生物制品钙盐测定指南（试行）

生物制品钙盐测定指南（试行）一、适用范围本指南适用于人用生物制品（疫苗类、抗毒素及抗血清类、血液制品类、重组治疗性生物制品类、微生态制剂类、体外诊断试剂用原材料类等）的原液、半成品、成品及工艺中间体中钙盐的定量测定，特殊品种如含钙纳米颗粒、放射性钙标记制品、细胞基质培养物等可参照本指南优化方法后开展测定。二、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0406原子吸收分光光度法《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0411电感耦合等离子体发射光谱法《中华人民共和国药典》2025年版三部通则0701电位滴定法与永停滴定法GB/T601-2016化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法三、术语和定义3.1钙盐总量：指供试品中所有形态（游离态、结合态、络合态）存在的钙元素总含量，结果以Ca元素计或对应钙盐化合物（如氯化钙、葡萄糖酸钙、枸橼酸钙等）计，需在报告中明确计重形式。3.2游离钙：指供试品中以离子状态存在的活性钙，不含与蛋白、佐剂、络合剂结合的结合态钙，测定时需采用非消解、非蛋白沉淀的前处理方法。3.3检出限：指特定方法可定性检出钙的最低浓度，本指南涉及方法的检出限为：EDTA络合滴定法0.01mg/mL，火焰原子吸收分光光度法（以下简称AAS法）0.03μg/mL，电感耦合等离子体发射光谱法（以下简称ICP-OES法）0.01μg/mL，钙离子选择电极法（以下简称ISE法）0.001mmol/L。3.4定量限：指特定方法可准确定量钙的最低浓度，本指南涉及方法的定量限为：EDTA络合滴定法0.03mg/mL，AAS法0.1μg/mL，ICP-OES法0.05μg/mL，ISE法0.005mmol/L。四、基本要求4.1人员要求：操作人员需经过滴定分析、光谱分析或电化学分析专项培训，考核合格后方可开展操作，能够独立完成方法验证、数据处理及异常情况排查。4.2环境要求：滴定操作环境温度控制在10~30℃，温度波动≤5℃；光谱及电化学检测环境温湿度符合仪器使用要求，相对湿度≤80%，无粉尘、无腐蚀性气体，配备通风橱及应急防护设施。4.3器皿要求：所有接触样品及试剂的玻璃、塑料器皿均需经10%（v/v）优级纯硝酸浸泡24h以上，取出后依次用自来水、实验室一级水冲洗3次，烘干后密封保存，避免钙污染。4.4试剂要求：试验用水为符合GB/T6682规定的一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm；滴定液需按GB/T601要求标定，光谱及电化学用试剂优先选用优级纯及以上级别，标准物质需选用有证标准物质或基准试剂。五、方法选择原则5.1钙含量≥0.1mg/mL的供试品，如含钙佐剂疫苗、血液制品、添加钙盐的缓冲液等，优先选用EDTA络合滴定法，方法准确度高、操作简便、无需大型仪器。5.2钙含量在0.1μg/mL~10μg/mL的供试品，如重组蛋白制品、工艺用水、透析中间体等残留钙测定，优先选用AAS法，方法灵敏度高、特异性好。5.3钙含量在0.05μg/mL~100μg/mL的供试品，或需同时测定多种金属元素的样品，优先选用ICP-OES法，方法线性范围宽、检测效率高。5.4需测定游离钙的供试品，如疫苗佐剂游离钙测定、血液制品生理活性钙测定，优先选用ISE法，样品前处理简单、可直接测定。六、EDTA络合滴定法6.1测定原理在pH10.0的氨-氯化铵缓冲体系中，钙、镁离子可与EDTA二钠形成稳定的1:1型络合物，钙羧酸指示剂可与钙离子形成紫红色络合物，其稳定性弱于EDTA-钙络合物，用EDTA二钠滴定液滴定至终点时，钙离子全部与EDTA络合，指示剂游离，溶液由紫红色变为纯蓝色，根据滴定液消耗量计算钙含量。