CN119452092A 在生物反应器中生产氨基酸的方法 （阿克恩有限公司）

2024.12.23PCT/EP2023/0670802023.06.23WO2023/247742EN2023.12.28本发明提供了一种在生物反应器中通过发液中的产甲烷微生物，该方法至少包括以下步向生物反应器供给包括二氧化碳和/或一氧化碳24.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述部分包5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中供给至所述生物反应器的全部碳源选至少90％或甚至更优选至少95％、特别是至少99％或甚至至少99.9％以二氧化碳气体3述硫源包含半胱氨酸和/或硫化物，尤其所述发酵液包括浓度为0.001～150mg/L、优0.01～100mg/L、尤其是1～80mg/L的硫化物和/或所述硫化物供给速率或半胱氨酸供给速4[0001]本发明的领域涉及在生物反应器中利用产甲烷微生物进行发酵而生产氨基酸的产蛋白质的氨基酸的生物合成是生物技术的一个重要分支(Becker和Wittmann2012)。然而，古菌(archaea)在氨基酸生产方面的代谢潜力迄今为止一直被大大忽视(Pfeifer等，[0003]众所周知，产甲烷古菌能生成甲烷(CH4)作为其能量代谢的终产物(例见Mand&涉及在有土卫二的羽流中检测到的抑制剂存在时生长的冲绳甲烷嗜热球菌(Methanothermococcusokinawensis)的膜脂组成和氨基酸排泄模式。这些发现对于了解[0005]进一步的与生物技术无关的，Kengen&Stams1994的研究涉及作为嗜热火球菌(Pyrococcusfuriosus)在碳水化合物发酵过程中的还原终产物的L一丙氨酸的形基中在H2CO2气氛下生长。[0006]同样与生物技术无关，Porat等2004讨论了海沼甲烷球菌中芳香族氨基酸的生物[0008]同样与生物技术无关，Fardeau等1987涉及热自养甲烷杆菌和热石养甲烷嗜热球5[0011]多项研究讨论了产甲烷古菌在可再生能源生产中的应用，即用H2将CO2还原为CH4基酸及其构型对厌氧消化过程中甲烷产量和中间代谢物的生物转化的影响。WO2012/110256A1公开了一种通过产甲烷微生物将二氧化碳和氢气转化为甲烷的方法。WO2014/[0012]WO2017/070726A1涉及一种确定微生物培养物(例如氢营养型产甲烷微生物的[0013]Hoffarth等2019关注N2对马尔堡甲烷嗜热杆菌在连续搅拌反应罐中进行的生物和/或其他无机碳源经化学合成的固定成为有机化合物并生成额外的有用产品。所述微生生物(优选选自γ解蛋白菌(proteobacteria)、棒状的杆菌或属于脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、芽孢杆菌属(bacillus)的细菌或糖酵母属(Saccharomyces)的酵[0017]WO2016/179545A1和US2018/0163240A1公开了用于生物学生产蛋氨酸的组合[0018]US2019/0194630A1和US2017/0130211A1涉及用于在氢营养微生物中进行氨6量和/或克服本领域已知的氨基酸生产方法的[0027]农业和人工含氮肥料的生产是温室气体排放的间接来源，它们通过氨(NH3)的硝可能存在于发酵液的液体级分(fraction)中)然后优选被进一步纯化，例如通过本领域已780％、特别是至少90％或甚至至少95％的产甲烷微生物在收获之前和收获期间保持活力和/或完整(intact)。这尤其适用于从生物反应器中抽出的液体流中存在的产甲烷微生物尔N2可产生16摩尔ATP，这是最昂贵的代谢过程之一(Thamdrup2012；HuandRibbe2012)。某些古菌门以及细菌能够固定N2(Fernandez等2019)。这种生物过程称为固氮究了古菌巴氏甲烷八叠球菌227中的固氮和固氮酶活性。这些文献完全没有提到氨基酸的[0037]当氮源包括氮气时，特定的铵浓度范围已被证实对于能量生成特别有利(在N2固定条件下)。因此，优选发酵液中的铵浓度为0.1mmol/L～200mmol/L，优选2mmol/L~100mmol/L，更优选4mmol/L～40mmol/L，甚至更优选5mmol/L～35mmol/L，还更优选为前)。