器官移植及免疫检验课件

器官移植及免疫学检验免疫学检验器官移植及免疫学检验第33次课主讲：王传生目录器官移植的基本知识1组织配型及配型方法2

避免移植排斥反应的免疫学检验及意义3移植后的免疫监测4移植的结局与对策5Part1器官移植的基本知识移植的概念

1应用正常的器官、组织、细胞置换病变的器官、组织、细胞被移植的部分提供移植物的个体接受移植物的个体供者(donor)

移植(transplantation)移植物(graft)受者(recipient)移植的类型异种移植不同物种之间的不同物种之间移植排斥反应强烈移植物较难存活较难存活自体移植不同物种之间的自身组织移植不发生排斥反应难存活同系移植同卵双胞胎间移植不发生排斥反应同种移植不同物种之间的移植。同种不同个体间移植常会出现排斥反应移植一般属于该型移植难存活

2(autograft)(allograft)(syngraft)(xenograft)移植排斥反应

3受者移植物宿主抗移植物排斥反应移植物抗宿主排斥反应移植transplantationrejection移植排斥反应移植排斥反应概念移植排斥反应

3（1）主要组织相容性抗原(HLA)

主要：HLA-DR抗原，其次：HLA-A和HLA-B抗原（2）次要组织相容性抗原(mHA)

①Y染色体编码mHA：表达于精子、表皮细胞、脑细胞②常染色体编码mHA：第6号染色体之外→某些表达于所有细胞

某些仅表达于造血细胞和白血病细胞（3）ABO血型抗原红细胞、血管内皮细胞表达（4）组织特异性抗原独立于HLA抗原、ABO血型抗原之外另一类抗原系统

广泛分布于所有组织中（1）诱导移植排斥反应的抗原移植排斥反应

3（2）T细胞识别同种异型抗原的机制供者APC将与自身MHC分子结合的外源性抗原肽或自身抗原肽提呈给受者T细胞,诱导移植排斥反应受者MHC分子TCR供者MHC分子受者T细胞受者T细胞供者MHC分子供者外源或自身抗原肽供者APC受者APCTCR直接识别间接识别受者APC对移植物脱落细胞或MHC分子进行摄取、加工处理,与自身MHC分子结合,提呈给自身T细胞,诱导移植排斥反应直接识别，主要活化CD8阳性T细胞，在急性移植排斥反应早期起主要作用间接识别，主要活化CD4阳性T细胞，在急性移植排斥反应中晚期以及慢性排斥反应起主要作用移植排斥反应

3细胞免疫应答效应（3）移植排斥反应的效应机制体液免疫应答效应体液免疫应答效应CD4+Th1、CD8+CTL→主要作用

调理作用、ADCC作用、激活补体

NK细胞→ADCC、细胞因子→炎症1．在器官移植时提供健康组织或器官个体称为A．供者B．受者C．宿主D．移植物E．移植器官2．同系移植是指A．自身组织移植B．同种不同个体间移植C．不同物种之间移植D．同卵双胞胎间移植E．以上均是3．受者对移植物发生排斥的主要抗原是A．ABO血型抗原B．Rh血型抗原C．HLA抗原D．mHAE．隐蔽抗原4．受体的免疫细胞对移植物的直接识别后A．主要活化CD8阳性的T细胞B．主要活化CD4阳性的T细胞C．主要活化B细胞D．通过活化CTL，在慢性排斥反应中发挥作用E．通过活化CD4阳性细胞参与急性排斥反应5．受体免疫细胞间接识别移植物后A．以活化CD8阳性的T细胞为主B．以活化CD4阳性的T细胞为主C．主要活化B细胞D.发生急性排斥反应E.发生超急性排斥反应习题移植排斥反应

