生物制品硼盐测定指南（试行）

生物制品硼盐测定指南（试行）1范围本指南规定了生物制品中游离硼、总硼含量的滴定法、电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定的方法原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤、结果计算、方法验证、注意事项，适用于各类生物制品（包括重组蛋白药物、单抗药物、疫苗、血液制品、细胞治疗产品等）中硼残留的定量测定，也可供硼化合物修饰工艺中间过程控制参考使用。生物制品生产工艺中常用硼酸盐缓冲液进行细胞培养、蛋白纯化、缓冲液置换，或使用硼基试剂进行分子修饰、亲和层析配体洗脱，最终成品中可能残留硼盐，本指南所述方法可满足不同硼含量范围生物制品的定量需求，其中滴定法适用于硼含量≥0.1%（w/w）的样品，ICP-OES适用于硼含量0.1μg/g1000μg/g的样品，ICP-MS适用于硼含量0.001μg/g100μg/g的样品。

##2规范性依据

本指南方法制定参考《中华人民共和国药典》（四部通则0704氧瓶燃烧法、通则2302砷盐检查法、通则3106残留溶剂测定法、通则0406电感耦合等离子体发射光谱法、通则0412电感耦合等离子体质谱法）、GB5009.275-2016《食品安全国家标准食品中硼酸的测定》、ICHQ2(R1)《分析方法验证指导原则》相关要求制定。

##3方法原理

3.1滴定法（酸碱滴定-甘露醇转化法）

硼酸为一元弱酸，解离常数Ka≈5.8×10⁻¹⁰，无法直接用强碱滴定，在多羟基化合物（如甘露醇）存在条件下，硼酸可与甘露醇的邻二羟基结合生成稳定的配位酸，其解离常数约为8.4×10⁻⁶，酸性显著增强，可生成1:1的配位化合物，可用氢氧化钠标准滴定溶液直接滴定，根据滴定液消耗量计算样品中硼含量。总硼测定需先通过氧瓶燃烧法氧化破坏样品中的有机物，使结合态硼转化为游离硼酸后测定；游离硼直接提取后测定。3.2电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）样品经酸消解或直接稀释定容后，引入电感耦合等离子体发射光谱仪，硼原子在等离子体中被激发，发射出特征波长的电磁辐射，硼的特征谱线强度与硼浓度在一定范围内呈线性正相关，通过与标准曲线对比，可计算样品中硼含量。总硼需经消解处理破坏有机物，游离硼可直接进样测定。3.3电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）样品经预处理后引入电感耦合等离子体质谱仪，硼在等离子体中电离生成硼离子，经质谱分离后，通过检测质荷比为11的硼离子信号强度，信号强度与硼浓度在一定范围内呈线性正相关，通过标准曲线外标法或内标法计算样品中硼含量。4试剂与材料所有试剂均应采用优级纯，实验用水为电阻率≥18.2MΩ·cm的一级去离子水，避免玻璃容器溶出硼污染，所有容器均采用聚乙烯或聚四氟乙烯材质。4.1滴定法试剂甘露醇：优级纯，105℃干燥2h后置于干燥器中保存；氢氧化钠：优级纯，配制0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液，按照《中国药典》四部通则方法标定，浓度保留四位有效数字；酚酞指示液：称取0.1g酚酞，加100mL95%乙醇溶解，摇匀；过氧化氢溶液：体积分数30%，优级纯；氧气：纯度≥99.99%；硼酸标准品：纯度≥99.99%，105℃干燥至恒重后置于干燥器保存；0.01mol/L氢氧化钠溶液：移取10mL标定好的0.1mol/L氢氧化钠标准溶液，用水定容至1000mL，摇匀；4.2ICP-OES/ICP-MS试剂硝酸：优级纯（痕量金属级）；硼标准储备液：1000mg/L，国家二级标准物质或经标定的硼酸标准溶液（准确称取0.5718g干燥恒重的硼酸，用水溶解定容至100mL，摇匀，即得1000mg/L硼标准储备液）；铍内标储备液（ICP-MS用）：1000mg/L，痕量金属标准物质；过氧化氢：优级纯（痕量金属级）；4.3空白对照每批实验均需做试剂空白，所有试剂与处理步骤与样品一致，不含样品。5仪器设备氧瓶燃烧装置：500mL硬质碘量瓶，配有铂金丝燃烧钩，用于总硼的样品前处理；酸消解装置：微波消解仪，聚四氟乙烯消解罐；或电热板，聚四氟乙烯消解杯；电感耦合等离子体发射光谱仪：波长范围160nm~800nm，检出限≤0.01mg/L；电感耦合等离子体质谱仪：质量范围1~250amu，检出限≤0.01μg/L；分析天平：感量0.0001g和0.00001g，根据样品量选择合适精度；聚四氟乙烯滴定管、移液管、容量瓶：所有容量器具均经计量校准合格；pH计：精度±0.01pH，用于方法验证中滴定终点核对。6样品预处理6.1游离硼测定预处理液体制剂：直接量取一定体积样品（根据预估硼含量调整取样量，滴定法取1050mL，ICP-OES取110mL，ICP-MS取0.1~1mL），置于合适容器中，稀释定容后即可测定；若样品含高浓度盐（≥0.9%氯化钠），标准曲线应采用相同基质匹配；固体制剂：称取一定量样品，加入水超声提取15min，0.45μm水相滤膜过滤，取续滤液定容后测定；提取次数不少于2次，合并提取液；6.2总硼测定预处理6.2.1氧瓶燃烧法（滴定法适用，适于有机物基质样品）称取样品（含硼量约0.0050.05mmol，固体样品10100mg，液体样品10~50μL）置于无灰滤纸中心，折叠包好后固定在铂金丝燃烧钩上。氧瓶中加入10mL水、1mL30%过氧化氢溶液，通入氧气30s充满瓶内，点燃滤纸，迅速塞紧瓶塞，倾斜放置氧瓶使样品完全燃烧，放置30min至烟雾完全消失，打开瓶塞，用少量水冲洗瓶塞和铂金丝，合并洗涤液，转移至滴定瓶中待滴定。

