口罩。7供试品前处理根据生物制品的剂型、基质特性选择对应的前处理方式，取样前所有供试品需充分混匀，确保取样代表性：7.1液态低黏度供试品包括重组蛋白原液、单克隆抗体原液、血液制品原料血浆/中间体、无佐剂疫苗成品、小分子多肽制剂等，室温放置至完全融化后，采用涡旋混匀器混匀30s，精密称取适量供试品置于已恒重的坩埚中。称样量要求：预估残渣含量<0.1%的供试品称样量≥5.0g；预估残渣含量0.1%~1%的供试品称样量1.0g~5.0g；预估残渣含量>1%的供试品称样量0.5g~1.0g，称样量精确至0.1mg。7.2固态供试品包括冻干疫苗、冻干抗体制剂、生物制品药用辅料（蔗糖、甘氨酸、甘露醇、人血白蛋白冻干品等）、固态多肽原料等，去除外包装后，无菌条件下取出内容物，精密称取适量（称样量要求同7.1）直接置于坩埚中，避免外包装碎屑、胶塞碎屑掉入供试品，若供试品易吸潮，需在带干燥剂的称量室中快速完成称量。7.3含佐剂混悬类供试品包括氢氧化铝/磷酸铝佐剂疫苗、脂质体混悬制剂、纳米颗粒混悬制剂等：①若测定全品炽灼残渣，取样前需采用涡旋混匀器连续混匀5min，或采用颠倒混匀30次以上，确保佐剂完全分散无沉降，立即精密称取混匀后的混悬液适量；②若仅测定活性组分的炽灼残渣，需先进行组分分离：将混匀后的混悬液转移至无灰离心管中，10000r/min离心15min，小心吸取全部上清液作为供试品，或采用预先灼烧恒重的0.22μm无机滤膜过滤，取续滤液作为供试品，分离过程需同时做空白对照，校正离心管、滤膜引入的残渣误差。7.4高有机基质供试品包括细胞裂解液、病毒收获液、含0.1%以上吐温-80/曲拉通X-100等表面活性剂的制剂、高浓度多糖制品等，称样后将坩埚置于电热板上，80℃~100℃低温烘干水分及易挥发组分，烘干时间为1h~2h，直至供试品呈浓缩半固态，避免后续炭化过程中沸腾溢出。7.5感染性供试品包括活细菌疫苗、活病毒疫苗、病原微生物收获液等，称样前需先置于高压灭菌锅中，121℃高压灭菌30min，确认完全灭活后再进行后续操作，避免病原微生物扩散造成生物安全风险。7.6含有机溶剂供试品包括含乙醇、异丙醇、丙酮等有机溶剂的制剂、中间体，称样后将坩埚置于通风橱内，室温放置30min，待大部分有机溶剂挥发后，再进行低温烘干处理，避免加热时有机溶剂爆燃。8测定步骤8.1炭化将装有供试品的坩埚置于可调温电炉或电热板上，坩埚盖半开，预留1/3的缝隙便于蒸汽逸出，初始温度设置为150℃~200℃，缓慢加热至供试品完全脱水、分解，不再产生白色有机蒸汽，逐步升高温度至300℃~400℃，继续加热30min~2h，直至全部供试品炭化为黑色无定形残渣，无明显烟逸出。整个炭化过程需全程有人值守，不得离岗，若发生供试品沸腾溢出或明火燃烧，立即用坩埚盖完全盖住坩埚隔绝氧气灭火，该批次样品作废，重新取样测定。8.2硫酸处理炭化结束后，将坩埚取出置于通风橱内，冷却至室温，沿坩埚内壁缓慢滴加优级纯浓硫酸0.5ml~2.0ml，滴加速度控制在0.1ml/s，确保所有炭化残渣被硫酸完全湿润，避免反应过于剧烈导致样品溅出。将加完硫酸的坩埚重新置于电热板上，设置温度150℃~200℃低温加热，缓慢蒸发除去过量硫酸，直至不再产生白色三氧化硫烟雾，坩埚内壁及残渣呈现灰白色或浅黄色。