ISO 43072021 分子体外诊断检验.唾液预检验过程规范.分离的人类DNA标准立项发展报告

分子体外诊断检验唾液预检验过程规范分离的人类DNA标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Molecularinvitrodiagnosticexaminations—Specificationsforpre-examinationprocessesforsaliva—IsolatedhumanDNA摘要随着精准医学和个体化诊疗技术的飞速发展，体外诊断（InVitroDiagnostics,IVD）在临床决策中的作用日益凸显。唾液作为无创、便捷的生物样本来源，在分子诊断领域特别是人类DNA分析中展现出广阔的应用前景。然而，唾液样本的采集、运输、储存及核酸提取等预检验环节的质量控制缺乏统一规范，严重影响检测结果的准确性和可比性。ISO4307:2021《分子体外诊断检验唾液预检验过程规范分离的人类DNA》由国际标准化组织（ISO）于2021年10月22日正式发布，是全球首部专门针对唾液样本分子诊断预检验过程制定的国际标准。本报告对该标准的立项背景、编制历程、核心技术内容、主要参与单位及行业影响进行系统阐述。该标准规定了唾液样本预检验过程的总体要求、质量指标、文档记录及质量控制措施，填补了国际标准在该领域的空白，为全球范围内唾液DNA分子诊断的规范化和标准化提供了权威技术依据。关键词：分子体外诊断；唾液样本；预检验过程；DNA提取；国际标准；质量保证；标准化Keywords:Molecularinvitrodiagnostics;Salivaspecimens;Pre-examinationprocesses;DNAextraction;Internationalstandards;Qualityassurance;Standardization一、引言1.1研究背景唾液作为一种新兴的临床生物样本，因其采集过程完全无创、无需专业医疗人员操作、患者依从性高等显著优势，近年来在基因分型、药物基因组学、肿瘤标志物检测、感染性疾病筛查及法医物证鉴定等领域得到了广泛研究和临床应用。特别是随着高通量测序技术（Next-GenerationSequencing,NGS）和数字PCR等尖端检测平台的普及，唾液样本中提取的人源DNA成为分子诊断的重要起始材料。然而，与血液和组织样本相比，唾液样本具有成分复杂、DNA含量波动大、易受口腔微生物污染、核酸降解风险高等特点。唾液样本中不仅包含人源脱落上皮细胞，还含有大量口腔细菌、食物残渣及外源性DNA，其采集方式（如自然吐唾、拭子刮拭、唾液采集器等）、采集时间、保存液配方、运输温度及储存条件等因素均可能对下游DNA提取效率和质量产生显著影响。多项研究表明，预检验环节引入的变异占总检测误差的比例可高达60%以上，然而，长期以来该领域缺乏统一、可操作的国际标准作为技术支撑。1.2标准立项必要性与紧迫性在ISO4307:2021发布之前，分子诊断领域的国际标准主要集中于检测方法本身，如PCR扩增、测序等检测环节的标准化（如ISO15189、ISO15193等），而对于样本进入实验室检测之前的关键准备阶段——即"预检验阶段"（pre-examinationphase）的规范尚不完善。尽管ISO20184系列和ISO20186系列分别对组织样本和血液样本的预检验过程进行了规范，但唾液样本因其独特的生物学特性，无法简单套用上述标准。因此，制定专门针对唾液样本的预检验过程国际标准，具有以下方面的紧迫需求：1.临床准确性需求：唾液DNA检测结果的准确性高度依赖于样本质量和核酸完整性，需通过标准化预检验流程加以保障；2.结果可比性需求：不同医疗机构、不同实验室间的检测结果需要具备可比性，标准化是前提；3.产业发展需求：唾液检测产品（如唾液采集器、保存液、提取试剂盒）的研发与注册亟需统一的技术标准作为参考；4.国际互认需求：跨境医疗合作和体外诊断产品的国际贸易需要统一的国际标准予以支持。二、标准编制历程与组织架构2.1标准制定机构ISO4307:2021由国际标准化组织（InternationalOrganizationforStandardization）下属的技术委员会ISO/TC212"临床实验室检验和体外诊断系统"（Clinicallaboratorytestingandinvitrodiagnostictestsystems）负责制定，具体由WG2"参考系统与质量控制"工作组承担编制任务。ISO/TC212成立于1995年，秘书处由美国国家标准协会（ANSI）承担，其工作范围涵盖临床实验室检验、体外诊断设备与试剂的质量要求、参考系统建立及风险评估等领域。在ISO/TC212的组织框架下，唾液样本预检验标准的制定历经了多个阶段。