然而，优选铵浓度在上述任意范围内(例如0.1mmol/L～200mmol/L或10mmol/L~[0040]根据进一步优选的实施方案，从生物反应器中收获甲烷(由产甲烷微生物生成8少15种，甚至更优选至少17种或甚至至少18种，尤其是所有20种典型(canonical)氨基酸[0043]根据另一优选实施方案，每体积发酵液(的上清液)的氨基酸总生成速率为至少[0044]根据另一优选实施方案，单位生物质(perbiomass)的氨基酸总生成速率为至少[0045]所用的产甲烷微生物可以是天然的(例如天然分离物或由此获得的实验室菌株)CRISPR的基因编辑和其他基于CRISPR的遗传工具也可供本领域技术人员使用，参见例如Nayak&Metcalf2017和Dhamad&Lessner20(Methanomicrobiales)、甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)、甲烷火求菌目(Methanomassiliicoccales)和甲烷嗜碱古菌目(Methanonatronarchaeales)中任一的古热球菌(Methanocaldococcaceae)和甲烷球菌科(Methanococcaceae)；特别是选自甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter)、甲烷嗜热球菌(Methanothermococcus)、和甲烷球菌(Methanococcus)。特别优选的是马尔堡甲烷嗜热杆菌(Methanothermobactermarburgensis)、詹氏甲烷热球菌(Methanocaldococcusjannaschii)、火热甲烷球菌(Methanococcusigneus)和绒毛甲烷热球菌(Methanocaldococcusvillosus)。其他合适甲烷杆菌(Methanobacteriumdefluvii)，西班牙甲烷杆菌(Methanobacteriumespanolae)，甲酸甲烷杆菌(Methanobacteriumformicicum)，伊氏甲烷杆菌9烷杆菌(Methanobacteriumthermaggregans)，乌利金甲烷杆菌(Methanobacteriumuliginosum)，耐酸甲烷短杆菌(Methanobrevibacteracididurans)，嗜树木甲烷短杆菌(Methanobrevibacterarboriphilicus)，哥氏甲烷短杆菌(Methanobrevibactergottschalkii)，Methanobrevibacterolleyae，瘤胃甲烷短杆菌(Methanobrevibacterruminantium)，史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibactersmithii)，伍氏甲烷短杆菌胞菌(Methanocellapaludicola)，热自养甲烷嗜热杆菌(Methanotheftaobacter热甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacterthermophilus)，沃菲甲烷嗜热杆菌利亚甲烷粒菌(Methanocorpusculumbavaricum)，小甲烷粒菌(Methanocorpusculum海洋产甲烷菌(Methanogeniummarinum)，布拉提甲烷微球菌(Methanomicrococcusblatticola)，内共生甲烷盘菌(Methanoplanusendosymbiosus)，浅沼甲烷盘菌菌(Methanoregulaboonei)，联合甲烷鬃菌(Methanosaetaconcilii)，竹节甲烷鬃菌甲烷八叠球菌(Methanosarcinabarkeri)，马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)，嗜热甲烷八叠球菌(Methanosarcinathermophila)，运动甲烷微菌(Methanomicrobiummobile)，艾氏甲烷球菌(Methanococcusaeolicus)，海沼甲烷球菌(Methannococcusmaripaludis)，万尼氏甲烷球菌(Methanococcusvannielii)，伏氏甲烷球菌(Methanococcusvoltae)，热石养甲烷嗜热球菌(Methanothermococcus菌(Methanothermobacterthermautotrophicum)，沸腾甲烷热球菌(Methanocaldococcusfervens)，印度甲烷热球菌(Methanocaldococcusindicus)，地狱甲烷热球菌[0047]适用于本发明的其他古菌菌种或菌株参见例如：Leigh2000；Fardeu等1987；选至少80％、甚至更优选至少90％或甚至更优选至少95％、尤其是至少99％或甚至至少[0057]无关地，当缬氨酸被发现掺入了重组大肠杆菌发酵工艺生产的蛋白基生物药中[0059]Kisumi等1976讨论了肠道细菌粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中非_产蛋[0060]US2006/0057685A1涉及一种利用已失活全部乙酰羟基酸合酶的肠杆菌科细菌[0063]根据另一优选实施方案，每h_1[0064]根据另一优选实施方案，单位生物质的正缬氨酸生产速率为至少0.01μmolg_1h[0067]_在使得产甲烷微生物产生氨基酸的条件下，向所述生物反应器供给包括二氧化[0069]实施方案2.