生物制品碳酸氢盐测定指南（试行）

生物制品碳酸氢盐测定指南（试行）本指南为生物制品碳酸氢盐测定试行技术规范，适用于预防类、治疗类、诊断类生物制品的中间品、原液、成品及生产配套缓冲液的碳酸氢盐含量测定，各生物制品有专属检定规程的，优先执行专属规程要求。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法《中华人民共和国药典》2025年版三部生物制品检定用试剂、标准品管理规程JJG196常用玻璃量器检定规程JJG823离子色谱仪检定规程JJG119实验室pH（酸度）计检定规程YY/T0681.15无菌医疗器械包装试验方法第15部分：透气包装材料湿性和干性微生物屏障试验术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1碳酸氢盐：指水溶液中以HCO₃⁻形式存在的离子，生物制品基质中与碳酸（H₂CO₃）、溶解态CO₂、碳酸根（CO₃²⁻）存在动态平衡：CO₂（溶解态）+H₂O⇌H₂CO₃⇌H⁺+HCO₃⁻⇌2H⁺+CO₃²⁻，平衡状态受体系pH、温度、环境CO₂分压影响。3.2总二氧化碳：指水溶液中所有形态的二氧化碳总和，包括溶解态CO₂、H₂CO₃、HCO₃⁻、CO₃²⁻，本指南中碳酸氢盐含量可通过测定总二氧化碳后经pH校正换算获得，当样品pH处于6.0~8.5区间时，HCO₃⁻占总二氧化碳的95%以上，可直接用总二氧化碳测定值代表碳酸氢盐含量。3.3基质干扰：指生物制品中除目标物外的其他组分（如蛋白、核酸、缓冲盐、表面活性剂、糖类等）对测定信号的增强或抑制作用，导致测定结果偏差的现象。测定原理本指南推荐三种测定方法，分别为酶比色法、离子色谱法、电位滴定法，各方法原理及适用范围如下：4.1酶比色法：在pH8.0的Tris-HCl缓冲体系中，磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）与HCO₃⁻在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化下生成草酰乙酸和正磷酸，草酰乙酸在苹果酸脱氢酶（MDH）催化下与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）反应生成L-苹果酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）；NADH在340nm波长处有特征吸收峰，反应体系的吸光度下降值与HCO₃⁻浓度呈线性相关，通过与标准品比较定量。该方法适用于HCO₃⁻含量范围0.1mmol/L~10mmol/L、基质组成相对简单的样品，如重组蛋白制剂、灭活疫苗上清、细胞培养上清等，批量测定效率高。4.2离子色谱法：样品经前处理去除大分子杂质后，进入阴离子交换色谱柱，不同阴离子基于与色谱柱固定相的亲和力差异实现分离，经抑制型电导检测器检测，HCO₃⁻的峰面积与浓度呈线性相关，通过与标准品比较定量。该方法适用于HCO₃⁻含量范围0.05mmol/L~50mmol/L、基质组成复杂的样品，如血液制品、细胞治疗产品裂解液、含多元缓冲体系的生物制品原液等，专属性强，可同时分离多种常见阴离子干扰物。4.3电位滴定法：用已知浓度的盐酸标准溶液滴定样品，H⁺与HCO₃⁻反应生成CO₂和H₂O，通过pH复合电极监测滴定过程的pH变化，以pH4.5为滴定终点（此时HCO₃⁻完全转化为CO₂），根据滴定消耗的盐酸体积计算HCO₃⁻含量；也可采用CO₂选择电极直接监测释放的CO₂浓度确定终点。该方法适用于HCO₃⁻含量范围10mmol/L~200mmol/L的高浓度样品，如生产用缓冲浓缩液、原料配制液等，准确度高，操作简便。