生物制品含量测定指南（试行）

生物制品含量测定指南（试行）本指南适用于疫苗、治疗性抗体、重组蛋白药物、血液制品、细胞与基因治疗产品等各类生物制品的原液、中间品、成品的含量测定工作，覆盖药物研发阶段的质量研究、生产过程的在线质量控制、上市产品的批签发检验及市场监督抽检全场景，为生物制品含量测定的方法选择、操作规范、结果判定提供技术指导。1规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部ICHQ2(R1)分析方法验证指导原则《生物制品质量控制分析方法验证技术指导原则》（NMPA，2022年）《细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点》（NMPA，2018年）《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（NMPA，2022年）2术语与定义2.1生物制品含量：指生物制品中具有预期生物学功能的目标活性组分的绝对量或相对量，包括蛋白总量、特异性抗原/抗体含量、生物学活性单位、核酸拷贝数、活性细胞数、病毒滴度等指标，是反映生物制品有效性的核心质量属性。2.2绝对含量：通过溯源至国家/国际法定标准品的定量方法测定得到的目标组分的实际质量或活性单位，无需参考同批次其他组分的含量。2.3相对含量：目标组分占样品总组分的比例，如重组蛋白的单体占比、质粒的超螺旋比例、CAR-T细胞的阳性率等。2.4加标回收率：指向空白基质或已知含量的样品中加入一定量的标准品后，测定得到的含量与理论加入量的比值，用于评价方法的准确度。2.5半数有效量（ED₅₀）：指能引起50%阳性反应的样品浓度或剂量，是生物学活性含量测定的常用计算指标。3基本要求3.1人员要求所有从事生物制品含量测定的人员需经过生物分析专业培训、生物安全培训及岗位操作考核合格后持证上岗，熟悉待测生物制品的理化特性、生物活性特性及生物安全防护等级要求，掌握所使用分析方法的原理、操作流程及异常情况处置流程。3.2环境要求含量测定操作需在符合对应洁净度及生物安全等级的实验区域内开展：病毒类、活细胞类生物制品的含量测定需在符合BSL-2及以上等级的生物安全实验室进行，实验区域分区明确，避免交叉污染；蛋白类、核酸类样品的前处理需在温度控制在20~25℃、相对湿度40%~60%的区域进行，避免光照、高温导致的样品降解；涉及放射性、毒性试剂的含量测定需在专用负压通风橱内操作。3.3设备要求所有用于含量测定的设备需按计量法规要求定期校准并在有效期内使用：紫外-可见分光光度计需定期校准吸光度准确度、波长准确度，允许偏差分别≤±0.01A、≤±1nm；酶标仪需定期校验吸光度线性、通道差，通道变异系数≤2%；高效液相色谱仪需定期校验泵流量精度、柱温箱温度准确度、检测器线性，流量精度RSD≤0.5%；荧光定量PCR仪需定期校准孔间差、荧光线性，扩增效率验证符合90%~110%要求；移液器、容量瓶等计量器具需定期校准，移液器的容量允许偏差≤±1%（10~1000μL量程）。3.4样品要求待测样品需具有唯一性标识，标注样品名称、批号、生产阶段、储存条件、有效期等信息；样品的采集、转运、储存需符合产品说明书规定的条件，避免反复冻融（冻融次数不得超过3次，除非经过稳定性验证）；待检、在检、已检样品需分区存放，标识清晰，避免混淆；对于易降解的样品，测定前需添加蛋白酶抑制剂、RNase抑制剂等稳定剂，确保样品在测定过程中含量稳定。4通用测定方法4.1蛋白总量测定法4.1.1紫外分光光度法原理：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸残基在280nm波长处存在特征紫外吸收，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白浓度呈线性关系；核酸的嘌呤、嘧啶碱基在260nm波长处存在特征吸收，可同步测定校正杂质干扰。适用范围：适用于纯度≥95%、无强紫外吸收杂质干扰的重组蛋白、抗体类样品的快速定量。操作步骤：①空白校正：采用与样品基质完全一致的缓冲液作为空白，进行基线归零；②样品稀释：将样品稀释至吸光度处于0.1~1.0A的线性范围内，每个样品至少制备2份平行稀释液；③测定：在280nm波长下测定吸光度，记录数值；④计算：蛋白含量（mg/mL）=A₂₈₀/消光系数×稀释倍数，其中消光系数可通过氨基酸序列计算得到，或采用凯氏定氮法标定。