生物制品铅盐测定指南（试行）

生物制品铅盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗类、抗毒素/抗血清类、血液制品类、重组蛋白/多肽类、细胞治疗产品类、微生态制剂类、体外诊断试剂类（非诊断用原材料）等无固有铅成分添加的生物制品的铅盐限度检查及定量测定。本指南不适用于添加含铅佐剂、铅标记物等固有铅组分的生物制品测定，此类产品可参考本指南调整前处理及基质校正流程后开展测定。本指南为试行技术规范，若后续国家药品标准、药典通则相关内容更新，以最新生效的法定标准为准。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部、四部通则GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法JJG694-2019原子吸收分光光度计检定规程JJG1159-2018电感耦合等离子体质谱仪检定规程GB/T27417-2017合格评定化学分析方法确认和验证指南3术语和定义3.1铅盐：本指南中铅盐指生物制品中以游离态、结合态存在的总铅含量，以铅（Pb）元素计。3.2试剂空白：除不加供试品外，其余试剂及操作流程均与供试品测定完全一致的平行试样。3.3检出限（LOD）：特定测定方法下，可定性检出样品中铅的最低浓度，置信水平为95%。3.4定量限（LOQ）：特定测定方法下，可准确定量样品中铅的最低浓度，测定结果相对标准偏差≤10%，回收率在80%-120%范围内。3.5基质匹配标准曲线：采用与待测试样基质组成一致、不含目标铅组分的空白基质配制标准溶液系列，绘制的校准曲线，用于抵消基质效应带来的测定偏差。4通用要求4.1环境要求测定应在洁净度不低于ISO14644-1Class7的实验室开展，实验区域避免灰尘、金属碎屑污染，实验台采用聚丙烯、聚四氟乙烯等非金属耐腐蚀材质。实验人员应佩戴无粉乳胶手套、聚乙烯头套，穿着无金属纤维的实验服，避免外源性铅污染。实验区域不得开展含铅试剂配制、重金属消解等高污染实验，若共用实验室需设置独立的铅测定实验分区，分区内所有设备、耗材专用。4.2试剂与耗材要求4.2.1实验用水：应符合GB/T6682-2008规定的一级水要求，电阻率≥18.2MΩ·cm（25℃），总铅含量≤0.01μg/L。4.2.2化学试剂：硝酸、高氯酸、过氧化氢、磷酸二氢铵、硝酸钯、醋酸铵、硫代乙酰胺等试剂均应为优级纯及以上纯度，优先选用MOS级、电子级试剂，试剂空白铅含量应低于方法检出限。标准铅储备液应选用国家认可的标准物质，浓度为1000mg/L，有效期按证书规定执行，标准铅使用液临用前用1%硝酸逐级稀释至所需浓度。4.2.3耗材要求：所有接触样品、试剂的容器（包括容量瓶、离心管、消解罐、纳氏比色管、移液枪头等）均应为聚丙烯或聚四氟乙烯材质，使用前应置于10%（v/v）硝酸溶液中浸泡≥24h，取出后用一级水冲洗至少6次，置于洁净防尘柜中晾干备用，禁止使用含铅玻璃材质的容器。4.3仪器设备要求4.3.1前处理设备：微波消解仪应配备聚四氟乙烯消解罐，控温精度±5℃；电热赶酸板控温范围室温-250℃，控温精度±2℃；马弗炉控温范围室温-1000℃，控温精度±10℃。所有前处理设备使用前应采用1%硝酸擦拭内壁，避免残留污染。4.3.2测定设备：紫外-可见分光光度计、石墨炉原子吸收分光光度计（GFAAS）、电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）均应按对应检定规程完成周期检定，性能符合要求后方可使用。5测定方法5.1第一法硫代乙酰胺比色法（限度检查法）本方法适用于铅盐限度快速筛查，检出限为0.1μg/g（或0.1μg/mL），定量限为0.3μg/g（或0.3μg/mL）。5.1.1原理在pH3.5的醋酸盐缓冲体系中，硫代乙酰胺水解产生硫化氢，与供试品中的铅离子反应生成黄色至棕黑色的硫化铅混悬液，与相同条件下制备的标准铅对照溶液色斑比较，判定供试品铅盐是否符合限度要求。5.1.2试剂配制5.1.2.1醋酸盐缓冲液（pH3.5）：取醋酸铵25g，加水25mL溶解后，加7mol/L盐酸溶液38mL，用2mol/L盐酸溶液或5mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5，用水稀释至100mL。5.1.2.2硫代乙酰胺试液：取硫代乙酰胺4g，加水使溶解成100mL，置冰箱中保存。