3超急性排斥反应(hyperacuterejection)发生于血管接通后数分钟至24小时

发生机制→由于受者体内存在供者抗体，主要发生体液免疫

病理改变→移植物不可逆性缺血、变性、坏死

处理措施→无有效手段，一旦发生应，要立即切除移植物急性排斥反应(acuterejection)发生于移植术后几天至2周内，最常见

发生机制机制→主要发生细胞免疫，造成移植物损伤病理改变→发热、移植部位肿痛、移植器官功能衰退

处理措施→及早应用免疫抑制剂治疗，大多数可缓解慢性排斥反应(chronicrejection)发生于移植后数月至数年

发生机制→免疫学损伤、非免疫学损伤病理改变→正常组织结构丧失和纤维化，血管平滑肌细胞增生，移植物血管破坏宿主抗移植物反应(hostversusgraftreaction，HVGR)（四）移植排斥反应的类型

宿主抗移植物反应移植排斥反应

3条件：①移植物中有大量免疫活性细胞

②宿主和移植物组织相容性抗原不符

③宿主处于免疫功能极度低下的状态常见：骨髓、胸腺、脾脏移植，新生儿大量输血种类：①急性：皮疹甚至皮肤剥脱、肝区不适、脾大、黄疸、腹泻

②慢性：皮损(色素沉着、脱屑增厚、角化不良、苔藓样皮疹)、关节挛缩、多器官功能衰竭

移植物抗宿主反应移植物抗宿主反应(graftversushostreaction，GVHR)移植排斥反应

3GVHR临床表现1．超急排发生的时间在A．数周内B．3月内C．数年内D．数月内E．数分钟～24小时内2．下列哪种情况不符合慢性排斥反应的特点A．病程进展缓慢B．正常组织结构丧失C．血管壁纤维化D．血栓形成E．一般发生于移植后数月甚至数年3．移植物抗宿主反应（GVHR）主要见于A．心脏移植B．

肝脏移植C．骨髓移植D．肺移植E．肾脏移植4．可同时存在HVGR和GVHR两种移植排斥反应的是A．骨髓移植B．肾脏移植C．肝脏移植D．心脏移植E．肺脏移植习题Part2组织配型及配型方法(一）HLA分型血清学分型法

1(complementdependentcytotoxicity,CDC)原理：将待检淋巴细胞与一系列已知抗HLA标准分型血清混合后，抗体会特异性结合表达相应HLA抗原的淋巴细胞，在补体的作用下，引起细胞死亡，死亡的细胞可被台盼蓝等染料染色，而活细胞由于细胞膜完整不着色，根据死亡细胞的百分比，判定其HLA的型别SD抗原：血清学方法检测的HLA称为SD抗原(serologicallydefinedantigen)SD抗原包括HLA-A、B、C、DQ、DR方法评价：简单、可靠、无须特殊仪器，但抗HLA标准分型血清难以获得，不同批号抗血清结果间存在差异补体依赖细胞毒试验血清学分型法

11（供者/受者）待检淋巴细胞23根据死亡细胞的百分比，判定其HLA型别已知抗HLA标准分型血清(抗体)

补体台酚蓝结果观察细胞学分型法

2原理：两个基因型不同个体的淋巴细胞，在体外进行混合培养时，由于彼此的HLA不同，能相互刺激导致双方淋巴细胞活化增殖和分化，进而表现形态学的变化和细胞增殖，可通过形态学或3H-TdR渗入试验来检测淋巴细胞反应强度，从而判定其HLA型别方法：单向MLC——已知HLA型别灭活淋巴细胞+未知淋巴细胞

双向MLC——两种淋巴细胞混合LD抗原：细胞学方法检测的HLA称为LD抗原(lymphocytedefinedantigen)LD抗原包括HLA-ⅡD、DP方法评价：用于分型的细胞难以获得和操作复杂，此方法逐渐被淘汰(mixedlymphocyteculture,MLC)混合淋巴细胞培养细胞学分型法

