生物制品铝盐测定指南（试行）

生物制品铝盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、混合铝佐剂制备的疫苗、抗毒素、重组蛋白制剂、多肽类生物制品的原料、中间品、成品中总铝含量、游离铝含量的测定，也适用于铝佐剂原液的质量控制检测。其他含铝生物制品的铝含量测定可参照本指南执行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部生物制品理化分析通则《中华人民共和国药典》2025年版四部通则0406原子吸收分光光度法、通则0407电感耦合等离子体原子发射光谱法、通则0401紫外-可见分光光度法USP<401>AluminumDeterminationEP2.4.13AluminumbyAtomicAbsorptionSpectrometryGB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义3.1铝佐剂：以铝盐为主要成分的免疫佐剂，包括氢氧化铝佐剂（羟基氧化铝聚合体）、磷酸铝佐剂（羟基磷酸铝聚合体）、混合铝佐剂（氢氧化铝与磷酸铝按比例混合的制剂），可通过吸附作用结合抗原，提升免疫原性。3.2总铝含量：生物制品中所有形态铝元素的总质量浓度，包括结合态铝、游离态铝、佐剂颗粒结合铝的总和。3.3游离铝含量：生物制品中未与抗原/活性成分、佐剂大颗粒结合的可溶性铝离子、小分子铝配合物的质量浓度，是评价佐剂抗原结合效率的核心指标。3.4结合铝含量：总铝含量扣除游离铝含量后，与抗原/活性成分结合的铝佐剂对应的铝质量浓度。4基本要求4.1人员要求检测人员需经原子吸收分光光度法、分光光度法、生物制品样品前处理专项培训并考核合格，熟悉强酸消解、高压气体操作的安全防护要求，严格按照本指南操作。4.2环境与耗材要求4.2.1前处理与检测区域需设置独立的无铝污染实验室，避免与含铝试剂、其他重金属检测区域交叉污染。试验台采用聚丙烯材质，避免使用普通玻璃台面。4.2.2所有接触样品的耗材均为聚丙烯、聚四氟乙烯材质，禁止使用普通玻璃器皿（玻璃中含游离铝易溶出干扰检测）。若需使用玻璃器皿，需经20%（v/v）优级纯硝酸浸泡≥24h，再用一级水冲洗3次以上，烘干后使用。4.2.3移液枪头、离心管、消解罐使用前需经10%（v/v）优级纯硝酸浸泡≥12h，一级水冲洗3次后晾干备用。4.3试剂要求4.3.1试验用水为GB/T6682规定的一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm，总有机碳≤50ppb，铝背景值≤0.1ppb。4.3.2所有酸试剂为电子级或优级纯，铝背景值≤1ppb；其他试剂为优级纯及以上级别。4.3.3铝标准品为国家计量主管部门授权的有证标准物质，单元素铝标准溶液标称浓度1000μg/mL，扩展不确定度≤0.5%（k=2）。4.4设备要求4.4.1原子吸收分光光度计：配置火焰原子化器（支持乙炔-一氧化二氮火焰）、石墨炉原子化器、铝空心阴极灯，波长准确度≤±0.2nm。4.4.2消解设备：微波消解仪（最高工作温度≥200℃，最高压力≥10MPa）、电热板（控温精度±5℃）、马弗炉（控温精度±10℃）。4.4.3其他设备：电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES，可选，波长分辨率≤0.005nm）、高速冷冻离心机（最大转速≥15000g，控温范围2~8℃）、100kDa截留分子量超滤管、紫外可见分光光度计、电子天平（分度值≤0.1mg）、恒温干燥箱。5总铝含量测定总铝含量测定根据样品浓度范围选择对应方法：铝含量≥10μg/mL的样品（铝佐剂原液、中间品）优先采用第一法火焰原子吸收分光光度法；铝含量<10μg/mL的样品（成品制剂、低铝含量样品）优先采用第二法石墨炉原子吸收分光光度法；无原子吸收设备的实验室可采用第三法铬天青S分光光度法；批量样品检测可采用第四法ICP-OES法。