需消除镁离子干扰时，可将体系pH调至12.0，镁离子生成氢氧化镁沉淀，仅钙离子参与反应，消除基质干扰。6.2试剂与材料6.2.1氨-氯化铵缓冲液（pH10.0）：称取54.0g氯化铵，加200mL一级水溶解，加入350mL浓氨水（25%~28%），加水定容至1000mL，混匀，密封保存，有效期6个月。6.2.2钙羧酸指示剂：称取0.1g钙羧酸，加10.0g经105℃干燥2h的氯化钠，置于研钵中研磨均匀，装入棕色瓶，干燥器中保存，有效期6个月。6.2.3EDTA二钠滴定液（0.05mol/L）：称取18.61g乙二胺四乙酸二钠二水合物，加适量一级水溶解，定容至1000mL，混匀。标定方法：取经110℃干燥至恒重的基准碳酸钙0.12g（精密称定，精确至0.0001g），置锥形瓶中，加5mL1mol/L优级纯盐酸溶解，加50mL一级水，用2mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0，加10mL氨-氯化铵缓冲液（pH10.0），加约30mg钙羧酸指示剂，用待标定EDTA二钠滴定液滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色，30s不褪色即为终点，同时做空白试验。滴定液浓度计算公式：C(EDTA)=m/[(V1-V0)×0.10009]，其中C为EDTA二钠滴定液浓度（mol/L），m为基准碳酸钙称样量（g），V1为基准碳酸钙消耗滴定液体积（mL），V0为空白消耗滴定液体积（mL），0.10009为每毫摩尔碳酸钙的质量（g/mmol）。滴定液标定需至少3份平行样，标定结果RSD≤0.1%，有效期3个月，环境温度波动超过5℃时需重新标定。如需低浓度滴定液，可将0.05mol/L滴定液用一级水稀释为0.01mol/L，临用前标定。6.2.4掩蔽剂：100g/L三乙醇胺溶液（掩蔽铁、铝离子）、20g/L硫化钠溶液（掩蔽铜、铅离子）、10g/LL-半胱氨酸溶液（掩蔽锌、镉离子）。6.3样品前处理6.3.1无蛋白澄清样品（如工艺缓冲液、透析液）：直接精密量取适量供试品（含钙量5~10mg），无需前处理，直接进入滴定步骤。6.3.2含蛋白样品（如血液制品、重组蛋白原液）：精密量取1.0mL供试品，加1.0mL100g/L三氯乙酸溶液，混匀后静置10min沉淀蛋白，10000rpm离心10min，取上清液，沉淀用2mL一级水洗涤1次，离心后合并上清液，定容至适宜体积后待测。6.3.3含佐剂或难溶基质样品（如铝佐剂疫苗、钙佐剂疫苗、冻干制剂）：精密称取0.5g供试品，置聚四氟乙烯消解管中，加5mL优级纯硝酸，120℃电热板消解至溶液澄清，赶酸至近干，加1mL1mol/L盐酸溶解残渣，定容至适宜体积后待测。6.3.4总钙测定需采用消解前处理，游离钙测定需采用超滤法前处理：取1.0mL供试品，加入截留分子量10kD的超滤管中，4℃12000rpm离心10min，取超滤液直接滴定。6.4操作步骤精密量取处理后的供试品溶液，置250mL锥形瓶中，加一级水至50mL，用2mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0~7.5，加10mL氨-氯化铵缓冲液（pH10.0），根据基质干扰情况加入1~2mL对应掩蔽剂，加约30mg钙羧酸指示剂，用EDTA二钠滴定液滴定至溶液由紫红色变为纯蓝色，30s不褪色即为终点，记录消耗滴定液体积。同时做空白试验，空白消耗滴定液体积不得超过0.03mL。如样品中镁离子浓度超过钙浓度10倍，需将体系pH调至12.0：取供试品溶液加水至50mL，加5mL2mol/L氢氧化钠溶液，摇匀后放置5min使镁离子完全沉淀，加30mg钙羧酸指示剂，用EDTA二钠滴定液滴定至终点。6.5结果计算钙（Ca，mg/mL）=C×(V供-V空)×40.08/V样其中：C为EDTA二钠滴定液浓度（mol/L）；V供为供试品消耗滴定液体积（mL）；V空为空白消耗滴定液体积（mL）；40.08为钙的摩尔质量（g/mol）；V样为供试品取样体积（mL）。