试剂与材料5.1通用试剂与材料5.1.1实验用水：符合GB/T6682规定的一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm（25℃），无CO₂，制备方法为：将一级水煮沸15min后，置于密封容器中通入高纯氮气（纯度≥99.999%）冷却至室温，或采用专门的CO₂去除装置处理，4℃密封保存不超过24h。5.1.2标准品：采用国家药品监督管理局授权机构发放的碳酸氢钠标准品，或USP、EP级基准碳酸氢钠，纯度≥99.5%，使用前置于硅胶干燥器中干燥24h。5.1.3材料：无酶无热源聚丙烯离心管（1.5mL、15mL、50mL），0.22μm聚醚砜（PES）水性滤膜（需提前验证无HCO₃⁻溶出，溶出值低于方法检出限方可使用），一次性无菌移液吸头，密封样品瓶（顶空体积≤5%）。5.2酶比色法专属试剂5.2.10.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0）：称取12.11gTris碱，加入900mL无CO₂水溶解，用1mol/L盐酸调节pH至8.0±0.05，定容至1L，4℃密封保存不超过1个月。5.2.2磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）：纯度≥99%，-20℃密封保存。5.2.3磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）：比活≥10U/mg，-20℃分装保存，避免反复冻融。5.2.4苹果酸脱氢酶（MDH）：比活≥500U/mg，-20℃分装保存，避免反复冻融。5.2.5NADH二钠盐：纯度≥98%，-20℃避光密封保存。5.2.6反应工作液：临用前配制，在0.1mol/LTris-HCl缓冲液中加入PEP至终浓度2mmol/L，NADH至终浓度0.3mmol/L，MDH至终浓度2U/mL，PEPC至终浓度0.5U/mL，避光冰浴保存，4h内使用。5.3离子色谱法专属试剂5.3.1淋洗液：若采用氢氧根体系，使用淋洗液自动发生器在线生成1~40mmol/LKOH淋洗液；若采用碳酸盐体系，配制3.2mmol/LNa₂CO₃+1.0mmol/LNaHCO₃混合溶液，经0.22μm滤膜过滤后超声脱气30min，密封保存不超过7d。5.3.2抑制器再生液：50mmol/LH₂SO₄溶液，称取2.72mL优级纯浓硫酸，缓慢加入1000mL无CO₂水中，混匀后密封保存。5.3.3蛋白沉淀剂：3%三氯乙酸（TCA）溶液，称取3g优级纯TCA，加入100mL无CO₂水溶解，4℃保存不超过1个月。5.3.4固相萃取小柱：反相C18小柱，规格1mL/100mg，用于去除样品中的脂溶性、大分子有机物干扰。5.4电位滴定法专属试剂5.4.1盐酸标准滴定溶液：0.01mol/L或0.1mol/L，根据样品浓度选择，采用基准无水碳酸钠（270℃干燥4h）标定，平行标定3次，浓度RSD≤0.2%，密封保存不超过1个月。5.4.2pH标准缓冲液：pH4.00（25℃）、pH6.86（25℃）、pH9.18（25℃），用于校准pH电极，有效期按照说明书要求。仪器设备6.1通用仪器6.1.1分析天平：分度值0.01mg，I级精度，每年经法定计量机构校准合格。6.1.2pH计：精度±0.01pH，每次使用前用pH标准缓冲液校准，校准误差≤±0.02pH。6.1.3高速冷冻离心机：最大转速≥12000rpm，控温范围4℃~25℃，转速精度±50rpm。6.1.4恒温水浴箱：控温范围20℃~60℃，控温精度±0.1℃。6.1.5超净工作台/生物安全柜：根据样品生物安全等级选择，符合二级及以上生物防护要求。