注意事项：若样品存在核酸污染，需同时测定A₂₆₀/A₂₈₀比值，蛋白样品的A₂₆₀/A₂₈₀比值应处于0.5~0.8范围，超出范围需采用校正公式计算：蛋白含量（mg/mL）=（1.45×A₂₈₀-0.74×A₂₆₀）×稀释倍数。4.1.2BCA法原理：碱性条件下蛋白质可将Cu²⁺还原为Cu⁺，Cu⁺与BCA试剂结合生成紫色复合物，复合物在562nm波长处的吸光度与蛋白浓度呈线性关系。适用范围：适用于总蛋白含量0.005~2mg/mL的样品定量，耐受低浓度去垢剂干扰。操作步骤：①标准曲线制备：采用牛血清白蛋白（BSA）作为标准品，配制0、0.005、0.01、0.05、0.2、1.0、2.0mg/mL的系列浓度标准溶液，每个浓度至少2份平行；②试剂配制：BCA试剂A与试剂B按50:1的比例混合均匀，临用前配制；③反应：向每管样品、标准品、空白中加入20倍体积的BCA工作液，混匀后37℃孵育30min；④测定：冷却至室温后在562nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线计算样品含量。注意事项：EDTA浓度≥10mmol/L、二硫苏糖醇（DTT）浓度≥1mmol/L会干扰测定，需采用透析、丙酮沉淀法去除干扰物，或采用基质匹配的标准曲线。4.1.3凯氏定氮法原理：蛋白质中的氮元素经浓硫酸消解转化为铵盐，经蒸馏、硼酸吸收后用盐酸标准溶液滴定，根据总氮量换算为蛋白含量（蛋白质平均含氮量为16%）。适用范围：适用于蛋白标准品的绝对定值，以及无含氮杂质干扰的高纯度蛋白样品定量。操作步骤：①消解：取适量样品加入凯氏定氮瓶中，加入浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾，加热消解至溶液呈澄清蓝绿色；②蒸馏：消解液冷却后加入过量氢氧化钠溶液，加热蒸馏，释放的氨气用2%硼酸溶液吸收；③滴定：用已知浓度的盐酸标准溶液滴定吸收液至蓝紫色消失，记录盐酸消耗量，计算总氮量及蛋白含量。注意事项：需同时做空白试验校正试剂误差；若样品含有非蛋白氮，需采用三氯乙酸沉淀蛋白后分别测定总氮和非蛋白氮，扣除非蛋白氮后计算蛋白含4.2特异性组分含量测定法4.2.1酶联免疫吸附试验（ELISA）原理：利用抗原抗体的特异性结合反应，通过酶标记二抗催化底物显色，吸光度与目标组分含量呈线性关系。适用范围：适用于复杂基质中特异性抗原、抗体的定量，检测限可低至ng/mL级别。操作步骤：①包被：将特异性抗体包被至酶标板孔，4℃孵育过夜后洗板；②封闭：加入5%脱脂奶或1%BSA封闭液，37℃孵育1h后洗板；③加样：加入系列浓度的标准品、待测样品，37℃孵育1h后洗板；④加酶标二抗：37℃孵育1h后洗板；⑤显色：加入TMB底物溶液，室温避光孵育10~15min，加入2mol/L硫酸终止反应；⑥测定：在450nm波长下测定吸光度，采用四参数拟合标准曲线计算样品含量。注意事项：平行样变异系数需≤10%；需验证基质效应，加标回收率应处于80%~120%范围，若存在强基质干扰需采用基质匹配标准曲线。4.2.2高效液相色谱法（HPLC）原理：利用目标组分与杂质在色谱柱固定相上的保留行为差异实现分离，通过检测器的响应值定量。适用范围：分子排阻色谱（SEC）用于测定蛋白单体、多聚体含量；反相色谱（RP-HPLC）用于测定多肽、重组蛋白、小分子偶联药物含量；离子交换色谱（IEC）用于测定电荷异质性组分含量。操作步骤：①色谱条件优化：根据样品特性选择合适的色谱柱、流动相、流速、柱温；②系统适用性试验：连续进样5针标准品，峰面积RSD≤1%，分离度≥1.5，拖尾因子处于0.8~1.2范围；③样品测定：进样标准品和待测样品，采用外标法或内标法计算含量。注意事项：需采用二极管阵列检测器或质谱验证目标峰纯度，峰纯度因子≥994.3生物学活性含量测定法4.3.1细胞病变抑制法原理：抗病毒类生物制品可抑制病毒对宿主细胞的杀伤作用，通过测定细胞病变程度计算活性。适用范围：适用于干扰素、抗病毒疫苗、中和抗体的活性测定。操作步骤：①细胞铺板：将对数生长期的宿主细胞接种至96孔板，培养至汇合度达到80%；②加样：加入梯度稀释的待测样品和标准品，37℃孵育2h；③加病毒：加入100TCID₅₀的攻击病毒，培养3~5天；④读数：观察细胞病变程度，采用Reed-Muench法计算ED₅₀，与标准品比较得到样品活性单位。