生物制品细菌内毒素检查指南（试行）

生物制品细菌内毒素检查指南（试行）1适用范围本指南适用于中华人民共和国境内上市的各类生物制品的细菌内毒素质量控制检查，涵盖疫苗类、血液制品类、重组治疗性生物制品类、细胞与基因治疗产品类、体外诊断用生物活性原料类等，覆盖原液、半成品、成品全生产周期的内毒素质量管控。本指南不适用于经方法学验证确证无法消除基质干扰、且热原检查法适用性更强的特殊生物制品，以及临床给药途径为局部外用、无内毒素风险管控要求的制品。2规范性引用文件本指南内容引用现行有效版本的如下文件要求：《中华人民共和国药典》2025年版三部通则1143细菌内毒素检查法、《药品生产质量管理规范（2010年修订）》及附录、USP<85>细菌内毒素检查法、EP2.6.14细菌内毒素检查法，上述文件修订时，应参照最新版本要求执行。3术语与定义3.1细菌内毒素：革兰氏阴性菌细胞壁外膜的脂多糖成分，是触发人体发热、休克等毒理反应的主要热原物质，活性单位以欧盟（EU）表示，1EU等于1个国际单位（IU）的内毒素活性。3.2鲎试剂：由鲎科动物的血液变形细胞裂解物制备的生物试剂，可与内毒素产生特异性凝集反应，分为普通鲎试剂、抗G因子旁路鲎试剂两类，后者可避免β-葡聚糖等物质引发的假阳性反应。3.3内毒素限值（L）：供试品中允许含有的内毒素最高浓度，单位一般为EU/ml、EU/mg、EU/剂量。3.4最大有效稀释倍数（MVD）：供试品可被稀释的最大倍数，稀释后仍能满足内毒素限值的检测要求，超出该倍数的稀释结果不具有判定效力。3.5干扰试验：验证供试品基质是否会抑制或增强鲎试剂与内毒素的反应，确保检测结果准确性的验证试验。4人员要求4.1所有从事细菌内毒素检查的人员应经过专项技术培训，考核合格后方可上岗，培训内容应包含内毒素检测原理、鲎试剂特性、操作规范、干扰因素排查、偏差处理、生物安全防护等模块。4.2操作过程中应严格执行无内毒素污染防护要求：穿戴无粉乳胶手套、洁净工作服，避免用手直接接触无内毒素耗材的内壁及管口，操作时佩戴口罩，避免说话产生的气溶胶污染样本及试剂。4.3检查人员应熟练掌握内毒素限值计算、稀释倍数换算、结果判定规则，能够独立完成干扰试验设计及偏差原因排查，所有操作应如实记录，不得篡改原始数据。5环境与设施设备要求5.1操作环境应满足无外源性内毒素污染要求，空气洁净度等级不低于《药品生产质量管理规范》规定的D级，静态沉降菌数≤100CFU/4h，工作台面应采用耐腐蚀、无孔隙的聚四氟乙烯或不锈钢材质，每次操作前用无内毒素的75%乙醇或专用去热源擦拭剂擦拭消毒。5.2核心设备要求：5.2.1干热灭菌器：用于耗材的去内毒素处理，温度控制精度±5℃，可实现250℃≥30min的运行程序，每6个月开展一次温度分布验证，确保腔室内所有点位均达到去热源温度要求，每次运行应放置化学指示剂或生物指示剂（内毒素指示剂，效价≥1000EU/支）验证去热源效果。5.2.2恒温孵育装置：可采用恒温水浴箱或干式恒温器，温度控制精度±1℃，温度设置范围覆盖36℃~38℃，每3个月校准一次温度偏差，孵育过程中应避免振动，防止凝胶碎裂出现假阴性。5.2.3移液器：量程覆盖10μl~10ml，精度误差≤±2%，每6个月校准一次体积偏差，配套使用的吸头应为无内毒素级，禁止自行灭菌重复使用。5.2.4光度检测设备：采用浊度法或显色基质法检测时，所用酶标仪或分光光度计应具备相应的波长检测能力（浊度法340nm~360nm，显色基质法405nm~410nm），吸光度精度≤0.001Abs，每12个月校准一次波长及吸光度偏差。5.2.5旋涡混合器：转速≥2000rpm，用于内毒素标准品及供试品的混匀，避免内毒素吸附于管壁导致结果偏低。5.3耗材要求：所有接触样本、试剂的试管、吸头、稀释管均应为无内毒素级，或经250℃30min干热除热源处理，每批次耗材应抽样检测内毒素含量，检测结果应低于所用检测方法的最低检测限，方可投入使用。无内毒素检查用水的内毒素含量应≤0.015EU/ml，符合《中华人民共和国药典》要求。6检测方法选择细菌内毒素检查法分为凝胶法、光度法两类，应根据供试品特性、检测目的选择合适的方法：6.1凝胶法：分为凝胶限度试验、凝胶半定量试验，操作简便、成本低廉，适用于常规批次的限度检查，是内毒素检查的仲裁方法，当不同方法检测结果存在争议时，以凝胶限度试验结果为准。