早在2015年前后，ISO/TC212即启动了针对非血液类体液样本预检验标准的调研和讨论，这是人类社会在分子诊断标准化领域迈出的重要一步。经过预研、国际专家投票立项，该项目通过国际标准制定路线正式立项（项目编号：ISO/NP4307），随后成立专项工作组（对应工作组为ISO/TC212/WG2下属项目组）负责起草工作。项目组汇集了来自全球多个国家的临床检验医学、分子生物学、生物样本库管理、体外诊断产业及标准化管理领域的专家学者。工作组成员包括来自美国、德国、日本、中国、英国、法国、韩国、澳大利亚等国家的注册专家，以及世界卫生组织（WHO）、国际临床化学与检验医学联合会（IFCC）等国际组织的联络代表。标准草案经过委员会草案（CD）、国际标准草案（DIS）和最终国际标准草案（FDIS）等多个阶段的投票和修改，历时约五年的充分研讨和反复修订，最终于2021年10月22日由ISO中央秘书处正式出版发布。2.2标准定位与适用范围ISO4307:2021是ISO在分子体外诊断预检验领域发布的专门针对唾液样本的核心标准之一，属于ISO/TC212框架下"预检验过程标准系列"的重要组成部分。该系列标准还包括针对组织样本（ISO20184系列）、血液样本（ISO20186系列）、尿液样本、粪便样本等的预检验规范，共同构成了覆盖多种临床样本类型的预检验标准化体系。该标准为体外诊断检验中唾液样本的预检验过程提供了明确的技术规范和操作指引，适用于所有从事唾液DNA分子检测的临床实验室、第三方检测机构、科研单位及体外诊断设备与试剂制造商。标准涵盖从唾液样本采集到DNA分离完成的全流程，包括样本采集、标识、运输、接收、储存、核酸提取及质量评估等环节。三、标准核心技术内容解读3.1标准总体框架ISO4307:2021在结构编排上遵循了ISO标准文件的一般体例规范，同时在内容组织上充分体现出专业性、实用性和系统性。该标准还涉及多个规范性引用文件和术语定义部分，为准确理解标准条款提供了重要的基础支撑。核心章节涵盖以下方面：-术语和定义：明确了"唾液"（saliva）、"预检验过程"（pre-examinationprocess）、"分离的人类DNA"（isolatedhumanDNA）、"分析物"（analyte）、"批次"（batch）、"样本采集"（samplecollection）等关键术语的标准定义，确保国际范围内理解的一致性；-唾液样本采集的通用要求：包括对采集对象的状态评估（如采集前30分钟内不得进食、饮水、吸烟或进行口腔清洁等），以及采集环境的要求；-样本采集设备与容器：规定唾液采集器、保存管及保存液的技术性能要求，包括密封性、无菌性、DNA保护性能等；-样本标识与信息记录：规定唯一标识符（uniqueidentifier）的使用要求，确保样本在整个流转过程中的可追溯性；-DNA提取与纯化：规定提取方法的选择依据、提取效率和质量的评估指标及内参控制的使用规范；-质量评估指标：包括DNA浓度（建议使用荧光法如Qubit检测）、纯度（A260/A280比值）、完整性（DNAIntegrityNumber，DIN或片段分析）、内源性抑制物残留的生物化学标记等技术指标；-文件记录与质量控制：要求建立完善的文档体系和质控计划，对预检验流程进行持续质量监测。3.2关键技术要求3.2.1唾液样本采集规范标准将唾液采集方法分为三大类并分别提出技术要求：（1）自然吐唾法（passivedrool），要求采集量为1-5mL，采集时间宜安排在早晨起床后或餐后至少60分钟进行；（2）口腔拭子法（oralswab），明确拭子材质以聚酯纤维或棉签为宜，采样时需在双侧颊黏膜各擦拭至少30秒；（3）唾液采集器法（salivacollectiondevice），采集器需具备固液分离功能，并含有针对核酸酶抑制的稳定液。标准着重提示，采集过程中应尽量避免混入痰液。由于痰液含有大量粘蛋白和多糖类物质，不仅会降低DNA提取效率，还可能抑制下游PCR扩增反应，因此采集指导中应明确告知患者"采集的是唾液而非痰液"。3.2.2样本运输与储存条件研究证实，唾液样本中的人源DNA在常温下可稳定保存至7天，4℃条件下可稳定保存至14天，-20℃及以下可实现长期保存。ISO4307:2021据此将运输温度控制要求分为三级：常温运输（≤25℃时运输时间不超过72小时）、冷藏运输（2-8℃，运输时间不超过7天）、冷冻运输（≤-20℃）。标准同时强调，唾液样本应尽量避免反复冻融，若需长期保存则宜分装后进行冻存。3.2.3DNA提取与质量评估标准规定，DNA提取方法的选择应充分考虑唾液样本中的人源细胞含量差异。不同个体的唾液细胞浓度在口腔脱落上皮细胞数量上存在明显差异，且受采集方式影响显著。因此，标准要求提取过程中应采用适当的裂解条件，并设置提取对照（extractioncontrol）以评估提取效率。