临用前取混合液（由1mol/L氢氧化钠溶液15mL、水5.0mL及甘油20mL组成）5.0mL，加上述硫代乙酰胺溶液1.0mL，置水浴上加热20s，冷却后立即使用。5.1.2.3标准铅使用液：精密量取标准铅储备液1mL，置100mL量瓶中，加1%硝酸稀释至刻度，摇匀，即为每1mL含10μgPb的标准铅中间液；临用前精密量取中间液1mL，置10mL量瓶中，加1%硝酸稀释至刻度，摇匀，即为每1mL含1μgPb的标准铅使用液。5.1.3供试品前处理5.1.3.1液体供试品：精密量取供试品2mL（或精密称取2g），置于50mL瓷坩埚中，水浴蒸干，小火加热至炭化完全，放冷，加硝酸2mL，蒸干，待氧化氮蒸气除尽后，放冷，加盐酸2mL，水浴蒸干，加水10mL溶解，滴加氨试液至酚酞指示液显中性，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2mL，微热溶解后，移至25mL纳氏比色管中，加水稀释至25mL，即为供试品管。5.1.3.2固体/半固体供试品：精密称取供试品2g，置于50mL瓷坩埚中，按上述液体供试品炭化、消解流程处理后制备供试品管。5.1.3.3试剂空白管：除不加供试品外，其余操作与供试品前处理完全一致，制备试剂空白管。5.1.3.4对照管：精密量取标准铅使用液适量（按品种规定的铅限度折算，例如限度为0.1μg/g时，取2mL标准铅使用液），置于25mL纳氏比色管中，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2mL，加水稀释至25mL，即为对照管。5.1.4测定步骤在供试品管、空白管、对照管中分别加入硫代乙酰胺试液各2mL，摇匀，放置2min，同置白纸上，自上向下透视，比较各管颜色深浅。5.1.5结果判定若供试品管颜色浅于或等于对照管，且空白管无明显显色，判定供试品铅盐符合限度要求；若供试品管颜色深于对照管，判定不符合限度要求，需采用第二法或第三法进一步准确定量。若供试品管本身带颜色，需在对照管中滴加稀焦糖溶液或其他无干扰的有色溶液，调整颜色与供试品管一致后再加入硫代乙酰胺试液比较，或采用双波长法扣除背景吸光度干扰。5.2第二法石墨炉原子吸收分光光度法（定量测定法）本方法适用于铅盐准确定量，检出限为0.01μg/g（或0.01μg/mL），定量限为0.03μg/g（或0.03μg/mL），为生物制品铅盐测定的首选定量方法。5.2.1原理供试品经消解后导入石墨炉原子化器，经干燥、灰化、原子化过程，铅原子化后吸收283.3nm的特征谱线，在一定浓度范围内，吸光度与铅含量成正比，与标准系列比较定量。5.2.2试剂配制5.2.2.1基体改进剂：称取0.5g磷酸二氢铵、0.1g硝酸钯，加1%硝酸溶解并定容至100mL，摇匀，即为含0.5%磷酸二氢铵、0.1%硝酸钯的混合基体改进剂，4℃保存有效期3个月。5.2.2.2标准系列溶液：若采用基质匹配标准曲线，取与供试品基质一致的空白基质6份，按供试品前处理流程消解后，分别加入标准铅使用液，配制成铅浓度为0μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的标准系列溶液；若采用外标法，直接用1%硝酸配制上述浓度的标准系列溶液。5.2.3供试品前处理优先采用微波消解法，操作如下：精密称取供试品0.5g（或量取0.5mL）置于微波消解罐中，加硝酸5mL、30%过氧化氢2mL，密封后置于微波消解仪中，按以下程序消解：第一步120℃，升温5min，保持5min；第二步160℃，升温5min，保持10min；第三步190℃，升温5min，保持20min。消解完成后自然冷却至室温，取出消解罐，置于140℃电热赶酸板上赶酸至剩余体积约0.5mL，冷却后用1%硝酸转移至10mL容量瓶中定容，摇匀备用，同时制备试剂空白。若不具备微波消解条件，可采用湿法消解：精密称取供试品0.5g置于凯氏烧瓶中，加硝酸-高氯酸混合液（4:1，v/v）10mL，小火加热消解，若溶液变棕黑，补加硝酸至消解完全，继续加热至冒高氯酸白烟，溶液呈无色透明或微黄色，冷却后加10mL水赶酸，重复2次，冷却后用1%硝酸转移至10mL容量瓶定容。5.2.4测定步骤5.2.4.1仪器参数设置：铅空心阴极灯电流8mA，波长283.3nm，狭缝宽度0.5nm，氘灯背景校正，石墨炉升温程序：干燥阶段80-120℃，20s；灰化阶段400℃，10s；原子化阶段1800℃，5s（停气）；除残阶段2300℃，3s。进样量20μL，基体改进剂进样量5μL。