CN119452241A 用于在流式细胞仪中确定样品中粒子的绝对计数的方法及其系统 （贝克顿·迪金森公司）

2025.01.06PCT/US2023/0231362023.05.22WO2023/244414EN2023.12.21用于在流式细胞仪中确定样品中粒子的绝本公开的各方面包括用于在流式细胞仪中施方案的方法包括将气泡引入到传播具有粒子所述光电检测器检测所述流动流中所述气泡的引入到所述流动流中时生成的数据信号和响应式细胞仪所述样品管线被配置成将气泡引入22.根据权利要求1所述的方法，其中将所述气泡引入到所述流动流中包括从所述样品3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法包括当从所述样品源缩回所述样品管线4.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法包括在从所述样品源缩回所述样品管线5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法在将所述气泡引入到所述流动流中之前，响应于从被照射及10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中基于检测来自所述被照射的气泡的响应于在当所述气泡被引入到所述流动流中时和当检测到所述气泡时之间从被照射与所述样品的来源和所述流动池流体连通的样3光检测系统，所述光检测系统包括用于检测来自所述被照射的流处理器，所述处理器包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其14.一种非暂时性计算机可读存储介质，其包括存储在其上的用于在流式细胞仪中计4据某些实施方案的方法包括将气泡引入到传播具有粒子的样品的流动流（flowstream）5从被照射的粒子检测到的光而生成的数据信号和预定的体积来计算样品中粒子的绝对计述光检测系统具有用于检测来自被照射的流动流的光的光电检测器。在一些实施方案中，6流动流中气泡上游的被照射的粒子的光，以及在气泡通过查询场时检测来自流动流的光。检测系统被配置成由从样品中被照射的粒子检测到的散射光生成数据信号。在某些实例流动流中时和当检测到气泡时之间从被照射的粒子检测到的光而生成的数据信号和预定信号强度图至少包括从当气泡被引入到流动流中时的时间直到当检测到气泡时的时间收[0013]本公开的各方面还包括用于在流式细胞仪中计算样品中粒子的绝对计数的非暂以及响应于检测到的气泡而生成的数据信号来确定样品中粒子的绝回样品管线以在流动流中产生空气间隙来将气泡引入到流动流中的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于操作从样品源缩回样品管线的样品管线移位部件7游的被照射的粒子的光的算法、以及用于在气泡通过查询场时检测来自流动流的光的算响应于从流动流中气泡下游的被照射的粒子检测到的光来生成数泡被引入到流动流中时和当检测到气泡时之间从被照射的粒子检测到的光而生成的数据引入到流动流中时的时间直到当检测到气泡时的时间收集的来自被照射的粒子的数据信[0020]图3描绘了根据某些实施方案的由从被照射的粒子和流动流中引入的气泡检测到8现的上下文中提供具体引用的数字的基本上当以以叙述的事件的顺序或逻辑上可能的任何其它[0035]如上所述，本公开提供了用于在流式细胞仪中确定样品中粒子的绝对计数的方9[0039]在实践主题方法时，将气泡引入到传播具有粒子的样品的流式细胞仪的流动流检测器和光源可以邻近样品管线的端部或者在样品管线的端部的下游。在一些实施方案[0050]在一些实施方案中，光源输出特定波长，诸如200nm至1500nm，诸如250nm至来自样品的发射光穿过一个或多个准直器以减少光束[0053]在某些实施方案中，方法包括用两束或更多束频移光（frequencyshifted品激光器可以具有从200nm到1500nm微秒至25微秒并且包括5微秒至10微秒的范围内的持续时间。