2已知HLA型别淋巴细胞淋巴母细胞子代淋巴细胞3H-TdR检测刺激指数﹢待检淋巴细胞丝裂霉素C或X线照射

单向MLC混合淋巴细胞培养方法评价：能判定HLA型别细胞学分型法

2供者淋巴细胞淋巴母细胞子代淋巴细胞3H-TdR检测刺激指数﹢受者淋巴细胞方法评价：不能判定HLA型别，只能说明供者与受者之间HLA配合的程度

双向MLC混合淋巴细胞培养基因分型法

3(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)

最早建立的HLA基因分型技术。

不同个体间的HLA复合体存在核苷酸碱基序列的差异，这种差异造成限制性内切酶识别位置及酶切位点数目的不同，用一组限制性内切酶消化、识别、切割这些位点，产生数量和长度不一的DNA酶解片段，经电泳、转膜后，用特异性探针与酶解片段进行杂交即可确定HLA的基因型别。也可先对DNA片段进行体外PCR扩增，然后再进行RFLP分析，即PCR-RFLP。

（1）限制性片段长度多态性分析││││││││││││││││││││││││││AACACCGTGAATTCAAACTACTGCTGTTGTGGCACTTAAGTTTGATGACGAC││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││AACACCGTGAATTCAAACTACTGCTGTTGTGGCACTTAAGTTTGATGACGAC││││││││││││││││││││││││││HLA复合体酶解片段基因分型法

3内切酶1内切酶2RFLP琼脂糖电泳→转膜→探针确定限制性片段长度基因分型法

3(polymerasechainreaction-sequencespecificoligonucleotideprobing,PCR-SSOP)鉴定HLAⅡ类抗原应用最广泛的方法。

先对HLA基因片段进行PCR扩增，然后将扩增片段转移至NC膜或尼龙膜上，然后与用放射性核素、酶、地高辛等标记的寡核苷酸探针进行杂交，若待检DNA与探针序列互补，则两者结合，从而确定HLA的基因型别。

（2）聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交││││││││││││││││││││││CACCGTGAATTCAAACTACTGCGTGGCACTTAAGTTTGATGACG││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││CACCGTGAATTCAAACTACTGCGTGGCACTTAAGTTTGATGACG││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││CACCGTGAATTCAAACTACTGCGTGGCACTTAAGTTTGATGACG││││││││││││││││││││││GAATTCAAAC│││││││││││││GAA待检HLAⅡ复合体基因分型法

33′5′94℃变性55℃退火72℃延伸第1步：PCR正向引物3′5′扩增的HLAⅡ复合体片段目的基因││││││││││CTTAAGTTTG3′5′3′5′5′3′5′3′3′5′5′TTG│││3′反向引物PCRSSOP││││││││││CTTAAGTTTG扩增的HLAⅡ复合体片段基因分型法

3第2步：转膜第3步：杂交NC膜荧光寡核苷酸探针(19~24bp)荧光素GAATTCAAAC││││││││││││││││││││CTTAAGTTTGGAATTCAAAC││││││││││NC膜GAATTCAAAC││││││││││NC膜PCRSSOP基因分型法

3(polymerasechainreaction-sequencespecificprimer,PCR-SSP)根据各型别HLA核苷酸碱基序列差异，设计出一套HLA等位基因的序列特异性引物，对待测DNA进行PCR扩增，因TaqDNA聚合酶没有3′→5′核酸内切酶活性，引物3′端最后一个碱基是否与模板配对决定着能否扩增出产物。若将引物的3′端最后一个碱基设计在正好有差异的那个碱基序列上，则扩增产物仅需常规琼脂糖电泳，根据特异产物存在与否即可直接对HLA进行分型。（3）序列特异性引物聚合酶链反应HLA-DRB1