6.2光度法：分为动态浊度法、终点浊度法、动态显色基质法、终点显色基质法，检测灵敏度高（最低可达0.001EU/ml）、可实现定量检测，适用于内毒素含量极低的鞘内给药制品、原液放行检测、干扰机制研究等场景，使用前应完成完整的方法学验证，证明方法的特异性、准确性、精密性符合要求。7内毒素限值确定7.1限值计算通用公式：L=K/M，其中：K为人体对内毒素的耐受阈值，静脉给药途径K=5EU/(kg·h)，鞘内给药途径K=0.2EU/(kg·h)，放射性药品静脉给药K=2.5EU/(kg·h)，体重按60kg成年人计算；M为每公斤体重每小时的最大供试品给药剂量，单位为ml/(kg·h)、mg/(kg·h)、剂量/(kg·h)。7.2不同生产阶段的限值换算：成品限值应按每单位剂量计算，如疫苗类成品每剂次内毒素含量不得超过20EU，血液制品成品每ml不得超过1EU，重组单抗类成品每mg蛋白不得超过0.5EU，具体限值应符合各品种项下的药典要求；半成品、原液限值应根据生产工艺的稀释/浓缩倍数换算，且应严于成品限值，预留生产过程的污染缓冲空间，如原液限值应为成品限值的2倍以上，避免生产过程中内毒素累积导致成品不合格。7.3特殊制品限值确定：细胞与基因治疗产品的限值应结合临床给药剂量、给药途径确定，鞘内给药的CAR-T细胞产品每剂次内毒素含量不得超过0.2EU，静脉给药的每剂次不得超过5EU。内毒素限值确定的所有支持性资料（包括临床给药剂量说明、换算过程、验证数据）应存档备查。8最大有效稀释倍数（MVD）与最小有效浓度（MVC）计算8.1MVD计算公式：MVD=C×L/λ，其中：C为供试品的浓度，当L单位为EU/ml时C=1ml/ml，当L单位为EU/mg时C为供试品的蛋白浓度（mg/ml），当L单位为EU/剂量时C为每ml供试品包含的剂量数；L为供试品的内毒素限值；λ为所用检测方法的灵敏度，凝胶法为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），光度法为标准曲线的最低检测限（EU/ml）。示例：某重组单抗成品的蛋白浓度为100mg/ml，内毒素限值L=0.5EU/mg，采用标示灵敏度λ=0.125EU/ml的凝胶法检测，MVD=100mg/ml×0.5EU/mg÷0.125EU/ml=400倍，即供试品最大可稀释400倍，稀释后仍可满足限值检测要求。8.2MVC计算公式：MVC=λ/L，即供试品检测时的最低浓度，低于该浓度的检测结果不具有判定效力，上述示例中MVC=0.125EU/ml÷0.5EU/mg=0.25mg/ml，即供试品检测时的蛋白浓度不得低于0.25mg/ml。9供试品制备与干扰初筛9.1取样要求：供试品取样应符合GMP取样规则，具有批次代表性，成品每批取样量不少于10个最小独立包装，原液每批取样量不少于3个独立分装单元，半成品每批取样量不少于1份混合均匀的中间产品，取样过程应避免外源性内毒素污染。9.2供试品预处理：9.2.1pH调整：鲎试剂与内毒素反应的最适pH范围为6.0~8.0，若供试品pH超出该范围，应采用无内毒素的0.1mol/LHCl或0.1mol/LNaOH调整pH至该区间，调整过程应记录酸碱加入量，避免稀释倍数超出MVD。9.2.2特殊基质处理：含铝佐剂的疫苗制品可加入无内毒素的0.1mol/L柠檬酸溶液解吸附内毒素，加入量应验证不干扰检测反应，且内毒素回收率在50%~200%之间；含高浓度蛋白的血液制品可采用稀释法降低基质干扰，稀释倍数不得超出MVD。9.2.3污染排查：若供试品存在可见异物、浑浊等异常情况，应先排查是否为内毒素污染导致，排除后再进行预处理。9.3干扰初筛：取预处理后的供试品溶液，制备供试品阳性对照（PPC）：即供试品溶液中加入终浓度为2λ的内毒素标准品，同时设置阴性对照（NC，无内毒素检查用水）、阳性对照（PC，终浓度2λ的内毒素标准品溶液），按所选方法操作，若PC为阳性、NC为阴性、PPC为阳性，说明供试品在该浓度下无干扰，可直接用于正式检测；若PPC为阴性，说明存在基质干扰，需开展正式干扰试验。10干扰试验开展10.1鲎试剂灵敏度复核：每批次新采购的鲎试剂启用前应开展灵敏度复核，采用中国食品药品检定研究院发放的内毒素国家标准品，制备4个浓度梯度：0.5λ、λ、2λ、4λ，每个浓度设置4个平行管，阴性对照设置2个平行管，37±1℃孵育60±2min，结果判定：阴性对照全部阴性，0.5λ浓度平行管全部阴性，2λ、4λ浓度平行管全部阳性，λ浓度平行管至少2管阳性，计算几何平均灵敏度λc，若λc在0.5λ~2λ范围内，该批次鲎试剂灵敏度符合要求，可投入使用。