CN119464277A 一种火龙果病毒gav2全长序列扩增方法、检测方法及应用 （海南省农业科学院三亚研究院(海南省实验动物研究中心)）

科技城用友产业园一号楼4楼496—9号本发明涉及一种火龙果病毒GAV2全长序列了扩增全长序列引物和基于RPA_Cas12a的检测2CTATTGGGTCATCAGTTTGTACACAGTTG_3'；TCAGGGGGCGGCGTCA_3'；TTATTCAGGGCCCGGTAGAAACTGA_3'。S4、用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，将符合预3.一种检测火龙果病毒GAV2的序列组合，其特征在所述序列组合还包括ssDNA探针序列，所述ssDNA探针序列是用于可视化荧光检测的火龙果病毒GAV2的ssDNA探针序列为ssDNA_FQ，具体序列为：FAM_CCGGAAAAAAAAAAAACCGG_BHQ1；用于试纸条检测的火龙果病毒GAV2的ssDNA探针序列为4.权利要求3所述的一种检测火龙果病毒GAV2的序列组合在制备火龙果病毒GAV2的检5.一种检测火龙果病毒GAV2的方法，其特征在于，所述火龙2O补齐3℃下反应30min，得到反应产物RPA_Cas12a_FQ；所述ssDNA_FQ的序列为FAM_7.根据权利要求6所述的一种检测火龙果病毒GAV2的方法，其特征在于，将反应产物述试纸条检测的反应产物为RPA_Cas12a_FB，获得方法如下：将0.3ulCas12a、1.25ul9.根据权利要求8所述的一种检测火龙果病毒GAV2的方法，其特征在于，将反应产物RPA_Cas12a_FB用Tiosbio的Cas12/13专用核酸检测试纸条进行检测，若试纸条质控线C线4大红、紫龙、金都和长龙等火龙果品种上进行取样，从火龙果中分离出一种火龙果病毒GAV2。本发明技术人员发现，火龙果病毒GAV2的部分基因组序列与Genbank登录号：员针对火龙果病毒GAV2的特性，设计了扩增全长序列引物和基于RPA_Cas12a的检测引物，[0006]本发明的目的是提供一种火龙果病毒GAV2全长序列扩增方法、检测方法及应用，5本发明第一方面提供了克隆火龙果病毒GAV2全长基因组序列的引物，包括以下3CTATTGGGTCATCAGTTTGTACACAGTTG_3'；引物对2包括，正向引物：5'_ATGCCTTCTGGAACAAGCTCG_3'，反向引物：5'_TCAGGGGGCGGCGTCA_3'；TTATTCAGGGCCCGGTAGAAACTGA_3'。物进行回收纯化，分别与pTOPO载体连接，连接产物转化大肠杆菌GV3101，将大肠杆菌的火龙果病毒GAV2的ssDNA探针序列或用于试纸条检测的火龙果病毒GAV2的ssDNA探针序列，用于可视化荧光检测的火龙果病毒GAV2的ssDNA探针序列为ssDNA_FQ，具体序列为：[0010]本发明第四方面提供了所述的一种检测火龙果病毒GAV2的序列组合在制备火龙62O补齐至20μL，混匀，在37℃下反应30min，得到反应产物RPA_Cas12a_FQ；所述ssDNA_FQ的序列为FAM_CCGGAAAAAAAAAAAACCGG本发明针对火龙果病毒GAV2的特性，设计了检测引物和扩增全长基因组序列引性，Cas12a不参与对火龙果基因组DNA及其他病毒的大量脱靶切割，能有效降低假阳性干7[0022]图2为不同浓度病毒RNA的试纸条效果：从左到右的浓度依次为55.3ng/μL、[0029]设计的三对引物扩增片段相互重叠，覆盖了火龙果病毒GA[0031]反转录使用TAKARA公司PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒89火龙果病毒GAV2部分基因组序列与Genbank登录号为：MW897280.1的Guangxi术人员对Guangxialphaflexivirus2病毒基因组了解有限，病毒全长的详细信息尚未完利用新型火龙果病毒GAV2(SEQIDNO：4所示)的RT_RPA引物对序列上游引物F和2O补齐所述荧光检测的反应产物为RPA_Cas12a_FQ，获得方法如下：将0.3ulCas12a、2O补齐至将反应产物RPA_Cas12a_FB用Tiosbio的Cas12/13专用核酸检测试纸条进行检测，将553ng/μL的RNA模板进行10倍梯度稀释，利用实施例3的方法测试火龙果病毒将553ng/μL的RNA模板进行10倍梯度稀释，利用实施例3的方法测试火龙果病