生物制品硝酸盐还原试验指南（试行）

生物制品硝酸盐还原试验指南（试行）1适用范围本指南适用于各类生物制品（包括疫苗类、抗毒素及抗血清类、血液制品类、重组蛋白类、诊断用生物制品、细胞治疗产品等）的生产用菌株特性鉴定、污染微生物检定、原材料/中间品/成品的硝酸盐及亚硝酸盐残留检测，也适用于生物制品生产环境监测中分离微生物的生化表型鉴定。本指南为试行版，如有与《中华人民共和国药典》三部、国家强制性标准冲突的内容，以上级法定文件要求为准。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件：《中华人民共和国药典》2025年版三部通则GB4789.34-2012食品微生物学检验硝酸盐还原试验GB19489-2008实验室生物安全通用要求WHO《生物制品质量控制手册》第5版YY/T0681.1-2023无菌医疗器械包装试验方法第1部分：微生物学性能要求3术语和定义3.1硝酸盐还原试验：指通过检测硝酸盐被还原后的产物，判定待检体系是否存在硝酸盐还原酶活性的生化试验或化学分析试验。3.2部分还原阳性：指硝酸盐仅被还原为亚硝酸盐，加入显色试剂后可直接观测到红色反应的结果类型。3.3完全还原阳性：指硝酸盐被还原为亚硝酸盐后，进一步被还原为氨、氮氧化物、氮气等低价态氮化物，加入显色试剂无红色反应，加入锌粉验证后仍无红色反应的结果类型。3.4锌粉验证：指针对加入显色试剂后无红色反应的体系，通过加入锌粉还原未被微生物/酶分解的硝酸盐，判定硝酸盐是否被完全还原的验证步骤。3.5基质干扰：指待检样品中除目标物外的其他组分（如蛋白、色素、还原性物质等）对显色反应、还原反应产生的抑制或增强效应。4试验原理4.1微生物源性硝酸盐还原原理：部分微生物可产生组成型或诱导型硝酸盐还原酶，在厌氧或微需氧条件下将硝酸盐（NO₃⁻）作为电子受体还原为亚硝酸盐（NO₂⁻）；部分微生物可进一步产生亚硝酸盐还原酶、氨化酶、硝化酶等，将亚硝酸盐逐步还原为羟胺、氨、一氧化氮、一氧化二氮、氮气等终产物。4.2显色反应原理：亚硝酸盐在酸性条件下可与对氨基苯磺酸（或磺胺）发生重氮化反应生成重氮盐，重氮盐再与α-萘胺（或N-1-萘基乙二胺盐酸盐）偶联生成红色偶氮染料，反应灵敏度可达0.1μg/mL亚硝酸盐。4.3验证反应原理：锌粉为强还原剂，在酸性条件下可将未被分解的硝酸盐还原为亚硝酸盐，若加入锌粉后体系显红色，说明原体系中硝酸盐未被还原，判定为阴性；若加入锌粉后仍无红色，说明硝酸盐已被完全还原为非亚硝酸盐类低价态氮化物，仍判定为阳性。4.4定量检测原理：已知浓度的亚硝酸盐标准溶液按相同显色反应获得吸光度-浓度标准曲线，待检样品经还原反应、显色反应后测得的吸光度代入标准曲线，可计算得到亚硝酸盐总量，扣除样品本底亚硝酸盐含量后即可得到硝酸盐含量。5试剂与耗材要求5.1基础试剂纯度要求所有试剂均为分析纯及以上级别，试验用水为无硝酸盐、无亚硝酸盐的一级纯化水（电导率≤0.055μS/cm，25℃），所有玻璃、塑料耗材使用前需经无氮纯化水冲洗3次以上，干燥后密封保存，避免环境氮污染。5.2硝酸盐蛋白胨水培养基（微生物鉴定用）5.2.1配方：蛋白胨10.0g、无亚硝酸盐硝酸钾0.2g、氯化钠5.0g、纯化水1000mL，pH调节至7.2±0.2。5.2.2配制方法：将各组分溶解于纯化水中，121℃高压灭菌15min，冷却后分装至无菌试管，每管5mL，4℃密封储存有效期30天。5.2.3适用性验证：每批新配制培养基需使用标准菌株验证性能：接种大肠埃希氏菌CMCC(B)44102（部分还原阳性株）36℃培养18h后加显色试剂应显红色；接种脱氮副球菌CMCC(B)11001（完全还原阳性株）36℃培养18h后加显色试剂无红色，加锌粉后仍无红色；接种粪产碱杆菌CMCC(B)40001（阴性株）36℃培养18h后加显色试剂无红色，加锌粉后显红色，三项符合要求方可使用。5.3显色试剂5.3.1传统型显色试剂（仅供微生物定性试验使用）：A液：取8.0g对氨基苯磺酸溶于1000mL5mol/L冰乙酸溶液，避光密封保存，4℃有效期6个月；B液：取5.0gα-萘胺溶于1000mL5mol/L冰乙酸溶液，避光密封保存，4℃有效期3个月，试剂出现棕色沉淀时需废弃。