AllelePrimersequence5ˊendPrimersequence3ˊend0101TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAATCTGCACTGTGAAGCTCTCAG1501TCCTGTGGCAGCCTAAGAGCCGCGCCTGCTCCAGGAT1601TCCTGTGGCAGCCTAAGAGAGGTGTCCACCGCGGCG0301TACTTCCATAACCAGGAGGAGATGCAGTAGTTGTCCACCCG0405GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACACTGCACTGTGAAGCTCTCAC1101GTTTCTTGGAGTACTCTACGTCCTGGCTGTTCCAGTACTCCT1202AGTACTCTACGGGTGAGTGTTCACTGTGAAGCTCTCCACAG1301TACTTCCATAACCAGGAGGAGACCCGCTCGTCTTCCAGGAT1401GTTTCTTGGAGTACTCTACGTCTCTGCAATAGGTGTCCACCT0706CCTGTGGCAGGGTAAGTATACCCGTAGTTGTGTCTGCACAC0803AGTACTCTACGGGTGAGTGTTCTGCAGTAGGTCTCCACCAGHLA-DRB1等位基因序列特异性引物(SSP)基因分型法

3││││││││││││││││││││││CACCGTGAATTCAAACTACTGCGTGGCACTTAAGTTTGATGACG││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││CACCGTGAATTCAAACTACTGCGTGGCACTTAAGTTTGATGACG││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││││CACCGTGAATTCAAACTACTGCGTGGCACTTAAGTTTGATGACG││││││││││││││││││││││GAATTCAAAC│││││││││││││GAA待检HLA复合体基因分型法

33′5′94℃变性55℃退火72℃延伸第1步：PCR正向引物3′5′扩增的HLA复合体片段目的基因││││││││││CTTAAGTTTG3′5′3′5′5′3′5′3′3′5′5′TTG│││3′反向引物PCRSSP基因分型法

3第2步：电泳PCRSSPGAATTCAAAC││││││││││扩增的HLA复合体片段││││││││││CTTAAGTTTG根据是否存在特异性产物电泳带直接对HLA复合体分型基因分型法

3(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)用PCR扩增特定的靶序列，经变性使之成为两条单链，然后在无变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。单链DNA如果存在碱基差异，即使一个碱基的不同，也会表现出电泳迁移率的不同，据此可将不同型别的HLA区分开，达到分型的目的（4）聚合酶链反应单链构象特异性扩增的HLA复合体片段单链││││││││││CTTAAGTTTG││││││││││││││││││││CACCGTGAATTCAAACTACTGTGGCACTTAAGTTTGATGA││││││││││││││││││││用PCR扩增待检HLA复合体基因分型法

3与HLA基因库的DNA已知序列进行比较获得HLA的基因型别

（5）基于序列的HLA分型法首先用PCR扩增HLA的DNA片段，扩增片段进行纯化和测序，将此序列与HLA基因库的DNA已知序列进行比较，即可获得HLA的基因型别,SBT是目前最可靠也最彻底的基因分型方法，它不仅能进行序列识别和分型，更有助于发现新的基因型(sequencebasedtyping,SBT)目的基因基因分型法

3TTGTGGCAGC生物素标记的引物AACAB（6）多荧光微珠免疫分析待检HLA-APCR扩增AACACCGTCGBPCR扩增的片段磁珠探针TTGTGGCAGCAACACCGTCGBTTGTGGCAGC亲和素F用标记有生物素的引物分别扩增HLA-A、B、DR等基因座位的特异性片段，扩增的片段分别与已知不同颜色种类的磁珠探针进行杂交，洗脱没有结合的DNA片段，再与荧光素标记的亲和素结合，形成多荧光微珠，流式细胞仪即不同颜色种类的磁珠探针，又识别标记的荧光，若扩增的DNA片段能与探针结合则发出荧光，不结合则不发荧光ATGGGGAAGC流式细胞仪TACGBTACGCCGTCGBATGCGGCAGCT