实施方案1的方法，其中的[0070]实施方案3.实施方案1或2的方法，其中发酵液中的铵浓度保持在0.1mmol/L~[0071]实施方案4.根据实施方案1～3中任一项的方法，其中发酵液中的铵浓度为0.1mmol/L～200mmol/L，优选2mmol/L～100mmol/L，更优选4～40mmol/L，甚至更优选5mmol/L～35mmol/L，还更优选6mmol/L～30mmol/L，尤其是7mmol/L～25mmol/L，或甚至[0073]实施方案6.根据实施方案1～5中任一项的方法，其中发酵液基本上不含正钨酸[0079]实施方案12.根据实施方案10或11的方[0081]实施方案14.根据实施方案13所述烷微生物与液体流分离并将产甲烷微生物再循环返回到生物反应器；优选地其中至少更优选至少5μmolg_1h_1，还更优选至少10μmolg_1h_1，尤其是至少50μmolg_1h_1或甚至至少地0.01～100mg/L，尤其是1～80mg/L的硫化物和/或其中硫化物进料速率或半胱氨酸进料[0114]实施方案47.根据实施方案1～46中任一项的方法，其中所述生物反应器是搅拌[0115]实施方案48.根据实施方案1～47中任一项的方法，其中所述生物反应器是恒化尤其是至少7mmol/L或甚至至少10mmo[0119]实施方案52.产甲烷微生物用于生[0121]实施方案54.实施方案52或53的用[0122]实施方案55.实施方案52～54中任一项的用途，其[0124]实施方案57.实施方案52～56中任一项~37中任一项所定义。[0128]实施方案61.实施方案58～60中任一项的发酵[0129]实施方案62.实施方案58～61中任一项[0137]我们的研究旨在查证不同产甲烷菌与H2/CO2利用关[0139]简而言之，马尔堡甲烷嗜热杆菌在N2/H2/CO2气氛中生长在具有不同浓度氯化铵N2固定[0144]绒毛甲烷热球菌和冲绳甲烷嗜热球菌的预培养物是在根据Taubner&Rittmann2O2(OchsLaborbedarf，Bovenden，德国)封闭。在厌氧手套箱(CoyLaboratoryProducts，NaHCO3溶液和Na2S·9H2O。为确保条件为厌氧，通过抽真空和用相应的气体(H2/CO2或H2//CO2(80％/20％)、H2/CO2/N2中NH4+浓度最高，被额外检查了NH4+的量减少至原始培养基浓度的十分之一是否会影响生[0156]每次孵育后，将血清瓶在室温放置45分钟以冷却。压力用数字压力计(KellerGmbH，Winterthur,瑞士)测量。生长通过OD(λ=578nm，用Milli_Q水作空白)(Beckman实验的细胞沉淀和上清液均储存在_20℃无菌Eppendorf管中直至进一步分析。N2体积的MM培养基包括100μlL_1消泡剂(StruktolSB2023，SchillundSeilacher，德国汉与封闭分批实验相同。氧化还原电位和pH值通过各自氧化还原探针和pH探针(Mettler25小时后采集气体样本。1)下进行的培养基中含和不含Na2CO3剂和120μL氧化溶液添加到标准品和样品中，马上混合。避光30分钟后，用96孔板[0164]为了氨基酸分析，样品上清液(如上所述获得)用Mill_Q水以1：4稀释。测量在进样器和四元泵。将1mL样品与75μL硼酸盐缓冲液(0.4N水溶液，pH＝10.2；AgilentTechnologies)混合，然后加入5μLOPA试剂(3_巯基丙酸在0.4molL_1硼酸盐缓冲液中，ECLIPSEAAA保护柱(4.6x150mm，5μm粒径，AgilentTechnologies)的ZorbaxECLIPSE品一级混合物(AAS18，SigmaAldrich)。AAS18标准品混合物缺少五种氨基酸(天冬酰胺位于信噪“铵峰”内，因此在高NH4+浓度的实验中很难测量。此法细节见前文(Taubner等温(25℃)进行。2分子吸收率(NUR/mmolL_1h_1)是通过将孵育前和孵育后N2的偏差(ΔN2)除以液体培[0169]定量的/特定的氮吸收(qN2/mmolh_1g_1)是通过将NUR除以生物质浓度(x/gL_1)(MER/mmolL_1h_1)、碳平衡(C_balance)马尔堡甲烷嗜热杆菌被选出进行进一步的实验。已在含有和不含有碳酸氢盐(Na2CO3)的特[0176]马尔堡甲烷嗜热杆菌的封闭分批实验用相对于2.1gL_1原始培养基组成的0％、5％、7.5％、10％和100％NH4+进行，以7：1：1的H2/CO2/N2通气。