《食品仪器分析技术》全套教学课件（下）

项目五高效液相色谱法

及其在食品分析中的应用知识基础学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作学习情境二高效液相色谱法的实验技术学习情境三高效液相色谱法在食品分析中的应用知识拓展4.0基础知识液相色谱法与气相色谱法的基本概念与理论是一致的，如各种溶剂的分离原理、溶质在固定相上的保留规律、溶质在色谱柱中的峰形扩散过程等。但液相色谱的流动相为液体，其扩散系数、黏度、密度等与气体均有很大的差别，因此将对色谱分析过程产生影响。按分离机理可以将液相色谱分为五类：液固吸附色谱、液液分配色谱、键合相色谱、离子色谱、凝胶色谱等，这里主要介绍前三种。基础知识4.0基础知识4.0.1液固吸附色谱液固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是多孔的固体颗粒物质，如氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、氧化镁等，在它们的表面存在吸附中心，根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。液固吸附色谱固定相目前应用最广泛的是极性固定相硅胶，又分为全多孔型和表面多孔型硅胶微粒固定相。液固吸附色谱是以表面吸附性为依据的，所以它常用于分离极性不同的化合物，也能分离那些具有相同极性基团，但数量不同的样品。基础知识4.0基础知识4.0.2液液分配色谱液液分配色谱中，一个液相作为流动相，另一个液相（即固定液）则分散在很细的惰性载体（也叫担体）或硅胶上作为固定相，固定液与流动相互不相溶，它们之间有一个界面，固定液对于被分离组分是一种很好的溶剂。依据固定相和流动相的相对极性的不同，液液分配色谱可分为：液液正相分配色谱（固定相的极性大于流动相的极性）和液液反相分配色谱（固定相的极性小于流动相的极性）。液液分配色谱既能分离极性化合物，又能分离非极性化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、稠环、染料、甾体化合物等基础知识4.0基础知识4.0.3键合相色谱采用化学键合相的高效液相色谱法称为键合相色谱法。由于键合固定相非常稳定，在使用中不易流失，且键合到载体表面的官能团可以是各种极性的，因此，它适用于各种样品的分离分析。根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，键合相色谱分为正相键合相色谱和反相键合相色谱。反相键合相色谱在食品分析中的应用主要包括三个方面：第一，食品本身营养成分的分析；第二，食品添加剂的分析；第三，在食品加工、贮运、保存过程中由周围环境引起的污染物的分析。基础知识学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作4.1.1高效液相色谱仪的基本结构高效液相色谱仪由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等组成。4.1.1.1输液系统4.1.1高效液相色谱仪的基本结构输液系统的作用是向色谱柱提供压力高且流速稳定的流动相。输液系统包括贮液瓶、高压输液泵、溶剂混合和梯度控制装置等。1.贮液瓶溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或特种塑料（氟）制成，容量为0.5-2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。溶剂进入色谱系统之前必须进行过滤和脱气:学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作4.1.1.1输液系统4.1.1高效液相色谱仪的基本结构溶剂前处理-过滤过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作4.1.1.1输液系统4.1.1高效液相色谱仪的基本结构溶剂前处理-脱气脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。目前也采用超声脱气、真空脱气等方式。气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作4.1.1.1输液系统4.1.1高效液相色谱仪的基本结构2.高压输液泵高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。HPLC使用的高压泵应满足下列条件：a.流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1~10mL/min）；b.能抗溶剂腐蚀；c.有较高的输液压力；对一般分离，60×105Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150~300×105Pa。学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作4.1.1.1输液系统4.1.1高效液相色谱仪的基本结构3.溶剂混合和梯度控制装置洗脱装置主要用于控制分离过程中流动相的组分，一般采用等度洗脱和梯度洗脱两种。等度洗脱是在整个分离过程中，流动相的组成不变，柱效较低，分析时间较长。学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作4.1.1.1输液系统4.1.1高效液相色谱仪的基本结构3.溶剂混合和梯度控制装置梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作4.1.1.1输液系统4.1.1高效液相色谱仪的基本结构梯度洗提可以分为两种：a.低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作b.高压梯度(或称内梯度系统)：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.1输液系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作作用：将待分析样品准确送入色谱柱的装置。要求：密封性好、死体积小、重复性好，进样引起色谱分离系统的压力和流量波动要很小。常用的有：六通阀进样器和自动进样器两种。4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.2进样系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作分离系统是HPLC实现高效、快速分离的核心。组成：由连接管、色谱柱、预柱（选配）、色谱柱恒温装置（选配）等组成，其中色谱柱是色谱仪的心脏。要求：柱效能高、选择性好、分析速度快、性能稳定。4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.3分离系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作1.色谱柱色谱柱是内部抛光的不锈钢柱，一般长5～25cm，内径2～5mm。色谱柱内部填充各种微粒（粒径3～10μm）填料，又称固定相，是色谱柱的主体。固定相主要有硅胶、氧化铝、键合型硅胶等。2.保护柱保护柱，又称预柱，是在色谱柱的前端装有与分析柱相同固定相的短柱（5～30mm长），起到保护分析柱和延长分析柱寿命的作用。3.色谱柱恒温装置提高柱温有利于降低溶剂黏度和提高样品溶解度，改变分离度，也是保留值重复稳定的必要条件，特别是对需要高精度测定保留体积的样品分析时尤为重要。4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.3分离系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作检测系统即检测器：用于连续监测被色谱系统分离后的柱流出物的组成和含量变化的装置。作用：将柱流出物的组成和含量变化转化为可供检测的信号，完成定性和定量分析。分类：通用型检测器和选择型检测器。通用型检测器：可连续测量色谱柱流出物（包括流动相和样品组分）的全部特性变化，通常采用差分测量法。这类检测器包括示差折光检测器、电导检测器和蒸发激光散射检测器等。选择型检测器：用于测量被分离样品组分某种特性的变化，这类检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，而这一性质是流动相所不具备的，或至少在操作条件下不显示。这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、安培检测器等。4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.4检测系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作