ACGCCGTCGBATGCGGCAGC亲和素F亲和素F亲和素F荧光微珠基因芯片123456781234567列行64探针57探针基因分型法3

（7）基因芯片首先用PCR扩增获得HLA的DNA片段，用放射性核素或荧光素标记，再与预先点在固相支持物表面成千上万个代表不同基因的寡核苷酸探针进行杂交，通过放射自显影或荧光检测，杂交结果通过计算机软件处理分析后获得杂交信号强度及分布模式图，从而反映样品中HLA基因型别PCR扩增标记荧光素PCR扩增片段1．限制性内切酶用于下列哪种HLA分型法A．PCR-RFLPB．PCR-SSOPC．PCR-SSPD．PCR-SSCPE．SBT2．目前最可靠也最彻底的基因分型方法A．限制性片段长度多态性分析(RFLP)B．聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交(PCR-SSOP)C．序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)D．聚合酶链反应单链构象特异性(PCR-SSCP)E．基于序列的HLA分型法(SBT)习题(二）红细胞血型抗原诱导超急性排斥反应导致移植物被切除移植前检测供者与受者血型是否相符至少也要符合输血原则不符措施

ABO血型配型1ABO血型配型(三）交叉配型交叉配型概念

1淋巴细胞交叉配型流式细胞术交叉配型自身交叉配型概念方法供者淋巴细胞+受者血清和供者血清+受者淋巴细胞补体依赖细胞毒试验(CDC)交叉配型方法

2

外周血淋巴细胞交叉配型T淋巴细胞交叉配型(只要是阳性，即为禁忌证)B淋巴细胞交叉配型>10%→受者体内有抗供者抗体→另选供者<10%→供受者相配供者淋巴细胞+受者血清(含补体)供者淋巴细胞破坏（1）淋巴细胞交叉配型类型例如检测受者血清中有无抗供者淋巴细胞抗体供者淋巴细胞+受者血清荧光素标记抗人IgG/IgM优点比CDC灵敏100倍，检测时间更短可同时检测淋巴细胞亚型，分辨受者体内IgG和IgM抗体+流式细胞仪检测供者淋巴细胞发荧光受者血清含有抗供者淋巴细胞抗体交叉配型方法

2（2）流式细胞术交叉配型若受者体内有自身抗体存在，在与供者进行交叉配型时易出现假阳性结果因此可用受者自身细胞+血清进行CDC试验根据自身交叉配型结果判断供受者交叉配型的准确性但自身抗体阳性并不作为移植的禁忌交叉配型方法

2（3）自身交叉配型习题1．淋巴细胞交叉配型的主要目的是A．检测供者血清中有无抗受者淋巴细胞抗体B．检测供者HLA抗原C．检测受者血清中有无抗供者淋巴细胞抗体D．检测受者HLA抗原E．以上均是2．HLA交叉配型中，不论抗体是针对Ⅰ类还是Ⅱ类HLA，只要细胞毒性超过下述哪项，说明受者体内已存在

细胞毒性抗体，应另选供者A．10%B．20%C．30%D．40%E．50%3．自身交叉配型主要用于A．判断受供体组织相容性B．判断淋巴细胞交叉配型等结果有无假阳性C．检测受体是否存在抗供体的抗体D．检测供者有无针对受者组织的抗体E．

以上均是Part3避免移植排斥反应的免疫学检验及意义HLA抗原配型

1多数情况→供受者HLA-A、B、DR配型最重要骨髓移植→供受者HLA必须完全相符肾脏移植→DR配型最重要，其次为HLA-B、A肝脏移植→用高效免疫抑制剂时，HLA配型意义不大其他组织相容性抗原配型

2次要组织相容性抗原(mHA)型别鉴定

包括：供体性别选择、其他次要组织相容性抗原分型宜尽可能选择同性别供者一般临床输血的ABO选配原则也适用于移植在分子水平对次要组织相容性抗原进行分型

对选择骨髓植供体具有肯定性意义新的组织配型策略

3研究发现，构成同种异体移植排斥反应的靶分子的氨基酸残基配型最为关键，其由数量较少的HLA亚型决定，有可能成为组织器官移植配型新的生物学标志。组织配型的前提条件是应该有足够容量的器官库，目前除了骨髓库外，尚缺少类似的器官库，常常需要根据移植物来选择受者。组织配型是一个重要的选择条件，在此条件下很难做到最优选择，所以什么是次优选择也是研究的问题。受者体内抗HLA抗体筛选