为了降低NH4+留滞中有Na2CO3时OD578高出2.2倍。该效果也见于封闭分批实验。NH4+浓度10％显示停滞[0182]N2固定期间的NH4+吸收在封闭分批实验和补料分批实验中很明显。对比[0183]最高NUR是在7.5％和100％封闭分批实验中40小时后算出的分别为0.91或Cl封闭分批实验中的NUR[mmolL_1h_1]和qN2[0187]在封闭分批(图3)和补料分批(图4)实验中研究了马尔堡甲烷嗜热杆菌的氨基酸[0194]实施例2：连续培养的马尔堡甲烷嗜热杆菌的氨基酸生成和主动分泌成功建立了[0199]培养在65℃进行，搅拌速度为100～1200rpm(DASGIPparallelbioreactorsystem，EppendorfAG，Hamburg，Germany)和100～1500rpm(BiostatC+，Sartorius：1)用作马尔堡甲烷嗜热杆菌的底物。CO2气体流通过MX4/4装置(EppendorfAG，制。各轮之间也有波动，例如375～1500。作为硫源，供应0.5mol/LNa2S，例如0.2mL/h~[0202]重要的是，体积计量的氨基酸生成速率和氨基酸比生成速率分别为约25～约75μ于詹氏甲烷热球菌、火热甲烷球菌和绒毛甲烷热球菌(体积计量的Nva生成速率超出1.0μ[0212]培养在65℃进行，搅拌速度为375～1500rpm(DASGIPparallelbioreactorsystem，EppendorfAG，Hamburg，Germany)和375～1500rpm(BiostatC+，Sartorius：1)用作马尔堡甲烷嗜热杆菌的底物。CO2气体流通过MX4/4装置(EppendorfAG，[0214]马尔堡甲烷嗜热杆菌在厌氧条件下进行了超过100个不同轮次的连续培养。一个_1_1。每分钟每体积液体的气体体积(vvm)在各轮之间也有波动，例如0.125~[0215]重要的是，体积计量的氨基酸生成速率和氨基酸比生成速率分别为约5～约250μmolL_1h_1和约10～约150μmolh_观察到了Nva和Nle的生成，这在产甲烷古菌中从未观察到过(更不用说在甲烷杆菌目中的培养，向培养基中添加30g/LNaCl)和在各种铵浓度进行孵育。虽然在这些条件下例如physiologicaleffectofheavymetalsandVolatilefattyacidson[0222]AbdelAzim，Annalisa，ChristianPruckner，PhilippKolar，RuthSophie[0223]BeckerJandWittmannc.Systemsandsyntheticmetabolicengineeringforaminoacidproduction_theheartbeatofindustrialstraindevelopment.Curr[0224]BelayN，SparlingRandDanielsL.1984.″DinitrogenFixationbya[0225]Bellack，Annett，HaraldHuber，ReinhardRachel，GerhardWanner，andArchaeonThatAdherestoSurfacesandFormsCell_CellContacts.″[0226]Bernacchi，Sébastien，etal.″Experimentalmethodsforscreeningparametersinfluencingthegrowthtoproductyield(Y(x/CH4))ofabiologicalmethaneproduction(BMP)processperformedwithMethanothermobacteraminoacidsnorleucineandnorvalineinbiopharmaceutical_relatedfermentationprocessesbyanewultra_highperformanceliquidchromatographyMethanogens：TransposonInsertionMutagenesisofaMethanococcusMaripaludis[0229]Blotevogel，KarlHeinzandUlrichFischer.1985.″IsolationandCharacterizationofaNewThermophilicandAutotrophicMethaneProducing[0231]Dhamad，AhmedE.，andDanielJ.LessnearchaeaanditsusetoexaminegenefunctionduringnitrogenfixationbyMethanosarcinaacetivorans.″Appliedandenvironmentalmicrobiology86.21[0232]Dridi，Bédis，etal.