10.2正式干扰试验设计：设置系列浓度的供试品溶液，浓度梯度覆盖MVD的1/2、1/4、1/8、1/16倍，每个浓度设置2个平行的供试品阴性对照（NPC）、2个平行的供试品阳性对照（PPC，终浓度2λ内毒素），同时设置NC、PC对照，按所选方法操作。10.3结果判定：若所有NPC为阴性、所有PPC为阳性（凝胶法），或内毒素回收率在50%~200%范围内（光度法），该浓度下供试品无基质干扰，可选择该浓度（不低于MVC）作为正式检测的供试品浓度。10.4干扰消除方法：稀释法：为最常用的干扰消除方法，将供试品稀释至无干扰的浓度，稀释倍数不得超出MVD；抗干扰剂法：采用鲎试剂配套的无内毒素抗干扰缓冲液，或加入终浓度0.05%~0.5%的无内毒素聚山梨酯20、聚乙二醇6000等物质，消除非特异性吸附或反应，加入的物质应验证无内毒素、不干扰反应；G因子旁路封闭：若供试品含β-葡聚糖、活病毒包膜等物质引发假阳性，应采用抗G因子旁路的特异性鲎试剂检测；超滤法：若供试品分子量<10kD，可采用截留分子量为10kD的无内毒素超滤膜，去除大分子基质后检测内毒素，应验证内毒素回收率≥50%。10.5干扰试验频次：首次开展某品种内毒素检测时应完成干扰试验，当供试品配方、生产工艺、鲎试剂来源/批次、检测方法、检测环境发生重大变更时，应重新开展干扰试验，无变更情况下每12个月应开展一次干扰试验复核。11正式检测操作11.1凝胶限度试验操作：11.1.1取无内毒素试管，分别设置：阴性对照（NC）：2管，每管加入0.1ml无内毒素检查用水；阳性对照（PC）：2管，每管加入0.1ml终浓度2λ的内毒素标准品溶液；供试品阳性对照（PPC）：2管，每管加入0.05ml供试品溶液+0.05ml终浓度4λ的内毒素标准品溶液；供试品阴性对照（NPC）：4管，每管加入0.1ml供试品溶液。11.1.2每管加入0.1ml鲎试剂，轻轻混匀，避免产生气泡，密封管口后置于37±1℃孵育60±2min，孵育过程中避免振动。11.1.3结果判定：将试管轻轻倒转180°，管内容物形成坚实凝胶且不滑落为阳性，未形成凝胶或凝胶碎裂滑落为阴性。试验有效性判定：NC全部阴性、PC全部阳性、PPC全部阳性，试验有效；若NPC全部阴性，判定供试品内毒素符合限值要求；若有1管及以上NPC阳性，应加倍平行管复试，复试仍有阳性管，判定供试品不符合限值要求。11.2光度法操作：11.2.1标准曲线制备：制备至少5个浓度梯度的内毒素标准品溶液，浓度范围覆盖供试品可能的内毒素含量，每个浓度设置2个平行管，同时设置2个NC管，按光度法操作规程检测，标准曲线的相关系数r≥0.980，NC响应值低于最低浓度点响应值，标准曲线有效。11.2.2供试品检测：每个供试品设置2个平行管，同时设置2个PPC管，检测结果应在标准曲线的线性范围内，超出范围的应稀释至线性范围内后重新检测，结果乘以稀释倍数即为供试品的内毒素含量。11.2.3结果判定：供试品内毒素含量低于限值判定为合格，高于限值判定为不合格，回收率在50%~200%范围内试验有效。12偏差处理与质量保证12.1偏差处理：若NC为阳性：说明存在外源性内毒素污染，应排查耗材是否过期、操作过程是否存在污染、环境消毒是否合格，更换耗材重新检测；若PC为阴性：说明鲎试剂失活或孵育条件不符合要求，应核查鲎试剂储存条件、有效期、孵育温度时间，更换合格鲎试剂重新检测；若PPC为阴性：说明基质干扰未消除，应重新开展干扰试验，调整供试品浓度或预处理方法，直至PPC符合要求。12.2试剂质量控制：鲎试剂应按说明书要求2~8℃避光储存，禁止冻融，开封后应在24h内使用，过期试剂严禁使用；内毒素标准品复溶时应旋涡混合至少15min，每一步稀释均应旋涡混合30s，避免内毒素吸附，复溶后的标准品2~8℃储存不超过24h，-20℃储存不超过1个月，避免反复冻融。12.3记录与归档：所有检测原始记录应包含供试品信息（名称、批号、规格、取样量、生产单位）、试剂信息（鲎试剂批号、灵敏度、有效期，内毒素标准品批号、效价）、操作过程（稀释倍数、孵育温度时间、结果）、检测人、复核人签字、日期，所有记录及验证报告应保存