CN119462893A 一种高活性重组xvii型胶原蛋白及其快速制备方法与应用 （山东丰金美业科技有限公司）

一种高活性重组XVII型胶原蛋白及其快速本发明涉及一种高活性重组XVII型胶原蛋或药物的原材料。并且通过3个不同载体将高活性重组XVII型胶原蛋白基因整合到酵母菌基因23.一种重组表达载体，其特征在于，在表达载体中插入了权利要求2所述高活性重组4.如权利要求3所述重组表达载体，其特征在于，所述表达载体6.如权利要求3所述重组细胞，其特征在于，所述宿主细胞为蛋白酶缺陷型毕赤酵母7.权利要求1所述高活性重组XVII型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括步骤如(1)将如SEQIDNO.2所示的高活性重组XVII型胶原蛋白编码基因分别连接到表达载(2)将步骤(1)所得重组载体pPIC9K_COL17A1_P，pPICZαA_COL17A1_P和pGAPCαA_10.权利要求1所述高活性重组XVII型胶原蛋白、权利要求7所述制备方法制备获得的3一种高活性重组XVII型胶原蛋白及其快速制备[0004]中国专利文献CN117756926A公开了一种重组XVII型胶原蛋白Pro.C17及其制备方[0015](1)将如SEQIDNO.2所示的高活性重组XVII型胶原蛋白编码基因分别连接到表4[0016](2)将步骤(1)所得重组载体pPIC9K_COL17A1_P，pPICZαA_COL17A1_P和pGAPCαA_[0020]以pNZ8148质粒为模板，以Cm_F/R为引物，通过PCR扩增获得氯霉素抗性基因片5[0041]图1为毕赤酵母SMD1[0047]图6为本发明高活性重组XVII型胶原蛋白COL17A1_P促进细胞增殖活性的验证结[0048]图7为本发明高活性重组XVII型胶原蛋白COL17A1_P促进细胞黏附活性的验证结[0051]本发明中使用的蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1163为普通市售菌种，在Invitrogen[0056]GSPGPKGDMGSPGPKG[0057]KGERGAAGEPGPHGPPGVPG[0058]MGPPGPKGGPPGPPGPPG6[0062]委托华大基因科技公司按照SEQIDNO重组XVII型胶原蛋白COL17A1_P进行基因片段(COL17A1_P)的人工合成。然后用EcoRI和酶切后基因COL17A1_P分别与两个酶切后表达载体连接，构建得到重组载体pPIC9K_同源重组的方式将扩增的氯霉素抗性基因片段连接到双酶切后的pGAPZαA载体上，得到ACAAGGTGAGGAACTAAACCATGAACTTTAATAAAATTGATTTAGACTGACATAACTAATTACATGATATCTAAAAACCTTCTTCT4DNA连接酶将酶切后基因COL17A1_P与酶切后表达载体pGAPCαA连接，构建得到重组载体[0072]将实施例1所述重组载体pPIC9K_COL17A1_P用SalI酶切，酶切质粒回收后电转蛋白酶缺陷型毕赤酵母SMD1163感受态细胞，接着涂布于MD固体培养基，在30℃下倒置培养4d，长出的单菌落分别转移到含有1mg/mL或4mg/mLG418的YPD固体培养基进行筛选，将4mg/mLG418的YPD固体培养基上长出的单菌落接种到50mLYPD液体培养基中，30℃、[0076]取1mL单质粒重组毕赤酵母SMD1163_K_COL17A1_P的菌液加入至50mL新鲜的YPD液7母SMD1163_K_COL17A1_P感受态细胞，接着涂布于含有100μg/mL博来霉素的YPDZ固体培养到双质粒重组毕赤酵母SMD1163_KZ_COL17A1[0080]按照步骤2所得方法制备双质粒重组毕赤酵母SMD1163_KZ_COL17A1_P感受态细转双质粒重组毕赤酵母SMD1163_KZ_COL17A1_P感受态细胞，接着涂布含有25μg/mL氯霉素75g/h速率流加50％(w/V)甘油(含12mL/LPTM1)，期间控制溶氧＞25待菌体湿重达到P，而重组毕赤酵母SMD1163_K_COL17A1_P上清液(单质粒)、重组菌株SMD1163_KZG_重组XVII型胶原蛋白COL17A1_重组XVII型胶原蛋白COL17A1_P的产量为13g/L。这说明本发明通过3个不同载体将高活性8原蛋白COL17A1_P的冻干海绵和蛋白电泳[0095]以人永生化角质形成细胞HaCaT为研究对象，首先收集指数生长期的人永生化角发明重组XVII型胶原蛋白COL17A1_P促进HaCaT细胞增殖活性优于对照组BSA和市售重组[0099]由图7可知，本发明重组XVII型胶原蛋白COL17A1_P的细胞黏附活性均优于BSA和市售重组XVII型胶原蛋白，说明其能在短时间内帮助细胞贴壁或黏附于细胞外基质之上，9[0101]使用实施例4所制备重组XVII型胶原蛋白COL17A1_P浓缩液(A组)、市售重组XVII管理局批准的一种周围血管舒张药，局部使用时可刺激男性型脱发和斑秃患者的毛发生长度均在5～40cm之间，有脱发多和头发轻度稀疏困扰，且按60次梳发法脱发计数大于10