5.1第一法火焰原子吸收分光光度法5.1.1原理样品经强酸消解完全后，所有形态铝转化为可溶性铝离子，在乙炔-一氧化二氮高温火焰中原子化，铝基态原子吸收309.3nm波长的特征谱线，吸光度与铝浓度在一定范围内呈线性关系，与标准曲线比较定量。5.1.2试剂与材料（1）铝标准工作液：量取10mL1000μg/mL铝标准储备液，用0.5%（v/v）硝酸定容至100mL，得到100μg/mL铝标准工作液，4℃密封保存，有效期1个月。（2）消电离剂：10g/L氯化铯溶液，称取1.0g优级纯氯化铯，用0.5%硝酸溶解定容至100mL，4℃保存。（3）优级纯硝酸、优级纯高氯酸。5.1.3仪器条件乙炔流量4.5L/min，一氧化二氮流量10L/min，灯电流5mA，狭缝宽度0.2nm，波长309.3nm，背景校正采用氘灯法。5.1.4操作步骤（1）样品前处理：湿法消解。准确量取0.5~2mL均一样品（固体样品称取0.5~2g，精确至0.1mg）至聚四氟乙烯消解管，加入5mL硝酸、1mL高氯酸，加盖静置12h。置于电热板上程序升温：120℃加热1h，150℃加热2h，180℃加热至冒高氯酸白烟，溶液呈无色澄清透明状；若溶液仍有浑浊，补加2mL硝酸继续消解至澄清。冷却至室温后，用0.5%硝酸转移至25mL容量瓶定容，混匀待测。同步制备3份试剂空白。特殊样品前处理：油乳剂制品先破乳，量取1mL样品加入2mL正己烷，涡旋振荡5min，3000g离心10min，弃去上层油相，取下层水相按上述步骤消解；冻干制品按说明书规定复溶后取样。（2）标准曲线绘制：分别量取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL100μg/mL铝标准工作液至25mL容量瓶，各加入2mL氯化铯溶液，用0.5%硝酸定容，得到浓度为0、2、4、8、12、16、20μg/mL的标准系列溶液。按照仪器条件依次测定吸光度，以铝浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，要求相关系数r≥0.9990。（3）样品测定：量取定容后的样品溶液、试剂空白溶液各25mL，加入2mL氯化铯溶液混匀，按照仪器条件测定吸光度，代入标准曲线得到对应铝浓度。5.1.5结果计算总铝含量（μg/mL）=（C_样-C_空）×V_定容/V_取样式中：C_样为样品溶液中铝浓度（μg/mL）；C_空为试剂空白平均铝浓度（μg/mL）；V_定容为样品消解后定容体积（mL）；V_取样为样品取样体积（mL），固体样品为取样质量（g）。5.1.6注意事项（1）乙炔-一氧化二氮火焰操作需严格遵守安全规程：点火时先开乙炔点燃，再开一氧化二氮；熄火时先关一氧化二氮，再关乙炔，避免回火。（2）消解需完全，若残留有机物会导致吸光度偏低，回收率不合格。5.2第二法石墨炉原子吸收分光光度法5.2.1原理样品经微波消解完全后，注入石墨炉原子化器，经干燥、灰化去除基体干扰，高温原子化后铝基态原子吸收309.3nm特征谱线，吸光度与铝浓度呈线性关系，与标准曲线比较定量，适用于低含量铝样品检测。5.2.2试剂与材料（1）铝标准工作液：量取0.1mL1000μg/mL铝标准储备液，用0.5%硝酸定容至100mL，得到1μg/mL铝标准工作液，现配现用。（2）基体改进剂：1g/L硝酸钯溶液，称取0.1g优级纯硝酸钯，用0.5%硝酸溶解定容至100mL，4℃保存。（3）优级纯硝酸、优级纯30%过氧化氢。5.2.3仪器条件采用热解涂层石墨管（或涂钽石墨管，避免铝吸附），石墨炉程序：干燥120℃，30s；灰化1400℃，20s；原子化2500℃，5s（停气）；净化2700℃，3s。