在其中用两个或更多激光器[0056]由射频驱动信号产生的角度偏转的激光束各自具有基于所施加的射频驱动信号MHz至约60MHz并且包括约5MHz至约50MH加的射频驱动信号和输出激光束的期望的照射轮廓，角度偏转的激光束可以被分开0.001是任何方便的光检测协议，包括但不限于光电传感器或光电检测器，诸如有源像素传感器[0065]图1描绘了根据某些实施方案将气泡引入到样品管线中并检测流动流中的气泡。在初始状态101，具有预定的体积的校准的样品管线101a被插入到包含具有粒子的样品组时空气间隙的气泡已经被引入到流动流中。在气泡流动状态104期间，在预定的时间段之的数据信号中的时间间隙来确定气泡存在于流中检测光并且在一个或多个光电检测器通道中生成数据信号持续0.0001秒或更长时间，如在将气泡引入到流动流中之前持续0.0001秒或更长时间，诸如持续0.0005秒或更长时间内，诸如在10分钟或更长时间内连续地检测来自引入的气泡上游的被照射的粒子的光，并且包括在15分钟或更长时间内连续地检测来自引入的气泡上游的被照射的在5分钟或更长时间内，诸如在10分钟或更长时间内连续地检测来自引入的气泡下游的被泡，诸如其中在一个或多个光散射光电检测器通道，诸如2个或更多光散射光电检测器通实施方案中，荧光强度数据信号相对于时间的曲线包括所生成的数据信号中的时间间隙，光电检测器通道中生成的数据信号的缺失与在光散射光电检测器通道中针对流动流中被流中检测到气泡时生成的数据信号以及响应于从在当气泡被引入到流动流中时的时间和到流动流中时的时间和当检测到气泡时的时间之间被照射的粒子的样品管线的确定的体[0075]图2描绘了根据某些实施方案的用于确定流动流中样品的绝对计数的流程图。在检测器的光检测系统来检测来自由光源照射的流动流的光（例如，来自样品中粒子的荧度图上绘制从照射流动流中的粒子生成的数据信号以及当气泡被引入到流动流中并被光检测系统检测时生成的数据信号。在其它实例中，在步骤206使用数据信号202a、203a和302可以基于当从样品源缩回样品管线时生成的电子数据信号。检测到气泡的时间由数据中，样品管线移位部件被配置成将样品管线从样品的来源缩回0.00001mm或更多，诸如号施加到声光器件以生成两个或更多角度偏转的激光束。在这些实施方案中，激光器可以二镱激光器或铈掺杂的激光器及其组合。被配置成施加具有诸如从约0.001V至约500V，诸如从约0.005V至约400V，诸如从约约60MHz并且包括约5MHz至约50括存储器可以包括产生具有相同强度的100个或更多角度偏转的激光束的指令。在其它实生输出激光束，所述输出激光束沿着水平轴线从输出激光束的边缘到中心具有增加的强的输出激光束的边缘处的角度偏转的激光束的强度的约10%至约50%。在其它实施方案中，的边缘处的角度偏转的激光束的强度可以在沿着水平轴线的输出激光束的中心处的角度指令使得处理器产生具有沿着水平轴线的顶帽强度概况的输块，如在美国专利号9,423,353；9,784,661和10,006,852以及美国专利公开号2017/统的第一组线性可变滤光器的合适的自由空间光中继系统包括但不限于诸如在美国专利何时被引入到流动流中的光电检测器和光源可以邻近样品管线的端部或者在样品管线的储器包括用于将光学数据信号传送到处理器以用于计算样品的粒子引入到流动流中之前在一个或多个光电检测器通道中由从被照射的流动流检测到的光生成数据信号持续0.0001秒或更长时间的指令，诸如持续0.0005秒或更长时间，诸如持续用于在将气泡引入到流动流中之前由从被照射的流动流检测到的光生成数据信号持续60其中存储器包括用于响应于来自气泡上游的粒子的光在15分钟或更长时间内生成数据信之前检测来自被照射的流动流的光持续60秒或更长或更长时间内连续地检测来自引入的气泡上游的被照射的粒子钟或更长时间内连续地检测来自引入的气泡下游的被照射的粒子的光储器包括用于在该时间段期间对粒子的数量进行计数并将该计数除以预定的体积的指令，定在当气泡被引入到流动流中时的时间和当检测到气泡时的时间之间包含被照射的粒子中时的时间和当检测到气泡时之间包含被照射的粒子的样品管线的确定的体积来计算绝动池包括限定纵向轴线的近端圆柱形部分和终止于具有横向于纵向轴线的孔口的平坦表至8mm的范围内。