5.2.4.2标准曲线绘制：将标准系列溶液依次导入石墨炉，测定吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，相关系数应≥0.995。5.2.4.3供试品测定：将试剂空白、供试品溶液依次导入石墨炉，测定吸光度，代入标准曲线计算铅浓度。5.2.5结果计算供试品铅含量（μg/g或μg/mL）=（Cx-C0）×V/m式中：Cx为供试品溶液中铅浓度，μg/L；C0为试剂空白中铅浓度，μg/L；V为供试品溶液定容体积，mL；m为供试品取样量，g或mL。5.2.6注意事项若供试品含铝佐剂、高浓度盐类基质，基质效应>10%时，必须采用基质匹配标准曲线或标准加入法进行定量，避免结果偏差。5.3第三法电感耦合等离子体质谱法（痕量测定法）本方法适用于细胞治疗产品、mRNA疫苗等痕量铅测定，检出限为0.001μg/g（或0.001μg/mL），定量限为0.003μg/g（或0.003μg/mL），可同时测定多种重金属元素。5.3.1原理供试品经消解后由载气带入等离子体炬，经高温电离为离子，离子经接口进入质谱仪，根据铅离子的质荷比进行分离检测，208Pb的信号强度与铅浓度成正比，与标准系列比较定量，采用209Bi作为内标校正基体效应及信号漂移。5.3.2试剂配制5.3.2.1内标溶液：精密量取铋标准储备液适量，用1%硝酸稀释至浓度为10μg/L，在线加入内标。5.3.2.2标准系列溶液：采用基质匹配法配制，铅浓度分别为0μg/L、0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L，每1mL标准溶液含10ng铋内标。5.3.3供试品前处理同第二法微波消解流程，定容后溶液中总可溶性固体含量应≤0.2%，避免堵塞质谱接口。5.3.4测定步骤5.3.4.1仪器调谐：采用调谐液优化仪器参数，使氧化物产率（CeO+/Ce+）≤2%，双电荷离子产率（Ce2+/Ce+）≤3%，灵敏度、稳定性符合要求。5.3.4.2标准曲线绘制：依次测定标准系列溶液，以208Pb/209Bi信号比为纵坐标，铅浓度为横坐标，绘制标准曲线，相关系数≥0.999。5.3.4.3供试品测定：依次测定试剂空白、供试品溶液，记录208Pb/209Bi信号比，代入标准曲线计算铅浓度。5.3.5结果计算同第二法结果计算公式。6方法学验证要求首次采用本指南方法开展某类生物制品铅盐测定前，需按GB/T27417-2017要求完成方法学验证，验证指标及接受标准如下：6.1专属性：试剂空白无明显响应，供试品中其他成分、共存元素不干扰铅的测定，空白响应值≤定量限响应值的10%。6.2准确度：采用加标回收法测定，低、中、高三个浓度水平（分别为限度浓度的50%、100%、150%）的加标回收率：第一法应为80%-120%，第二法应为85%-115%，第三法应为90%-110%。6.3精密度：重复性：同一分析人员平行测定6份供试品，结果相对标准偏差（RSD）：第一法≤10%，第二法≤8%，第三法≤5%；中间精密度：不同分析人员、不同日期、不同设备测定结果RSD：第一法≤15%，第二法≤10%，第三法≤7%。6.4线性：标准曲线相关系数：第一法≥0.99，第二法≥0.995，第三法≥0.999。6.5检出限与定量限：检出限应≤限度值的1/10，定量限应≤限度值的1/5。6.6耐用性：改变前处理温度、消解时间、仪器参数等条件，测定结果偏差≤10%。7质量控制要求每批次样品测定应同步开展以下质量控制措施，确保结果准确：7.1试剂空白：每批次测定至少制备2份试剂空白，空白铅含量应低于方法检出限，若空白超出限值，需排查污染来源，重新测定。7.2质控样品：每批次测定应同步测定1份与供试品基质一致的有证标准物质，测定值应在标准物质证书给出的不确定度范围内；或同步测定基质加标质控样，回收率应符合6.2的要求。7.3平行样：每10份供试品应增加1份平行样测定，平行样结果相对偏差≤10%。7.4曲线校准：每20份样品测定后应测定1份标准曲线中间浓度点，测定值与理论值偏差≤10%，否则需重新绘制标准曲线。8结果判定不同类型生物制品铅盐限度应符合《中华人民共和国药典》对应品种项下要求，无明确品种标准的按以下通用限度执行：8.1静脉给药类生物制品：铅含量≤0.05μg/g（或0.05μg/mL）；8.2肌肉/皮下给药类生物制品：铅含量≤0.1μg/g（或0.1μg/mL）；8.3口服给药类生物制品：铅含量≤0.2μg/g（或0.2μg/mL）；8.4外用类生物制品：铅含量≤0.5μg