6.2酶比色法专属仪器：多功能酶标仪，配置340nm紫外滤光片，吸光度精度±0.001Abs，定期进行吸光度准确度校准。6.3离子色谱法专属仪器：离子色谱仪，配置阴离子交换柱（推荐DionexIonPacAS11-HC或同等性能柱）、抑制型电导检测器、柱温箱（控温精度±0.1℃）、自动进样器，每年经法定计量机构校准合格，柱效≥15000理论塔板数（以Cl⁻计）。6.4电位滴定法专属仪器：全自动电位滴定仪，配置pH复合玻璃电极或CO₂选择电极，滴定管精度±0.001mL，滴定管体积误差符合A级玻璃量器要求。样品采集与保存7.1采样要求：采样使用预充高纯氮气的密封聚丙烯管，采样后立即拧紧管盖，不留顶空（顶空体积占比≤5%），避免样品与空气接触；采样量不少于1mL，满足平行测定及方法学验证需求。7.2保存要求：样品采集后应立即测定，若无法立即测定，4℃密封保存不超过2h；-20℃密封保存不超过7d，禁止反复冻融，冻融次数不超过1次；冻存样品测定前于4℃避光解冻，解冻后立即处理。7.3预处理要求：若样品含不溶性颗粒，于4℃、12000rpm离心10min，取上清液待测；若需过滤处理，弃去前3mL滤液，收集后续滤液，避免滤膜溶出物干扰。测定步骤8.1酶比色法8.1.1标准曲线制备：准确称取干燥后的碳酸氢钠标准品0.8401g，用无CO₂水溶解定容至100mL，得到100mmol/L标准贮备液；临用前用无CO₂水逐级稀释为0、0.1、0.5、1、2、5、10mmol/L的标准工作系列，每个浓度设置3个复孔。8.1.2加样与反应：取紫外透明平底96孔板，每孔加入20μL标准工作液或待测样品，随后加入200μL反应工作液，低速振荡30s混匀，置于37℃避光孵育10min。8.1.3测定：将96孔板置于酶标仪中，于340nm波长处测定各孔吸光度值，记录数据。8.1.4空白试验：用等体积无CO₂水代替样品，其余操作与样品测定一致，计算时扣除空白吸光度。8.1.5结果计算：以标准工作液HCO₃⁻浓度为横坐标，空白扣除后的吸光度下降值（ΔA=A空白-A标准）为纵坐标，绘制标准曲线，线性相关系数r≥0.999为合格；将样品的ΔA代入标准曲线回归方程，得到样品中HCO₃⁻浓度，若样品经稀释处理，乘以稀释倍数即为最终浓度。8.2离子色谱法8.2.1色谱条件设置：柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量25μL，抑制器电流根据淋洗液浓度设置（10mmol/LKOH对应电流25mA）；若采用KOH梯度洗脱，程序为：0~5min，1mmol/LKOH；5~12min，1~10mmol/LKOH；12~15min，40mmol/LKOH冲洗色谱柱；15.1~20min，1mmol/LKOH平衡系统，HCO₃⁻保留时间应控制在7~9min，与相邻阴离子峰的分离度≥1.5。8.2.2标准曲线制备：将100mmol/L碳酸氢钠标准贮备液用无CO₂水逐级稀释为0、0.05、0.5、1、5、20、50mmol/L的标准工作系列，每个浓度进样2次，取平均峰面积。8.2.3样品前处理：若样品蛋白浓度≥1g/L，取100μL样品加入等体积3%TCA溶液，涡旋混匀后4℃放置10min，12000rpm离心15min，取上清液用无CO₂水稀释10倍，经0.22μm滤膜过滤后进样；若样品含高浓度脂溶性杂质，活化C18固相萃取小柱（10mL甲醇、10mL无CO₂水依次过柱）后，取稀释后的样品过柱，弃去前3mL滤液，收集后续滤液进样。8.2.4测定：依次进样空白溶液（无CO₂水）、标准工作系列、待测样品，记录各峰的保留时间和峰面积。