5.3.2低毒稳定型显色试剂（定性、定量试验通用，推荐使用）：A液：取10.0g磺胺溶于1000mL2.5mol/L磷酸溶液，避光密封保存，室温有效期12个月；B液：取0.5gN-1-萘基乙二胺盐酸盐溶于1000mL纯化水，避光密封保存，4℃有效期6个月，试剂出现粉色时需废弃。5.4锌粉分析纯，粒径200目，每批锌粉需做空白验证：取1mL无硝酸盐纯化水加入10mg锌粉，再加显色试剂，无红色反应方可使用，锌粉需密封干燥保存，避免受潮氧化失效。5.5硝酸盐还原酶（定量检测用）酶活性≥10U/mg，使用时按0.1U/mL反应体系添加，37℃下硝酸盐转化率≥98%，-20℃分装储存，避免反复冻融，有效期12个月。5.6标准溶液亚硝酸盐标准储备液：准确称取0.1500g干燥至恒重的亚硝酸钠（优级纯），用纯化水定容至1000mL，浓度为100μg/mL（以亚硝酸根计），4℃避光储存有效期6个月；硝酸盐标准储备液：准确称取0.1371g干燥至恒重的硝酸钾（优级纯），用纯化水定容至1000mL，浓度为100μg/mL（以硝酸根计），4℃避光储存有效期6个月；标准工作液临用前用纯化水稀释至所需浓度。5.7其他耗材无菌15mL试管、1mL/5mL移液器及配套无菌枪头、接种环（1μL）、0.22μm无菌滤膜、C18固相萃取小柱、麦氏浊度管、生物安全柜配套耗材等。6仪器设备要求6.1基本设备：二级生物安全柜（符合GB19489要求）、高压蒸汽灭菌器（温度精度±0.5℃，定期校准）、恒温培养箱（温度精度±1℃）、厌氧培养箱、CO₂培养箱、万分之一分析天平、pH计（精度±0.01，每次使用前校准）、紫外-可见分光光度计（波长精度±1nm）、高速离心机（最大转速≥10000r/min）、涡旋振荡器、恒温水浴锅（温度精度±0.5℃）。6.2校准要求：所有计量设备需按国家计量检定规程定期校准，校准合格后方可使用，校准记录保存至设备报废后5年。7试验前准备7.1样品处理7.1.1微生物检定样品：待检菌株需为纯化的单菌落，使用0.9%无菌氯化钠溶液制备成0.5麦氏浊度的菌悬液，浓度约为1.5×10⁸CFU/mL；若为污染菌检测，需先将待检样品接种至增菌培养基增菌后，分离纯化单菌落再进行试验。7.1.2残留检测样品：液体样品（如原液、成品注射液、细胞培养液）直接取样，若有固体颗粒需4000r/min离心10min取上清；固体样品（如冻干制剂、佐剂、蛋白原料）称取5.0g加入25mL无氮纯化水，涡旋混匀5min，4000r/min离心10min取上清；若样品含高浓度蛋白、色素或还原性物质，上清液需经C18固相萃取小柱净化，收集流出液待检；若样品含防腐剂，需经0.22μm滤膜过滤后用无氮纯化水稀释10倍后待检。7.2对照设置每批次试验必须同步设置以下对照，对照结果符合要求时试验结果方可生效：7.2.1部分还原阳性对照：接种大肠埃希氏菌CMCC(B)44102至硝酸盐培养基，同步培养。7.2.2完全还原阳性对照：接种脱氮副球菌CMCC(B)11001至硝酸盐培养基，同步培养。7.2.3阴性对照：接种粪产碱杆菌CMCC(B)40001至硝酸盐培养基，同步培养。7.2.4空白对照：取未接种的硝酸盐培养基（微生物试验）或无氮纯化水（残留检测试验），同步进行所有操作步骤。7.2.5加标回收对照（定量试验必备）：向已知本底的样品中添加0.5μg/mL硝酸盐标准品，同步处理检测，回收率需在80%~120%范围内。7.3人员要求操作人员需经微生物检测、生物安全操作专项培训，考核合格后方可上岗，操作过程严格遵守无菌操作规范。8操作步骤8.1微生物硝酸盐还原定性试验（菌株鉴定/污染菌检定用）8.1.1接种：取0.1mL制备好的待检菌悬液接种至5mL硝酸盐蛋白胨水培养基中，每株待检菌做2份平行样，同时接种所有对照菌株。8.1.2培养：普通需氧/兼性厌氧菌36℃±1℃恒温培养18~24h；苛养菌（如奈瑟菌属、嗜血杆菌属）置于5%CO₂培养箱36℃培养48h；厌氧菌置于厌氧培养箱36℃培养48~72h；若待检菌生长缓慢，可延长培养时间至7天，培养结束后观察试管内浑浊度，确认菌株生长良好，无杂菌污染。8.1.3显色：取1mL培养后的上清液至干净试管，先加入0.5mL显色试剂A液，充分摇匀，再加入0.5mL显色试剂B液，摇匀后静置1~5min观察颜色变化。8.1.4锌粉验证：若加入显色试剂后无红色反应，向试管中加入10mg±2mg锌粉，充分摇匀，静置1~5min再次观察颜色变化。