若炭化残渣中仍有大量黑色碳粒未被氧化，可再次滴加0.5ml浓硫酸，重复上述蒸发操作，直至所有碳粒被完全氧化。8.3炽灼恒重将硫酸处理后的坩埚置于马弗炉中，坩埚盖半开，根据供试品特性设置炽灼温度：①常规无易挥发金属的供试品炽灼温度为750℃±50℃；②含铅、砷、汞、镉等易挥发金属元素的供试品炽灼温度为550℃±50℃，减少金属挥发损失；③含氟离子的供试品炽灼温度不得超过700℃，避免铂坩埚被腐蚀。设置马弗炉升温速率为5℃/min，避免升温过快导致残渣飞溅，升至设定温度后开始计时，炽灼2h。到达炽灼时间后，关闭马弗炉电源，待炉内温度自然降至200℃以下时，用铂头坩埚钳取出坩埚，先置于通风橱内冷却5min，再移入干燥器中密封冷却30min，精密称定重量。将坩埚再次放入马弗炉中，同温度炽灼30min，重复冷却、称重步骤，直至连续两次称重差值≤0.3mg，记录恒重后的总重量W₁。8.4空白试验每批供试品测定需同时做2份平行空白对照：取2个同批次预处理恒重的空白坩埚，按照与供试品完全相同的操作步骤（滴加相同量的浓硫酸、炭化、蒸发、炽灼恒重），记录空白坩埚恒重后的总重量W空，计算空白残渣值：空白残渣值=W空-W空0，其中W空0为空白坩埚的恒重空重。空白残渣值不得超过0.3mg，否则说明试剂、器皿或环境引入杂质，需更换浓硫酸、重新处理坩埚、清理马弗炉炉膛后重新进行空白试验，直至空白符合要求后方可进行供试品测定。9结果计算与表示9.1按湿品计的炽灼残渣炽灼残渣（%，湿品）=[(W₁-W₀)-(W空-W空0)]/W供×100%式中：W₁——供试品炽灼后坩埚+残渣的恒重重量，单位为g；W₀——供试品所用坩埚的恒重空重，单位为g；W空——空白坩埚+空白残渣的恒重重量，单位为g；W空0——空白坩埚的恒重空重，单位为g；W供——供试品的称样重量，单位为g。9.2按干品计的炽灼残渣对于含水量较高的供试品，若质量标准中规定炽灼残渣按干品计算，需同时按照《中国药典》2025年版四部通则0832测定供试品的干燥失重，按以下公式计算：炽灼残渣（%，干品）=炽灼残渣（%，湿品）/(1-干燥失重%)×100%9.3结果精密度要求测定结果≥0.01%时，保留两位有效数字；测定结果<0.01%时，报告为“<0.01%”，本方法的定量限为0.01%，检出限为0.005%。10方法学验证要求本方法用于生物制品注册申报检验、成品放行检验前，需完成以下方法学验证，验证资料需纳入质量标准制定依据：10.1专属性验证取3批空白基质（不含活性组分和添加无机盐的制剂缓冲液/辅料混合物），按照本方法测定炽灼残渣，空白基质的残渣含量应≤0.01%，证明基质无明显干扰。若空白基质残渣含量超过0.01%，需调整前处理方法消除基质干扰，或在结果计算时扣除空白基质的残渣值。10.2回收率验证向空白基质中加入已知量的优级纯硫酸钠（105℃干燥至恒重），设置低、中、高三个添加水平，分别为0.05%、0.1%、0.5%，每个添加水平做3份平行样，平均回收率应在90%~110%之间，回收率的相对标准偏差（RSD）≤10%。10.3精密度验证10.3.1日内精密度：取同一份均质供试品，由同一操作人员在同一天内连续测定6次，测定结果的RSD≤10%。10.3.2日间精密度：取同一份均质供试品，由3名不同操作人员在3个不同日期分别测定2次，测定结果的RSD≤15%。