截头圆锥形内室的近端部分的直径可以在1mm至10mm，诸如2mm至9[0126]在一些实施方案中，流动池还包括被配置成向流动池提供鞘液的鞘液注射端L/min至50μL/min的范围内。在某些实施方案中，流动流的流动速率为5μL/min至6μL/术系统，所述流式细胞术系统包括光电二极管和放大器部件作为光检测系统的一部分，用于检测由流动流中的样品发出的光。合适的流式细胞术系统可以包括但不限于在Ormerod大学出版社（OxfordUniv.Press）(19期，胡玛纳出版社（HumanaPress）(1997)；《实用流式细胞术（PracticalFlow些实例中，感兴趣的流式细胞术系统包括BDBiosciencesFACSCantoTM流式细胞仪、BD细胞仪、BDBiosciencesLSRFort20流式细胞仪、BDBiosciencesFACSPrestoTM式细胞仪和BDBiosciencesFACSCaliburTM细胞分选器、BDBiosciencesFACSCountTM细BDBiosciencesInflux™细胞分选器、BDBiosciencesJazz™细胞分选器、BDBiosciencesAria™细胞分选器、BDBiosciencesFACSAria™II细胞分选器、BD主题系统包括具有偏转板的粒子分选模块，诸如在2017年3月28日提交的美国专利公开号[0132]在某些实例中，本发明的流式细胞术系统被配置成用于通过使用射频标记发射的公开内容通过引用并入本文。系统。图4A中所示的粒子分析系统401可以被配置成全部或部分地执行诸如本文所述的方样品路径通过一个或多个检测站时从每个粒子收集信号。检测站408通常是指公共样品路[0136]粒子分析系统401还可以包括控制系统306。控制系统406可以包括一个或多个处理器、振幅控制电路和/或频率控制电路。所示出的控制系统可以在操作上与流体学系统集的数据点的数量来生成第一时间间隔的至少一部分的计算的信号频率。控制系统406可制系统406可以另外将实验信号频率与计算的信号频率或预定的信号频率455b和荧光收集透镜440中的一者或多者被路由到前向散射检测器430、侧向散射检测器435和一个或多个荧光检测器460a_460f中的[0143]前向散射检测器430被定位成稍微偏离穿过流动池的直接光束的轴线，并且被配射检测器检测到的光的强度取决于粒子的整体尺寸。前向散射检测器可以包括光电二极向于随着结构的粒子复杂性的增加而增加。可以由一个或多个荧光检测器460a_460f来检测来自与粒子相关联的荧光分子的荧光发射。侧向散射检测器435和荧光检测器可以包括制器/处理器490中的一些或全部可以与细胞仪410无线或有线通信。控制器/处理器490结合存储器495和I/O497可以被配置成执行与流式细胞仪实验的准备和分析相关的各种功[0146]图4B中所例示的系统包括六个不同的检测器，这些检测器检测如由从流动池425到每个检测器的光束路径中的滤波器和/或分束器的配置所定义的六个不同波长带（对于物的一些发射光谱也将与一个或多个其它检测器的滤波器窗口重叠。这可以被称为溢出验具有一组荧光标记物和具有多个标志物的多个细胞群体，每个细胞群体具有多个标志物的子集。I/O497还可以被配置成接收将一个或多个标志物分配给一个或多个细胞群体的细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据诸如标记物光谱特性和流式细胞仪配置数据也可以存储在存储器495中。控制器/处理器490可以被配置成评估标记物到标志物的一个或多个分配。