4（1）CDC试验

将受者血清与一组已知HLA的无关淋巴细胞混合，受者血清中若有抗HLA抗体，此抗体可与淋巴细胞表面的HLA抗原结合，激活补体，淋巴细胞膜受损，计算死细胞百分率，由此判断受者体内是否有抗HLA抗体。（2）酶联免疫吸附试验将已知HLA特异性抗原包被酶标板，加人受者血清孵育一段时间后，加人酶标记抗人IgG/IgM单克隆抗体，再加入酶作用的底物显色，根据颜色的深浅，可测定出受者体内抗HLA抗体的特异性和滴度。该法是目前临床常用方法。（3）流式细胞术将纯化的人HLA分子包被在不同的磁性微球上，加人受者血清孵育后，再加人荧光素标记抗人IgG，然后在流式细胞仪上分析受者体内存在的HLA抗体及其滴度。习题1．肾脏移植最重要的配型是A．HLA-DRB．HLA-BC．HLA-AD．HLA-CE．其次为HLA-DQ2．骨髓移植最重要的配型是

A．HLA-DRB．HLA-BC．HLA-AD．HLA-CE．供受者HLA必须完全相符Part4移植后的免疫监测免疫细胞生物学活性的监测

1免疫荧光法流式细胞仪法受者PBMCCD4+TCD8+T＞1.20排斥1～5d后将发生＜1.08感染1～5d后将发生免疫荧光法流式细胞仪法受者PBMCCD30CD693H-TdRCO2培养4h受者PBMCT细胞刺激指数↑→急性排斥（1）T细胞亚群及功能检测数量检测功能检测预测排斥反应的早期发生计数200个细胞，根据着色的细胞数，计算供者淋巴细胞的死亡率，供者淋巴细胞的死亡率，反映受者NK细胞的活性NK细胞活性↑→出现排斥反应免疫细胞生物学活性的监测

1（2）NK细胞活性检测形态法灭活的供者淋巴细胞受者NK细胞Eu3+受者NK细胞时间分辨荧光免疫检测Eu3+Eu3+Eu3+离心弃上清液检测剩余供者淋巴细胞荧光Eu3+Eu3+Eu3+Eu3+Eu3+Eu3+Eu3+免疫细胞生物学活性的监测

1荧光标记剩余法NK细胞活性↑→出现排斥反应Eu3+标记灭活供者淋巴细胞特异性体液免疫的监测

2抗供者HLA抗体抗供者组织细胞抗体抗血管内皮细胞抗体B细胞细胞毒抗体冷凝集素交叉配型补体依赖细胞毒性试验检测方法（1）血清抗体的检测体液免疫水平的监测

2检测方法

含量检测→免疫扩散、免疫比浊活性检测→CH50试验血清中总补体血清单个补体（2）血清补体的检测细胞因子的检测

3排斥时血清肌酐IL-1、IL-1RIL-2、IL-2RIL-4、IL-6IFN-γ急性排斥反应发生有诊断意义：血清肌酐↑+IL-2R↑习题1．急性移植排斥反应临床症状出现前1～5天可见A．CD4+↑B．CD8+↑C．CD4+/CD8+<1.08D．CD4+/CD8+>1.2E．CD4+/CD8+=12．对急性排斥反应的发生有诊断意义的是:A．血清肌酐与IL-2R↑B．血清肌酐与IL-2↑C．IL-2与IL-2R↑D．IL-2与TNF↑E．IL-2与CSF↑Part5移植的结局与对策免疫抑制剂的使用

1传统免疫抑制剂硫唑嘌呤、环磷酰胺、肾上腺糖皮质激素全面抑制机体免疫功能、易继发严重免疫缺陷症→毒性强新型免疫抑制剂环孢素A(cyclosporin，CsA)、他克莫司(tacrolimus，FK-506)

麦考酚吗乙酯(mycophenolatemofetil，MMF)、西罗莫司(sir