10.4耐用性验证分别改变炽灼温度（±50℃）、炽灼时间（±30min）、硫酸加入量（±0.5ml）参数，测定同一份供试品的炽灼残渣，不同参数下的测定结果相对偏差≤10%，证明方法耐用性符合要求。11结果判定11.1常规生物制品的炽灼残渣限值如下，具体限值以各品种的质量标准规定为准：①重组蛋白类、抗体类、多肽类制品≤0.1%；②血液制品、人血白蛋白制剂≤0.05%；③冻干制剂药用辅料（蔗糖、甘氨酸、甘露醇等）≤0.1%；④无佐剂疫苗成品≤0.2%；⑤含佐剂混悬制剂全品残渣限值根据佐剂添加量另行规定。11.2若供试品的测定结果符合质量标准限值要求，判定为“符合规定”；若测定结果超出限值，需重新取样进行双份平行测定，复测结果均符合限值要求的判定为“符合规定”，复测仍有1份及以上超出限值的判定为“不符合规定”。12偏差处理12.1平行样相对偏差超过20%：常见原因包括①供试品均质不充分，尤其是混悬类、固态供试品；②炭化过程中供试品溢出或局部燃烧；③坩埚恒重不符合要求；④天平称量误差；⑤冷却时间不一致。处理方式：重新将供试品充分均质，严格控制炭化温度和加热速率，检查坩埚恒重记录和天平校准状态，统一冷却时间后重新测定。12.2空白残渣值超过0.3mg：常见原因包括①浓硫酸纯度不足，硫酸盐杂质超标；②坩埚未清洗干净，内壁残留杂质；③马弗炉炉膛内有残留灰分，落入坩埚；④干燥器内干燥剂失效，坩埚冷却过程中吸水；⑤浓硫酸滴加量不一致。处理方式：更换符合要求的优级纯浓硫酸，重新用10%硝酸煮洗坩埚，清理马弗炉炉膛，更换干燥剂，统一浓硫酸滴加量后重新进行空白试验。12.3炽灼后残渣为黑色：常见原因包括①硫酸加入量不足，碳粒未完全氧化；②炽灼温度过低，氧化不充分；③炽灼时间不足；④供试品含过多难氧化的有机聚合物。处理方式：向残渣中再次加入0.5ml浓硫酸，重新进行硫酸蒸发和炽灼处理，适当延长炽灼时间30min~60min，直至残渣变为灰白色或浅黄色。12.4测定结果远高于预期值：常见原因包括①供试品储存过程中被无机杂质污染；②取样过程中引入外源杂质（如胶塞碎屑、实验台灰尘）；③坩埚被腐蚀，材质脱落引入残渣；④空白校正有误。处理方式：检查供试品的储存状态和包装完整性，确认是否被污染，更换未使用的新坩埚重新测定，重新校正空白值。13生物安全与废弃物处理13.1生物安全要求①涉及感染性生物制品的操作需在二级以上生物安全柜内进行，操作人员需穿戴全套生物安全防护装备，样品灭活处理需做好记录，确保灭活完全；②炭化、硫酸处理过程必须在通风橱内进行，避免浓硫酸飞溅、有机蒸汽、三氧化硫烟雾对操作人员造成伤害；③取放高温坩埚时必须使用坩埚钳，避免高温烫伤，高温坩埚不得直接放在木质或塑料实验台上，需置于耐高温陶瓷垫板上；④马弗炉使用过程中需定期检查温度，避免温度过高引发火灾，操作结束后关闭电源，待炉温降至室温后再关闭炉门。13.2废弃物处理①实验产生的废硫酸、酸性废液需加入过量饱和碳酸氢钠溶液中和至pH6~9后，排入实验室废水处理系统；②炽灼后的无机残渣、废弃坩埚属于一般化学废弃物，装入密封的耐酸塑料容器中，交由具备资质的危险废物处理单位处置；③接触感染性样品的一次性防护用品、废弃样品需装入专用的感染性废弃物容器中，121℃高压灭菌30min后，按医疗废物处理要求处置；④实验产生的有机废