灯电流6mA，狭缝宽度0.2nm，波长309.3nm，背景校正采用塞曼效应法。5.2.4操作步骤（1）样品前处理：微波消解。准确量取0.1~1mL均一样品至微波消解罐，加入5mL硝酸、2mL过氧化氢，密封后按程序消解：120℃爬温5min，保持5min；150℃爬温5min，保持10min；180℃爬温5min，保持15min。消解完成后冷却至室温，泄压后转移至25mL容量瓶，用0.5%硝酸定容，同步制备3份试剂空白。（2）标准曲线绘制：分别量取0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL1μg/mL铝标准工作液至25mL容量瓶，用0.5%硝酸定容，得到浓度为0、4、8、16、32、40ng/mL的标准系列。每样进样20μL，同时加入5μL基体改进剂，按照仪器条件测定吸光度，绘制标准曲线，要求相关系数r≥0.995。（3）样品测定：按上述条件测定样品溶液、试剂空白的吸光度，代入标准曲线得到对应铝浓度。5.2.5结果计算同5.1.5公式。5.2.6注意事项（1）石墨管使用前需进行空烧处理，去除残留铝污染，每批石墨管使用前需做空白验证，空白吸光度≤0.005方可使用。（2）每测定10个样品需插入1次曲线中点质控样，测定值与标称值偏差≤±10%方可继续测定。5.3第三法铬天青S分光光度法5.3.1原理在pH5.5~6.5的乙酸-乙酸钠缓冲体系中，铝离子与铬天青S、聚乙二醇辛基苯基醚形成稳定的蓝色三元络合物，在620nm波长处的吸光度与铝浓度呈线性关系，与标准曲线比较定量。5.3.2试剂与材料（1）铝标准工作液：1μg/mL，同5.2.2（1）。（2）0.5g/L铬天青S溶液：称取0.05g铬天青S，用50%（v/v）乙醇溶液溶解定容至100mL，避光保存，有效期1周。（3）10g/L聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）溶液：称取1.0gTritonX-100，用温水溶解定容至100mL。（4）乙酸-乙酸钠缓冲液（pH6.0）：称取60g无水乙酸钠，加适量水溶解，加入2.4mL冰乙酸，定容至1000mL，用pH计校准至pH6.0±0.1。（5）10g/L抗坏血酸溶液：现配现用，用于掩蔽铁、铜等金属离子干扰。5.3.3操作步骤（1）样品前处理：同5.1.4（1）湿法消解。（2）标准曲线绘制：分别量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL1μg/mL铝标准工作液至25mL比色管，加入1mL抗坏血酸溶液摇匀，静置5min；加入2mL铬天青S溶液摇匀，加入2mLTritonX-100溶液摇匀，加入5mL乙酸-乙酸钠缓冲液，用一级水定容至刻度，摇匀后避光静置20min。以0浓度管为空白，在620nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，要求相关系数r≥0.999。（3）样品测定：量取1mL消解后的样品溶液、试剂空白溶液，按上述步骤显色后测定吸光度，代入标准曲线得到对应铝浓度。5.3.4结果计算总铝含量（μg/mL）=（C_样-C_空）×V_定容总/（V_取样×V_测定取样）式中：V_定容总为消解后总定容体积（25mL）；V_测定取样为显色时取的消解液体积（1mL），其余参数同5.1.5。5.3.5注意事项（1）pH值对显色结果影响极大，需严格控制缓冲液pH值在6.0±0.1范围内，所有试剂的pH需预先校准。（2）显色后需在30min内完成测定，超过时间络合物解离，吸光度下降。5.4第四法ICP-OES法5.4.1原理样品经消解后随载气进入电感耦合等离子体炬，高温下原子化并激发，发射铝元素特征谱线（396.15nm），谱线强度与样品中铝浓度呈线性关系，与标准曲线比较定量，适用于批量样品多元素同时检测。