如以钙盐化合物计，需乘以对应换算系数：无水氯化钙换算系数为2.769，二水氯化钙换算系数为3.669，葡萄糖酸钙换算系数为3.668，枸橼酸钙换算系数为2.497。6.6方法学验证要求准确度：加样回收率需在95.0%~105.0%范围内；精密度：重复性RSD≤2.0%，中间精密度RSD≤3.0%；专属性：10倍浓度的常见离子（镁、钠、钾、磷酸根、硫酸根）不得干扰测定；线性：相关系数r≥0.999。6.7注意事项6.7.1指示剂需按要求保存，如出现结块、变色则不可使用，否则会导致终点不清晰。6.7.2滴定接近终点时需逐滴加入滴定液，充分摇匀，避免滴定过量。6.7.3避免使用钙含量高的自来水冲洗器皿，所有器皿需经硝酸浸泡处理。七、火焰原子吸收分光光度法（AAS法）7.1测定原理样品经消解处理后，导入原子吸收分光光度计，经空气-乙炔火焰原子化，钙原子吸收422.7nm的特征共振线，吸光度与钙含量在一定范围内呈线性关系，外标法定量。加入镧溶液作为释放剂，可消除磷酸根、硫酸根等阴离子对钙原子化的抑制作用。7.2试剂与材料7.2.1优级纯硝酸、优级纯盐酸、30%优级纯过氧化氢。7.2.2镧溶液（20g/L）：称取23.45g氧化镧（高纯级），缓慢加入75mL优级纯盐酸，搅拌至完全溶解，加一级水定容至1000mL，密封保存，有效期3个月。7.2.3钙标准储备液（1000μg/mL）：采用国家有证标准物质，或自行配制：取经110℃干燥至恒重的基准碳酸钙0.2497g，加5mL1mol/L盐酸溶解，加一级水定容至100mL，4℃密封保存，有效期12个月。7.2.4钙标准工作系列：临用前将标准储备液用0.5%（v/v）硝酸稀释为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg/mL的系列标准溶液，每10mL标准溶液中加入1mL镧溶液，混匀后待测。7.3样品前处理7.3.1湿法消解：精密量取0.5~2.0mL供试品（或0.2~1.0g固体供试品），置聚四氟乙烯消解管中，加5mL优级纯硝酸、1mL过氧化氢，加盖浸泡过夜，置于电热板上120℃消解2h，升温至160℃赶酸至溶液剩余约0.5mL，取下冷却，加1mL1mol/L盐酸溶解残渣，转移至25mL容量瓶中，加2.5mL镧溶液，加一级水定容至刻度，摇匀待测。同时做空白试验。7.3.2微波消解：难消解样品可采用微波消解：取供试品加5mL硝酸、2mL过氧化氢，置于微波消解罐中，按程序消解：120℃保持5min，150℃保持5min，180℃保持15min，冷却后取出，转移至电热板赶酸，后续步骤同湿法消解。7.3.3无基质干扰的澄清样品（如工艺用水、透析液）：可直接精密量取适量供试品，加镧溶液后定容至适宜体积，直接测定。7.4操作步骤7.4.1仪器参数设置：钙空心阴极灯，灯电流3~5mA，波长422.7nm，狭缝宽度0.5nm，空气-乙炔火焰，空气流量15L/min，乙炔流量2.0L/min，燃烧器高度7mm，开启氘灯背景校正。7.4.2测定：依次测定空白溶液、标准系列溶液的吸光度，以钙浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，相关系数r≥0.9990。再测定供试品溶液的吸光度，代入标准曲线计算供试品溶液中钙的浓度。7.5结果计算钙（Ca，μg/mL）=(C供-C空)×V定容/V样其中：C供为供试品溶液中钙浓度（μg/mL）；C空为空白溶液中钙浓度（μg/mL）；V定容为供试品溶液定容体积（mL）；V样为供试品取样体积（mL）。7.6方法学验证要求准确度：加样回收率需在90.0%~110.0%范围内；精密度：重复性RSD≤5.0%，中间精密度RSD≤7.0%；定量限≤0.1μg/mL；线性r≥0.999。7.7注意事项7.7.1乙炔纯度需≥99.99%，避免杂质干扰测定，每次测定结束后需吸喷一级水10min清洗雾化器及燃烧头，避免盐分残留堵塞管路。