8.2.5结果计算：以标准工作液HCO₃⁻浓度为横坐标，扣除空白后的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性相关系数r≥0.999为合格；将样品的HCO₃⁻峰面积代入回归方程，乘以稀释倍数即为最终浓度。8.3电位滴定法8.3.1电极校准：使用pH4.00、pH6.86、pH9.18标准缓冲液校准pH电极，校准后电极响应误差≤±0.02pH。8.3.2样品滴定：准确移取待测样品10mL（若浓度过高，预先稀释至HCO₃⁻浓度10~50mmol/L），加入100mL无CO₂水置于滴定杯中，持续通入高纯氮气排除液面上方空气，开启搅拌，用盐酸标准滴定溶液滴定至pH4.5，煮沸2min除去溶解的CO₂，冷却至室温后继续滴定至pH4.5，记录消耗的盐酸体积，平行测定2次。8.3.3空白试验：用等体积无CO₂水代替样品，其余操作与样品测定一致，记录空白消耗的盐酸体积。8.3.4结果计算：HCO₃⁻浓度（mmol/L）=C×(V₁-V₀)×1000/V，其中C为盐酸标准滴定溶液的浓度（mol/L），V₁为样品滴定消耗的盐酸体积（mL），V₀为空白消耗的盐酸体积（mL），V为取样体积（mL）；若样品经稀释处理，乘以稀释倍数即为最终浓度。方法学验证要求9.1准确度：采用加标回收法验证，选择测定范围内低（20%限度值）、中（50%限度值）、高（80%限度值）三个浓度水平，每个浓度制备3个平行样品，酶比色法回收率应在90%~110%，离子色谱法回收率应在85%~115%，电位滴定法回收率应在95%~105%。9.2精密度：9.2.1重复性：同一操作人员、同一台仪器、同一天内测定6份平行样品，测定结果的相对标准偏差（RSD）≤5%。9.2.2中间精密度：由2名不同操作人员、在不同日期使用同一台仪器测定同一份样品，测定结果的RSD≤8%。9.3线性与范围：标准曲线的线性相关系数r≥0.999，线性范围内的浓度测定偏差≤2%；各方法的测定范围应覆盖样品中HCO₃⁻的限度范围±20%。9.4检出限与定量限：以3倍信噪比对应的浓度为检出限，10倍信噪比对应的浓度为定量限；酶比色法检出限≤0.05mmol/L，定量限≤0.1mmol/L；离子色谱法检出限≤0.02mmol/L，定量限≤0.05mmol/L；电位滴定法检出限≤1mmol/L，定量限≤5mmol/L。9.5专属性：考察生物制品中常见共存组分（氯化钠、磷酸钠、乙酸钠、组氨酸、蔗糖、吐温80、白蛋白、甘露醇等）的干扰，共存组分浓度为样品中最高可能浓度的1.2倍时，对测定结果的干扰率≤2%；若存在不可接受的干扰，应优化前处理方法或更换测定方法。9.6样品稳定性：考察样品在室温放置0、1、2、4h的测定值，RSD≤5%；-20℃冻存7d及冻融1次后的测定值与新鲜样品的偏差≤5%。质量控制要求10.1空白控制：每批试验应同步测定空白对照，空白值应低于方法检出限，否则说明试剂、水或容器存在污染，应更换材料重新试验。10.2质控样控制：每批试验应同步测定溯源性二级质控样，质控样测定值与标称值的偏差≤10%，否则试验无效，应重新测定。10.3平行样控制：每个样品应测定2个平行，平行样测定结果的RSD≤5%，否则重新测定。结果报告与判定11.1结果表示：测定结果单位采用mmol/L或mg/L，换算系数为1mmol/LHCO₃⁻=61.02mg/L；低含量样品保留2位有效数字，高含量样品保留3位有效数字，或与质量标准的精度要求一致。11.2判定规则：测定结果在该生物制品质量标准规定的HCO₃⁻含量限度范围内的，判定为符合要求；超出限度范围的，判定为不符合要求；若测定结果处于限度边缘，应复测2次，以3次测定的平均值作为最终结果。11.3应包含样品名称、批号、采样日期、测定日期、测定方法、仪器型号、标准品来源、标准曲线相关系数、质控样测定结果、平行样测定值、平均值、判定结果