#6.2.2微波消解法（ICP-OES/ICP-MS适用）

称取固体样品0.11g（精确至0.0001g），液体样品15mL，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入5~8mL浓硝酸，放置10min预消解，盖好消解罐放入微波消解仪，按照以下程序消解：室温升至120℃，10min，保持5min；120℃升至180℃，10min，保持15min；消解结束后，待消解罐温度降至室温，打开罐盖，置于电热板上150℃赶酸至剩余溶液约1mL，转移至10mL或50mL容量瓶，用水定容至刻度，摇匀待测。*注意：生物制品含大量蛋白质、核酸等有机物，消解时需严格控制升温程序，防止压力过高爆罐；易挥发样品需密闭消解，避免硼损失。7操作步骤7.1滴定法7.1.1测定向预处理后的样品溶液（pH≤7）中加入0.5g甘露醇，摇匀，加入3滴酚酞指示液，用0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至溶液呈粉红色，30s不褪色即为终点，记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液体积V，同时做空白实验，记录空白消耗体积V0。若样品硼酸含量较低（<0.5mmol/L），可采用0.01mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，提高测定准确度。7.1.2结果计算样品中硼含量（以B计，mg/g或mg/mL）按下式计算：

式中：V——样品消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位mL；V0——空白实验消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位mL；c——氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位mol/mL；M——硼的摩尔质量，10.81g/mol=10810mg/mol；m——取样量，单位为g（固体样品）或mL（液体样品）。若计算硼酸含量，硼酸摩尔质量为61.83g/mol，系数替换即可。7.2ICP-OES法7.2.1仪器条件选择选择硼特征谱线B249.678nm作为分析线，该谱线干扰小，灵敏度高；若基质存在光谱干扰，可选择B208.959nm作为辅助分析线；仪器参考条件：射频功率11001300W，雾化器流量0.81.0L/min，辅助气流量0.5L/min，冷却气流量1215L/min，进样流量1.01.5mL/min，积分时间510s，重复进样测定23次取平均值。7.2.2标准曲线制备准确移取硼标准储备液，用1%（v/v）硝酸逐步稀释，配制成浓度为0mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、50.0mg/L的系列标准工作溶液，基质匹配样品（若样品含相同浓度盐，需在标准溶液中加入对应浓度相同盐类消除基质效应）。

按照仪器条件由低到高浓度依次测定，以硼浓度为横坐标，特征谱线净强度为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程，相关系数r≥0.999为合格。7.2.3样品测定取预处理后的样品溶液，按照仪器条件测定，得到样品信号强度，代入标准曲线计算得到样品溶液中硼浓度，同时测定试剂空白。7.2.4结果计算样品中硼含量（以B计，mg/kg或mg/L）按下式计算：