5.4.2试剂与材料（1）铝标准工作液：100μg/mL，同5.1.2（1）。（2）内标液：10μg/mL钇标准溶液，采用有证标准物质配制，4℃保存。5.4.3仪器条件射频功率1300W，载气流量0.7L/min，辅助气流量0.2L/min，等离子气流量15L/min，分析线396.15nm，内标线371.03nm。5.4.4操作步骤（1）样品前处理：同5.2.4（1）微波消解。（2）标准曲线绘制：分别配制0、1、5、10、20、50μg/mL铝标准系列，在线加入钇内标液，测定特征谱线强度，以铝浓度为横坐标、铝与钇强度比为纵坐标绘制标准曲线，要求相关系数r≥0.999。（3）样品测定：同法测定样品溶液、试剂空白的强度比，代入标准曲线得到铝浓度。5.4.5结果计算同5.1.5公式。5.4.6注意事项（1）分析前需对谱线进行背景校正，避免共存元素谱线干扰，若396.15nm存在干扰，可选择237.31nm或309.27nm作为分析线。（2）每20个样品插入1份质控样，测定值与标称值偏差≤±5%方可继续测定。6游离铝含量测定6.1原理采用100kDa截留分子量的超滤膜分离样品：结合抗原的铝佐剂颗粒、未结合抗原的铝佐剂大颗粒被截留，可溶性游离铝离子、小分子铝配合物可透过超滤膜，测定透过液中的铝含量即为游离铝含量。6.2操作步骤（1）超滤管预处理：将100kDa超滤管加入5mL10%硝酸，浸泡2h后倒出硝酸，用一级水冲洗3次，沥干备用。（2）样品分离：准确量取1mL混匀的样品至预处理后的超滤管，置于高速冷冻离心机，4℃、12000g离心30min，收集下层透过液。若透过液体积不足0.5mL，可补加0.5mLpH7.2磷酸盐缓冲液后再次离心，合并透过液定容至1mL。同步制备空白对照（用1mL磷酸盐缓冲液代替样品，按上述步骤处理）。（3）含量测定：根据透过液铝浓度范围选择5.1~5.4中的方法测定铝含量，低浓度样品优先采用石墨炉原子吸收法。6.3结果计算游离铝含量（μg/mL）=（C_透-C_透空）×稀释倍数式中：C_透为透过液中铝浓度（μg/mL）；C_透空为空白透过液平均铝浓度（μg/mL）；稀释倍数为透过液定容体积与取样体积的比值。6.4注意事项（1）超滤管需逐支进行空白验证，空白铝含量≤0.01μg/mL方可使用，避免膜材质残留铝干扰。（2）离心温度需控制在2~8℃，避免温度过高导致铝佐剂解离，游离铝测定结果偏高。7方法学验证要求首次使用本指南方法检测特定品种样品前，需完成方法学验证，验证内容及合格标准如下：7.1专属性取不含铝的空白基质（不加铝佐剂的同品种制品）按样品处理步骤测定，测得铝含量≤本方法定量限，判定专属性合格。7.2线性与范围标准曲线相关系数需满足：火焰原子吸收法、铬天青S法、ICP-OES法r≥0.999，石墨炉原子吸收法r≥0.995；线性范围需覆盖样品铝含量限值的50%~150%。7.3精密度（1）重复性：平行测定6份同一份均一样品，计算相对标准偏差（RSD），RSD≤10%为合格。（2）中间精密度：由2名不同操作人员，在不同日期、不同设备上分别测定6份同一份样品，总RSD≤15%为合格。7.4准确度采用加标回收法，分别加入低（限值50%）、中（限值100%）、高（限值150%）三个浓度的铝标准品，每个浓度平行测定3份，回收率要求：低浓度80%~110%，中浓度85%~105%，高浓度90%~110%为合格。7.5定量限以信噪比S/N≥10对应的铝浓度为定量限，要求定量限≤样品铝含量限值的10%。7.6稳定性取消解后的样品溶液，分别在0、4、8、12、24h测定铝含量，RSD≤10%判定为样品溶液24h内稳定。8检测质量控制每批次检测需同步执行以下质量控制措施，不符合要求的检测结果无效，需重新测定：8.1空白控制：试剂空白、超滤空白的铝含量≤标准曲线最低点浓度的10%，判定无交叉污染。8.2曲线控制：每次检测需重新制