[0147]图5示出了用于分析和显示生物事件的粒子分析仪控制系统（诸如分析控制器件数据可以经由数据通信通道被提供给分析控粒子分析仪或分选系统502接收的生物事件数据可以包括流式细胞术事件数据。分析控制器500可以被配置成向显示设备506提供包括生物事件数据的第一绘图的图形显示。例如，分析控制器500可以进一步被配置成将感兴趣的区域呈现为由显示设备506显示的生物事[0150]分析控制器500可以进一步被配置成在门内的显示设备50门内的生物事件数据的颜色与门外的生物事件数据的颜色不同。显示设备506可以被实现[0152]触发事件可以导致分析控制器500改变显示数据的方式、数据的哪些部分实际显基于由分析控制器500接收的生物事件数据[0154]分析控制器500可以连接到存储设备504。存储设备504可以被配置成接收和存储制器500的流式细胞术事件数据。存储设备504可以进一步被配置成允许通过分析控制器物事件数据的绘图和概述绘图的部分的门。显示设备506可以进一步被配置成根据从分析[0156]在一些实施方式中，分析控制器500可以生成用户界面以接收用于分选的示例性652和654以将粒子沿着第一路径662朝向容器674引导或沿着第二路径668朝向容器678引被引入到流动流中时生成的数据信号以及响应于检测到的气泡而生成的数据信号来确定泡时之间从被照射的粒子检测到的光而生成的数据信号和预定的体积来计算样品中粒子计算机控制逻辑）通常被存储在系统存储器和/或与存储器存储设备结合使用的程序存储如使用诸如802.11或Bluetooth®RF协议或IrDA红外协议的通用标准。服务器设备可以是如台式计算机、电器等。在一些实施方案中，服务器设备具有显示器，诸如液晶显示器[0178]在一些实施方案中，通信接口被配置成使用上述通信协议和/或机制中的一者或[0179]输出控制器可以包括用于向用户呈现信息的各种已知显示设备中的任何一种的其它形式的数据。数据可以包括互联网URL地址，使得用户可以从远程源检索另外的SQL、同一位置，或者它们可以在物理上分开。可能取决于所选择的计算机平台的类型和/或构造，可以在任何计算机平台上采用各种操作系统。合适的操作系统包括Windows、iOS、[0180]图7描绘了根据某些实施方案的示例性计算设备700的总体架构。图7中描绘的计算设备700的总体架构包括计算机硬件和软件部件的布置。计算设备700可以包括比图7中示器750提供输出信息。输入/输出设备接口740还可以接受来自任选的输入设备760的输[0181]存储器770可以包含计算机程序指令（在一些实施方案中被分组为模块或部件本公开的各方面进一步包括具有用于实践主题方法的指令的非暂时性计算机可非易失性存储卡、ROM、DVD_ROM、蓝光盘、固态盘和附网存储器（networkattached气泡而生成的数据信号来确定样品中粒子的绝对回样品管线以在流动流中产生空气间隙来将气泡引入到流动流中的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于操作从样品源缩回样品管线的样品管线移位部件游的被照射的粒子的光的算法、以及用于在气泡通过查询场时检测来自流动流的光的算响应于从流动流中气泡下游的被照射的粒子检测到的光来生成数泡被引入到流动流中时和当检测到气泡时之间从被照射的粒子检测到的光而生成的数据[0187]非暂时性计算机可读存储介质可以在具有显示器和操作者输入设备的一个或多响应于从所述流动流中所述气泡上游的被照射的粒子检测到的光来生成数据信述气泡下游的被照射的粒子检测到的光来生成在将所述气泡引入到所述流动流中之前连续地检测来自被照响应于在当所述气泡被引入到所述流动流中时和当检测到所述气泡时之间从被移位部件被配置成从所述样品源缩回所述样品管线并将空气间隙引入到所[0218]28．根据条款26至27中任一项所述的系统，其中所述光源被配置成用波长为200响应于从所述流动流中所述气泡上游的被照射的粒子检测到的光来生成数据信流动流中所述气泡下游的被照射的