对于纯化后的DNA，标准推荐的最低质量要求为：浓度不低于10ng/μL、A260/A280比值处于1.7~2.0区间、A260/A230比值应大于1.5，建议采用琼脂糖凝胶电泳或微流控毛细管电泳评估DNA完整性。针对唾液样本中常见的PCR抑制物（如粘蛋白、多糖、尿素及口腔护理产品残留成分），标准要求验证提取方法对上述抑制物的去除效果。3.2.4质量控制与风险管理标准引入了ISO15189和ISO15190中的质量管理理念，要求实验室建立预检验过程的质量指标（QualityIndicators）监测体系。推荐监测的质量指标包括：样本不合格率、采集至实验室接收的时间间隔中位数、DNA提取失败率、样本标识错误率等，并要求定期评审上述指标及实施持续改进措施。四、主要起草单位介绍——以中国部分参与单位为例在ISO4307:2021的编制过程中，中国作为ISO/TC212的积极成员（P成员）全程参与标准的研讨与投票工作。中国合格评定国家认可委员会（CNAS）、中国食品药品检定研究院（中检院）及相关体外诊断龙头企业代表中国参加了该标准的制定工作。其中，中国食品药品检定研究院是本标准编制过程中最具代表性的参与单位之一，以下对其进行详细介绍。4.1单位概况中国食品药品检定研究院（以下简称"中检院"）前身为成立于1950年的卫生部药物食品检验所，是国家药品监督管理局直属的正司局级事业单位，承担着全国药品、生物制品、医疗器械、体外诊断试剂、化妆品等的检验检测、标准制定、质量监督及技术仲裁等核心职能。中检院作为国家级药品和医疗器械检验机构，是国际标准化组织ISO/TC212国内技术对口单位之一，同时担任全国医用临床检验实验室和体外诊断系统标准化技术委员会（SAC/TC136）的秘书处单位。4.2技术实力与专家资源4.3在ISO4307:2021编制中的贡献中检院派出的注册专家全程参与了ISO4307标准项目组的历次工作会议和草案研讨。在标准不同阶段的国际标准草案（DIS）和最终国际标准草案（FDIS）投票过程中，中检院在综合国内行业意见的基础上，代表中国提出了多项具有建设性的技术建议，包括：1.建议明确"唾液"与"口腔液"的术语差异：提出将标准适用范围聚焦于唾液而非广义的口腔液，确保技术指标的针对性；2.建议增加针对儿童和老年人群的唾液采集指引：考虑到特殊人群唾液分泌量差异和采集依从性问题，建议增加相应的操作说明；3.建议强化对不同保存液配方的性能验证要求：针对市场上唾液保存液成分多样化的问题，提议在标准中增加保存液与下游DNA提取试剂兼容性验证的基本要求。中检院的研究团队基于大量实验数据，为标准的制订提供了翔实的中国人群唾液样本预检验相关数据支撑，包括中国人群唾液DNA提取率与纯度的基线数据、不同保存条件对DNA长期稳定性的影响等，这些数据帮助标准制定工作组完善了技术指标的设定。4.4后续推广与应用五、标准实施的意义与行业影响5.1对临床检验质量提升的推动ISO4307:2021为唾液DNA分子检测建立了全球统一的最低技术要求，有助于各实验室建立规范化的预检验操作流程，从源头控制检测质量。通过实施该标准，实验室能够有效降低唾液样本预检验阶段的变异引入率，提升检测结果的可信度和可重复性。特别是在肿瘤液体活检、产前筛查及遗传病基因检测等对DNA质量要求极高的临床场景中，该标准的实施对保障患者安全具有直接的临床意义。5.2对体外诊断产业的规范化促进作用对于体外诊断制造商而言，ISO4307:2021为唾液采集设备、保存液、DNA提取试剂盒及自动化提取系统的研发设计提供了明确的技术参照。该标准的发布促进了唾液诊断产品从设计验证到性能评价全链条的规范化发展，有利于规范市场秩序、提高产品准入门槛。同时，对于在欧盟IVDR法规框架下或各国监管体系中进行产品注册的企业，遵循ISO4307:2021有助于简化技术文件准备流程，加快上市速度。5.3对国际互认与全球合作的意义作为一项由国际标准化组织发布的正式标准，ISO4307:2021在消除贸易技术壁垒、促进全球范围内检验结果互认方面具有重要作用。通过标准化的预检验流程，不同国家、不同实验室获得的唾液DNA检测结果将具备更高的可比性，为国际多中心临床试验、跨境医疗合作及全球公共卫生监测（如疫情暴发时的大规模人群筛查）提供有力的技术支撑。六、结论与展望ISO4307:2021《分子体外诊断检验唾液预检验过程规范分离的人类DNA》的发布和正式实施，填补了国际标准体系中唾液样本分子诊断预检验领域的重要空白，是体外诊断标准化进程中具有里程碑意义的标志性成果。该标准基于科学证据和全球实践经验，对唾液样本的采集、运输、储存及DNA提取环节提出了系统、可操作的技术要求，为提升唾液DNA分子检测的质量和可靠性提供了重要的国际规范支撑。参考文献[1]ISO4307:2021,Molecularinvitrodiagnosticexaminations—Specificationsforpre-examinationprocessesfor