CN119464102A 猫血清白蛋白重组蛋白及其在汉逊酵母中的表达方法 （中国科学院天津工业生物技术研究所）

所猫血清白蛋白重组蛋白及其在汉逊酵母中本发明公开一种高效生产猫血清白蛋白的酵母(Hansenulapolymorpha)中整合猫血清白组成型启动子和蔗糖诱导型启动子单独或组合2所述的猫血清白蛋白是SEQIDNo.1所示的氨基酸序列或与其具有85%以上同源性的氨基酸序列。4.如权利要求3所述的重组汉逊酵母，其特征在于，优化后的核苷酸序列如SEQID至少91至少92至少93至少94至少95至少96至少97至少98至少9.如权利要求7或8所述的表达方法，其3初始流加速率为10ml/h，每小时取样，蔗糖电极测定浓度(随溶氧变化调节蔗糖流加速4研究团队申请的专利KR102435211B1中使用水稻悬浮细胞成功表达猫的血清白蛋白，专利CN111118018B成功在毕赤酵母中表达猫血清白蛋白。中国人民解放军军事科学院军事医[0007]本发明所要解决的技术问题是为了解决现有技术中重组猫血清白蛋白的表达量[0008]本发明提供一种可表达猫血清白蛋白或可表达包含猫血清白蛋白的融合蛋白的5[0011]本发明中的白蛋白选自猫科的白蛋白，所述的猫血清白蛋白(felineserumalbumin，FSA)重组蛋白包含如下氨基酸序列或与其具有85％以上同源性的氨基酸序列：[0012]按照汉逊酵母的密码子使用频率进行密码子优化，优化后的序列具体如SEQID与SEQIDNo.2具有至少85％(例如，至少85至少90至少91至少92至少93至少94至少95至少96至少97至少98至少99或至少100％序列同一性的核拷贝的白蛋白表达元件在汉逊酵母中的表达，包括(PGAP_FSA_TAOX1)2、(PGAP_FSA_TAOX1)3、[0015]优选地，猫血清白蛋白表达量较高的表达元件为(PMAL_FSA_TAOX1)2、(PMAL_FSA_疫原性；是最耐热的酵母，最高生长温度可以达到50℃,因此可以降低工业发酵的冷6启动子PPMA1和甲醇诱导型启动子PMOX的重组汉逊酵母。针对不同拷贝数和启动子组合的优GAP启动子的多拷贝重组菌表达量与PGAP单拷贝数重组菌的表达量基本相同，但蔗糖诱导的PMAL启动子的血清白蛋白多拷贝重组菌S_(Mal_FSA)2和S_(Mal_FSA)3表达量明显(Gap_FSA)2和S_Gap_FSA_(Mal_FSA)2的猫血清白蛋白的表达量明显高于仅使用PGAP启动子[0022]本发明中含蔗糖诱导型启动子PMAL的重组猫血清白蛋白酵母细胞株S_(Mal_FSA)2组成型启动子组合的三拷贝数的重组汉逊酵母：达的猫血清白蛋白在规模化生产上更具有安全性32223。用使用频率最高或较高的密码子；b)避免对基因转录或蛋白翻译有潜在影响的负调控元7公司)为模板，设计载体骨架引物BB_F:TCGAATAATAACTGTTATTTTTCAGTGTTC和BB_R:GTTT使用表1中所述的引物PGAP_F、PGAP_RPCR扩增酵[0035]在上述构建获得的载体pWSJ01_PGAP_FSA_TAOX1基础上，进一步更换不同类型的启动子步骤如下：使用引物pWSJ_FSA_R:ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC和pWSJ_FSA_F:混合，50℃连接1_2h，分别将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，使用验证引物test_F:CATGACATTAACCTATAAAAATAGGCG和test_R:TCTTTTCTCGAGAGATACCCCTTC进行PCR验证并测89[0048]将传至10次的重组汉逊酵母表达菌株接入5ml不含Zeocin抗性的YPD液体培养基[0051]挑取诱导型表达的重组汉逊酵母(S_Mox_FSA和S_Mal_FSA)单菌落，S_Mal_FSA在在汉逊酵母基因组上的拷贝数和不同强度启动子之间的[0057]使用限制性内切酶Bgl聂单酶切实施例1中构建完成的质粒载体pWSJ01_PGAP_FSA_2中的引物GAP_2_F、GAP_2_RPCR扩增实施例2中已构建完成的可插入基因组的猫白蛋白表达元件(包括PGAP_FSA_TAOX1)，将PCR上酶切完成的载体中，插入方法同实施例2_无缝克隆，测序验证构建成功的载体命名为MAL_FSA_TAOX1)2。[0060]使用限制性内切酶Bgl聂单酶切载体pWSJ05_(PGAP_FSA_TAOX1)2，猫白蛋白表达元件F_PGAP_FSA；将扩增获得的目的片段无缝克隆的构建方法插入到酶切后猫白蛋白表达元件F_PMAL_FSA，将扩增获得的目的片段无缝克隆的构建方法插入到酶切后[0065]将上述构建完成的载体pWSJ05_(PGAP_FSA_TAOX1)2、pWSJ06_(PMAL_FSA_TAOX1)2、pWSJ07_(PGAP_FSA_TAOX1)3、pWSJ08_(PMAL_FSA_TAOX1)3、pWSJ09_PGAP_FSA_TAOX1_(PMAL_FSA_[0066]最后按照实施例3中的培养条件将以上多拷贝的菌株和单拷贝的菌株进行摇瓶发贝重组菌表达量与单拷贝数重组菌的表达量基本相同，但PMAL启动子诱导的猫血清白蛋白组菌表达的猫血清白蛋白明显高于仅使用PGAP启动子的重组菌。在摇瓶中表达相对较好的[0071]将摇瓶发酵中产量较高的重组菌株S_(Mal_FSA)2、S_(Mal_FSA)3和S_Gap_FSA_[0