7.7.2供试品溶液浓度超出线性范围时，需用0.5%硝酸稀释后重新测定，稀释后浓度需处于标准曲线范围内，稀释倍数不得超过100倍。7.7.3镧溶液需现配现用或3个月内使用，如出现浑浊则不可使用。八、电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES法）8.1测定原理样品经消解处理后，由载气引入氩气等离子体中，经高温原子化、激发，钙原子发射出317.933nm或393.366nm的特征谱线，发射强度与钙含量呈线性关系，外标法定量。8.2试剂与材料8.2.1优级纯硝酸、优级纯盐酸、30%优级纯过氧化氢。8.2.2钙标准储备液（1000μg/mL）：同AAS法。8.2.3钙标准工作系列：临用前用2%（v/v）硝酸稀释为0、0.05、0.1、1.0、10.0、100.0μg/mL的系列标准溶液。8.3样品前处理：同AAS法样品前处理，无需添加镧溶液。8.4操作步骤8.4.1仪器参数设置：射频功率1150W，等离子气流量15L/min，辅助气流量0.5L/min，雾化气流量0.8L/min，泵速1.5mL/min，积分时间15s，选择钙特征谱线317.933nm（无铁离子干扰样品可选择393.366nm）。8.4.2测定：依次测定空白、标准系列溶液的发射强度，绘制标准曲线，相关系数r≥0.9995，再测定供试品溶液的发射强度，代入曲线计算浓度。8.5结果计算：同AAS法。8.6方法学验证要求准确度：加样回收率90.0%~110.0%；精密度：重复性RSD≤4.0%，中间精密度RSD≤6.0%；定量限≤0.05μg/mL；线性r≥0.9995。8.7注意事项8.7.1氩气纯度需≥99.999%，每次测定前需进行波长校正，保证特征谱线位置准确。8.7.2高盐样品测定后需清洗进样系统5min以上，避免残留干扰后续样品测定。九、钙离子选择电极法（ISE法）9.1测定原理钙离子选择电极的敏感膜可选择性结合游离钙离子，产生膜电位，在一定范围内膜电位与游离钙离子活度的对数呈线性关系，符合能斯特方程，通过校准曲线法计算游离钙浓度，加入离子强度调节剂保证样品与标准液离子强度一致，消除活度系数差异。9.2试剂与材料9.2.1离子强度调节剂（0.5mol/LKCl溶液，pH7.4）：称取37.28g氯化钾，加900mL一级水溶解，用0.1mol/L氢氧化钾调pH至7.4，定容至1000mL，有效期3个月。9.2.2钙标准溶液：1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L钙标准液（含0.25mol/LKCl，pH7.4），采用有证标准物质，4℃保存，有效期6个月。9.3样品前处理：游离钙测定无需消解，精密量取1.0mL供试品，如样品离子强度低，需加1.0mL离子强度调节剂，混匀后待测；如样品pH偏离5~9范围，需用稀盐酸或稀氢氧化钾调pH至7.4。9.4操作步骤9.4.1仪器校准：采用两点校准法，依次测定1mmol/L和10mmol/L钙标准液的电位，仪器自动计算斜率，25℃时理论斜率为29.58mV/decade，实际斜率需在理论值的95%~105%范围内。9.4.2样品测定：将电极插入供试品溶液中，搅拌均匀，待电位稳定后（1min内变化≤0.1mV）记录电位值，代入校准曲线计算游离钙浓度。9.5结果计算：由仪器直接给出游离钙浓度，或根据能斯特方程自行计算。9.6方法学验证要求准确度：回收率92.0%~108.0%；精密度：重复性RSD≤3.0%；定量限≤0.005mmol/L。9.7注意事项9.7.1测定温度需控制在25±1℃，温度波动超过1℃需重新校准仪器。9.7.2电极使用前需活化2h，使用后用一级水冲洗干净，置于电极保存液中保存。十、质量控制要求10.1每批次测定需至少做2份平行样，平行样相对偏差要求：EDTA滴定法≤2.0%，AAS/ICP-OES法≤5.0%，ISE法≤3.0%，超出范围需重新测定。