8.2硝酸盐/亚硝酸盐残留定量试验（原材料/中间品/成品检测用）8.2.1标准曲线制备：取亚硝酸盐标准工作液配制浓度为0μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL的标准系列，各取1mL分别加入0.5mL显色试剂A液、0.5mL显色试剂B液，摇匀后室温避光放置10min，以空白管调零，在540nm波长下测定吸光度，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，线性相关系数r需≥0.999。8.2.2本底亚硝酸盐检测：取1mL处理后的样品液，不加硝酸盐还原酶，直接按8.2.1步骤显色，测定吸光度，计算本底亚硝酸盐含量。8.2.3总亚硝酸盐检测：取1mL处理后的样品液，加入0.1U硝酸盐还原酶、0.5mLpH7.0磷酸盐缓冲液，37℃水浴反应30min，确保硝酸盐完全还原为亚硝酸盐，再按8.2.1步骤显色，测定吸光度，计算总亚硝酸盐含量。8.2.4结果计算：样品中硝酸盐含量=（总亚硝酸盐含量-本底亚硝酸盐含量）×1.348，其中1.348为亚硝酸根换算为硝酸根的系数。9结果判定9.1定性试验结果判定9.1.1阳性结果：加入显色试剂后出现红色，判定为硝酸盐还原阳性（部分还原型）；加入显色试剂无红色，加入锌粉后仍无红色，判定为硝酸盐还原阳性（完全还原型）。9.1.2阴性结果：加入显色试剂无红色，加入锌粉后出现红色，判定为硝酸盐还原阴性。9.2定量试验结果判定9.2.1试验有效性判定：空白对照吸光度≤0.030，加标回收率在80%~120%范围内，标准曲线相关系数r≥0.999，试验结果有效。9.2.2限量判定：按对应生物制品的质量标准要求判定，若未作明确规定，生物制品成品中硝酸盐残留不得超过10mg/L，亚硝酸盐残留不得超过1mg/L。9.3结果无效情形出现以下任意一种情况时，试验结果无效，需重新开展试验：（1）空白对照出现红色反应，说明培养基、试剂或耗材存在亚硝酸盐污染；（2）任意对照菌株结果不符合预期，说明培养基、试剂失效或培养条件不符；（3）平行样结果相对偏差超过20%，说明操作存在误差；（4）待检菌株培养管无明显生长，说明接种量不足或培养条件不适宜。10质量控制要求10.1试剂质量控制：每批新配制的培养基、显色试剂、还原酶、锌粉均需开展性能验证，验证记录保存至试剂过期后1年；试剂储存严格按要求执行，超过有效期的试剂一律废弃。10.2过程质量控制：每批次试验必须同步设置所有规定对照，不得省略；试验原始记录需包含样品编号、样品名称、试剂批号、培养基批号、培养条件、对照结果、样品结果、操作人员、试验日期等信息，记录保存至少5年，符合生物制品追溯要求。10.3人员质量控制：每季度开展一次人员比对试验，两名操作人员检测同一样品的结果偏差不得超过10%，不合格人员需重新培训考核。10.4溯源要求：所有标准菌株、标准物质均需具备合法溯源证书，标准菌株传代次数不得超过5代。11干扰因素与排除方法11.1假阳性干扰排除（1）培养基/试剂亚硝酸盐本底过高：每批培养基、试剂使用前做空白验证，空白显色的批次不得使用；（2）样品本底含亚硝酸盐：设置样品本底对照，扣除本底值后判定结果；（3）锌粉含亚硝酸盐杂质：做锌粉空白验证，显色的锌粉不得使用；（4）样品含高浓度亚硝酸根类似物：采用离子色谱法对阳性结果进行复核。11.2假阴性干扰排除（1）锌粉加量过量：过量锌粉会将生成的亚硝酸盐进一步还原为氨，导致红色消退，严格控制锌粉加量为10mg±2mg；（2）硝酸盐含量不足：每批培养基检测硝酸盐含量，不得低于0.1g/L；（3）菌株生长不良：优化培养条件，延长培养时间，或补充0.1%葡萄糖到培养基中促进菌株产酶；（4）显色试剂失效：试剂变色后立即废弃，每批试剂用0.1μg/mL亚硝酸盐标准溶液验证检出限，符合要求方可使用；（5）样品含还原性物质（如维生素C、巯基化合物等）：样品前处理时加入0.1%稀过氧化氢反应5min去除干扰，或做加标回收验证回收率符合要求。12生物安全与废弃物处理12.1生物安全要求：涉及致病性微生物的操作需在二级及以上生物安全柜中进行，操作人员穿戴隔离服、手套、口罩，高致病性微生物操作按三级生物安全要求执行。12.2废弃物处理：所有接种过微生物的培养基、枪头、试管需经121℃高压灭菌30min后按医疗