注意事项：细胞代次需控制在规定范围内，病毒滴度需预先标定，平行样活性变异系数≤20%。4.3.2细胞增殖/杀伤法原理：细胞因子可促进对应的依赖性细胞增殖，抗体药物可特异性杀伤靶细胞，通过测定细胞活力计算活性。适用范围：适用于细胞因子、ADC药物、双特异性抗体的活性测定。操作步骤：①细胞处理：收集对数生长期的靶细胞，调整浓度至合适范围；②加样：加入梯度稀释的样品和标准品，共培养24~72h；③活力检测：加入CCK-8试剂或ATP检测试剂，测定荧光或吸光度值；④计算：采用四参数拟合剂量反应曲线，计算ED₅₀，与标准品比较得到相对活性。4.4核酸类组分含量测定法4.4.1荧光定量PCR法（qPCR）原理：在PCR扩增过程中，通过荧光探针实时监测扩增产物量，与标准曲线比较实现定量。适用范围：适用于mRNA疫苗、质粒、基因治疗产品、溶瘤病毒的核酸拷贝数定量。操作步骤：①标准曲线制备：采用梯度稀释的质粒标准品，浓度范围覆盖待测样品的10~10⁶拷贝/μL；②反应体系配制：加入引物、探针、PCR预混液、模板，每个样品至少3个复孔；③扩增：按照预设程序进行扩增，记录Ct值；④计算：绘制Ct值与拷贝数对数的标准曲线，计算样品的核酸拷贝数。注意事项：扩增效率需处于90%~110%范围，R²≥0.99，复孔Ct值变异系数≤24.4.2数字PCR法（ddPCR）原理：将反应体系分散为数万个微滴，扩增后读取阳性微滴比例，通过泊松分布计算核酸绝对拷贝数，无需标准曲线。适用范围：适用于低拷贝核酸、存在基质干扰的样品的绝对定量。注意事项：微滴生成率≥80%，阳性微滴与阴性微滴分群清晰，定量下限可达1拷贝/μ4.5细胞类产品含量测定法4.5.1流式细胞术计数法原理：通过荧光标记的特异性抗体识别细胞表面标志物，结合计数微球实现细胞绝对计数和阳性率测定。适用范围：适用于CAR-T细胞、干细胞、免疫细胞治疗产品的活性细胞计数、阳性率测定。操作步骤：①样品处理：取适量细胞悬液，加入荧光标记的靶标抗体、死活染料，室温避光孵育15min；②上机检测：加入已知浓度的计数微球，采集至少10000个细胞；③分析：通过流式分析软件计算活细胞浓度、靶标阳性率。注意事项：需设置同型对照、空白对照排除非特异性染色，阳性率测定的变异系数≤105方法学验证要求5.1特异性需证明方法仅对目标组分有响应，无基质、相关杂质、降解产物的干扰：免疫方法的交叉反应率≤1%；色谱方法的峰纯度因子≥990；生物学活性方法的阴性对照信号值≤定量限的10%。5.2线性与范围至少配制5个浓度梯度的标准品，相关系数R²≥0.99（生物学活性方法R²≥0.98）；测定范围需覆盖样品含量的70%~130%，或质量标准规定的限度范围。5.3准确度采用加标回收率评价，至少设置低、中、高3个浓度水平，每个浓度3份平行样：理化方法回收率需处于85%~115%；免疫方法回收率需处于80%~120%；生物学活性方法回收率需处于70%~130%；核酸方法回收率需处于80%~120%。5.4精密度重复性：同一人员、同一设备、同一天测定6份平行样品，RSD要求：理化方法≤5%，免疫方法≤10%，生物学活性方法≤20%，核酸方法≤15%。中间精密度：不同人员、不同设备、不同日期测定，RSD较重复性放宽5%。5.5检测限与定量限检测限为信噪比≥3的浓度，定量限为信噪比≥10的浓度，定量限需低于质量标准规定限度的50%。5.6耐用性考察方法参数微小变化的影响（pH±0.2、温度±2℃、孵育时间±10%、不同批次试剂/色谱柱），测定结果RSD≤10%则耐用性符合要求。6不同类别生物制品含量测定细则6.1疫苗类灭活疫苗：抗原含量采用ELISA或定量WesternBlot测定，病毒滴度采用TCID₅₀或蚀斑试验测定，总蛋白含量采用Lowry法测定。mRNA疫苗：总mRNA含量采用紫外法测定，完整mRNA占比采用毛细管凝胶电泳测定，包封率采用核糖核酸酶消化法测定，表达活性采用细胞转染试验测定。6.2抗体类单抗：总蛋白含量采用紫外分光光度法（消光系数法）测定，单体含量采用SEC-HPLC测定，结合活性采用SPR法测定，细胞活性采用靶细胞杀伤法测定。ADC：总蛋白含量采用紫外法测定，药物抗体比（DAR）采用疏水色谱或质谱测定，游离小分子药物含量采用RP-HPLC测定。6.3细胞与基因治疗类CAR-T细胞：活细胞计数采用台盼蓝染色法，CAR阳性率采用流式细胞术测定，载体拷贝数采用ddPCR