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DB13/T2595---2017DB13/T2595—2017葡萄霜霉病菌保存技术规程2017-12-22实施2017-12-22实施IDB13/T2595—2017DB13/T2595—2017葡萄霜霉病菌保存技术规程水琼脂平板WaterAgarPlate葡萄霜霉病菌只能在活体寄主上存活，在离体培养基上不能生长繁殖和保存，致使相关的研究受到限制。要保持对该病菌持续的研究并排除其它杂菌的干扰，需对葡萄霜霉病菌进行保存，且保持病菌的致病力，并提高其存活率和稳定性。本规程针对不同的用途，分别对葡萄霜霉病菌进行了超低温保存，主要用于病菌的长期保存；真空冷冻干燥保存，主要用于病菌复壮；葡萄试管苗叶片保存，主要用于病菌纯化，以保证病菌生物学和遗传学等研究结果的准确性。4.1.2霜霉病样的预处理工2DB13/T2595—2017用灭菌的棉签将新长出霉层上的孢子囊刷至无菌水中，用单层擦镜纸过滤，去除孢囊梗，得到干取4.1.3中获得的孢子囊悬浮液10mL,加入等量的10%的二甲基亚砜(DMSO),配制成含5%二甲基亚砜的孢子囊悬浮液。将配好的孢子囊悬浮液分装于规格为2.0mL的冻存管中，置于-80℃的超低温冰箱中保存。待需要霜霉病菌时，取出冻存管，室温融化后，在2000rpm下离心15min,弃上清，加入无菌水混匀并再次离心，用于清洗孢子囊，去除二甲基亚砜，共离心3次。用无菌水调节浓度后接种于干净健康的葡萄叶片背面繁殖使用。压力为13.0Pa下真空冷冻干燥36h,直至材料恒重。4.2.2真空封装将真空冷冻干燥后的病叶碎片取出，分装进规格为20cm×30cm的铝箔袋，并用真空封口机进行压缩封口处理，每袋30片；4.2.3保存时效4.3.1培养基的配制4.3.1.2葡萄培养基的配制DB13/T2595—20173将配制好的培养基倒入100mL三角瓶内，每瓶40mL,把分装培养基后的三角瓶置于高压灭菌锅内121℃下灭菌20min～30min,待用。取未木质化或半木质化的新鲜葡萄枝条，去除叶片，剪成3cm～4cm长的带腋芽的小段，用流水冲洗5min;在超净工作台上，将洗净的茎段用70%的酒精浸泡30s,再用0.1%升汞浸泡5min～10min,最将消毒后的茎段放在无菌滤纸的培养皿中，剪去茎段上下两端褐化的部分，形态学上端平剪，下20℃、12h黑暗)。待葡萄试管苗高度达到5cm以上，着生3～5片叶时，在超净工作台上，用灭菌后的剪刀剪取试管苗叶片，将剪下的叶片背面朝上放置于倒好的水琼脂平板上；取4.1.2中重新长出干净霜霉层的叶片，用蘸有无菌水的挑针轻轻挑取干净的霜霉病菌，将其接种按照4.3.3的方法取出试管苗叶片，背面朝上放置于水琼脂平板上，用

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