″Tungsten_enhancedgrowthofMethanosphaeraMethanobacteriumthermoautotrophicumandMethanococcusthermolithotrophicuson131.[0234]FernandezL，BertilssonS，PeuraS2019Non_cyanobacterialdiazotrophsdominatenitrogen_fixingcommunitiesinpermafrostthawponds，andOceanography.onbiologicalmethanationinaContinuousstirred_tankreactorwith[0236]HuYandRibbeMW.2012.″NitrogenaseAssembly.″Biochimicaet1406.MethanococcusMaripaludisSp.Nov.，aNewMethanogenIsolatedfromSaltMarshSediment.Vol.135.ColorimetricDeterminationofAmmoniumSoilCareViewProjectBiodiversity[0240]Kengen，ServéWM，andAlfonsJMStams.″FormationofL_alanineasareducedendproductincarbohydratefermentationbythehyperthermophilicphylogenyandthemolybdenumdependenceofnitrogenfixationinMethanccoccus[0243]KurthJM，OpdenCampHJM，WelteCU，2020.Severalwaysonegoal_methanogenesisfromunconventionalsubstrates.ApplMicrobiolBiotechnol104，6839_6854.[0244]Leigh，JohnA.2000.″NitrogenFixationInMethanogens：TheArchaeal[0245]Liu，Hui，etal.″EffectsofdifferentaminoacidsandtheirConfigurationsonmethaneyieldandbiotransformationofintermediatemetabolitesduringanaerobicdigestion.″JournalofEnvironmentalManagementactivityinthearchaebacteriumMethanosarcinabarkeri227.″Appliedand[0248]Mand，ThomasD.，andWilliamW.Metcalf.″Energyconservationandhydrogenasefunctioninmethanogenicarchaea，inparticularthegenus19.Rittmann，S.K._M.R.，2018.Physiologyandmethaneproductivityof[0252]MurrayPAandZinderSH.1984.″NitrogenFixationbyaMethanogenicthemethanogenicarchaeonMethanosarcinaacetivorans.″ProceedingsofthePaulik，C.，2019.Developmentofasimultaneousbioreactorsystemforcharacterizationofgasproductionkineticsofmethanogenicarchaeaathigh[0256]Polis，Baruh，etal.″L_Norvaline，anewtherapeuticagentagainstinthearchaeonMethanococcusmaripaludis.″Journalofbacteriology186.15[0259]Rinke，Christian，etal.″AstandardizedarchaealtaxonomyforthemediadilutionrateeffectsonMethanothermobactermarburgensisgrownin[0261]Rittmann，S.K._M.R.，2015.ACriticalAssessmentofMicrobiologicalBiogastoBiomethaneUpgradingSystems.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.151，117_135.multivariatestatis