式中：C——样品溶液中硼的浓度，单位mg/L；C0——试剂空白溶液中硼的浓度，单位mg/L；V——样品定容体积，单位L；m——取样量，单位kg（固体样品）或L（液体样品）。7.3ICP-MS法7.3.1仪器条件选择选择质荷比m/z=11作为硼测定质量数，采用氦气碰撞模式消除多原子离子干扰；仪器参考条件：射频功率1500W，雾化器流量0.85L/min，冷却气流量14L/min，辅助气流量0.8L/min，氦气流量4~5mL/min，进样时间30s，稳定时间30s，重复测定3次取平均值；采用铍（m/z=9）作为内标，内标浓度为10μg/L，在线加入内标，校正信号漂移。7.3.2标准曲线制备准确移取硼标准储备液，用1%（v/v）硝酸逐步稀释，配制成浓度为0μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、50.0μg/L、100.0μg/L、500.0μg/L的系列标准工作溶液，基质匹配与样品一致；

分别测定硼和内标的信号强度，以硼浓度为横坐标，硼信号强度与内标信号强度的比值为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程，相关系数r≥0.999为合格。7.3.3样品测定取预处理后的样品溶液，按照仪器条件测定，得到硼与内标的信号强度比，代入标准曲线得到样品溶液中硼浓度，同时测定试剂空白。7.3.4结果计算同7.2.4，单位为μg/kg或μg/L。8方法验证按照ICHQ2(R1)和《中国药典》要求，测定方法需进行方法验证，验证指标如下：8.1专属性空白溶剂、空白基质（不含硼的相同生物制品基质）测定硼信号，响应值不得超过定量限的30%；在空白基质中加入已知量硼标准品，回收率应在90%~110%之间，表明基质无明显干扰。

滴定法专属性验证：样品溶液加甘露醇后pH变化应符合配位反应规律，加入硼酸标准品后回收率应符合要求。8.2线性与范围滴定法：硼含量在0.005mmol~0.5mmol范围内，滴定消耗量与硼含量线性相关，相关系数r≥0.995；ICP-OES：硼浓度0.1mg/L~50mg/L范围，相关系数r≥0.999；ICP-MS：硼浓度1.0μg/L~500μg/L范围，相关系数r≥0.999；方法范围应覆盖样品中预期硼含量的80%~120%，若超出范围需稀释样品调整浓度后重新测定。

8.3准确度

采用加样回收试验，在空白基质中加入低、中、高三个浓度的硼标准，低浓度接近定量限，中浓度接近样品常规含量，高浓度为常规含量的120%，每个浓度平行测定3次，计算回收率，接受标准为：

1.硼含量≥100μg/g：回收率90%~110%，RSD≤5.0%；1μg/g≤硼含量<100μg/g：回收率85%~115%，RSD≤7.0%；硼含量<1μg/g：回收率80%~120%，RSD≤10.0%；

滴定法的回收率应满足98%~102%，RSD≤2.0%。

8.4精密度

包括重复性、中间精密度：重复性：取相同浓度样品平行测定6份，计算硼含量RSD，接受标准同准确度RSD要求；中间精密度：不同日期、不同实验人员重复测定相同样品，计算6次测定结果的RSD，接受标准比重复性放宽2%。8.5检出限与定量限检出限（LOD）：连续测定11份空白样品，计算硼信号的标准偏差SD，LOD=3×SD/斜率；定量限（LOQ）=10×SD/斜率，接受标准：滴定法：LOD=10μgB，LOQ=30μgB；ICP-OES：LOD≤0.05mg/LB，LOQ≤0.15mg/LB；ICP-MS：LOD≤0.1μg/LB，LOQ≤0.3μg/LB；可满足生物制品残留硼检测的一般要求（一般生物制品硼残留限度≤100μg/g，部分产品要求≤10μg/g，上述方法均满足要求）。9注意事项9.1污染控制硼普遍存在于玻璃器皿中，普通钠钙玻璃中硼含量较高，实验过程中应避免使用玻璃容器，所有容器均采用聚乙烯或聚四氟乙烯材质；新容器需先用20%（v/v）硝酸浸泡24h，再用一级水反复冲洗，晾干后使用；实验用水需检查硼本底，本底超过0.1μg/L需更换超纯水。

9.2基质干扰

1.滴定法：样品中存在游离酸或碱会干扰滴定，因此预处理后需先中和至中性，再加入甘露醇进行滴定；若样品含碳酸根，滴定前可加热煮沸除去二氧化碳，避免终点提前；氟离子存在会与硼形成稳定氟硼酸，干扰测定，氟离子浓度超过10mmol/L时，需加入氯化钙沉淀氟离子后测定；ICP-OES：样品中高浓度有机物或盐会导致雾化效率降低，需通过稀释、基质匹配标准曲线或标准加入法消除基质效应；碳对249.678nm谱线无明显干扰，若存在铁、镍等金属干扰，可选择次灵敏线校正；IC