1.紫外-可见光检测器（UV-Vis）特点：灵敏度高；线性范围宽；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感,可用于梯度洗脱；波长可选,易于操作。

缺点:对紫外光完全不吸收的试样不能检测；同时溶剂的选择受到限制。4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.4检测系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作2.光电二极管阵列检测器（DAD）紫外检测器的重要进展；阵列由1024个光电二极管阵列，各检测一窄段波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.4检测系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作3.荧光检测器（FD）

原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测。优点：灵敏度高，是最灵敏的检测器之一；选择性好；对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱。缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质。可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.4检测系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作4.示差折光检测器（DRI）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比。优点：通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；缺点：对温度变化敏感；对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测；属于中等灵敏度的检测器。偏转式、反射式和干涉型三种；4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.4检测系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作5.电化学检测器（ECD）常用电化学检测器包括：电导检测器和安培检测器。电导检测器：主要用于离子色谱法，检测原理是基于组分在某些介质中电离后电导值的变化来测定其含量。电导检测器对温度和流速敏感，不能用于梯度洗脱。安培检测器：用于测定能氧化还原的物质，灵敏度很高。其检测原理是组分通过电极表面时，当两电极间施加大于该组分的氧化（或还原）电位的恒定电压时，组分被电解而产生电流，服从法拉第定律，记录得色谱图，检测池相当于一个微型电解池。4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.4检测系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作6.蒸发激光散射检测器（ELSD）蒸发激光散射检测器是近年新出现的高灵敏度、通用型检测器。原理是：首先将柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测。4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.4检测系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作高效液相色谱法的分析结果现在广泛使用色谱数据处理机和色谱工作站来记录和处理。计算机的用途包括三个方面：①采集、处理和分析数据；②控制仪器；③色谱系统优化和专家系统。4.1.1高效液相色谱仪的基本结构4.1.1.5数据处理系统学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作1.准备所需的流动相，选用合适的微孔滤膜，抽滤，然后超声脱气10～20min；2.根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（注意方向）和定量环，或使用自动进样器。3.配制样品和标准溶液；4.检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。4.1.2高效液相色谱仪的基本操作4.1.2.1准备学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作1.开机：接通电源，待泵和检测器自检结束后，打开色谱工作站；2.排气：打开排液阀，排出管路中气泡，直至气泡排尽，关闭排液阀；3.参数设定：通过软件设置泵流量、各流动相比例、运行时间、检测波长等参数，设置完成后下载此方法至仪器；4.平衡系统：待达到设定参数值时，查看基线是否平稳，基线平稳则可进行进样测试；5.进样：点击单次运行，设置好数据文件信息和保存路径后，使用注射器将样品由手动进样口注入仪器，开始检测；6.数据处理：样品检测结束后，通过工作站的再解析分析数据；7.关机：所有样品检测完，冲洗柱子一段时间；结束后停泵，关闭软件，切断仪器电源。4.1.2高效液相色谱仪的基本操作4.1.2.2操作流程学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作1.贮液器及溶剂处理2.高压输液泵3.进样器4.色谱柱5.检测器4.1.3高效液相色谱仪日常维护与保养学习情境一高效液相色谱仪的认知与操作由甲醇提取的过氧化苯甲酰，用碘化钾作为还原剂将其还原为苯甲酸，用高效液相色谱分离，在230nm下检测。4.2.1典型实例——小麦粉中过氧化苯甲酰的测定4.2.1.1原理学习情境二高效液相色谱法的实验技术所用试剂均为分析纯试剂及以上，实验用水应符合GB/T6682规定的一级水要求。（1）甲醇：色谱纯；（2）碘化钾溶液：50%水溶液（质量浓度）；（3）苯甲酸：纯度≥99.9%，国家标准物质；（4）乙酸铵缓冲溶液（0.02mol/L）：称取乙酸铵1.54g用水溶解并稀释至1L，混匀，后用0.45μm的滤膜过滤后使用；（5）苯甲酸标准储备液（1mg/mL）：称取0.1g（精确至0.0001g）苯甲酸，用甲醇稀释至100mL4.2.1典型实例——小麦粉中过氧化苯甲酰的测定4.2.1.2试剂和材料学习情境二高效液相色谱法的实验技术（1）高效液相色谱仪：配有紫外检测器，C18反相色谱柱；（2）天平：感量0.0001g；（3）旋涡混合器；（4）溶剂过滤器。4.2.1典型实例——小麦粉中过氧化苯甲酰的测定4.2.1.3仪器设备学习情境二高效液相色谱法的实验技术（1）样品制备（2）标准曲线的制备（3）测定①色谱条件②样品测定4.2.1典型实例——小麦粉中过氧化苯甲酰的测定4.2.1.4分析步骤学习情境二高效液相色谱法的实验技术按式（6-1）计算样品中过氧化苯甲酰含量式中：D——样品中过氧化苯甲酰含量，g/kg；c——由工作曲线上查出的试样测定液中相当于苯甲酸的浓度，μg/mL；V——试样提取液的体积，mL；m——样品质量，g；0.992——由苯甲酸换算成过氧化苯甲酰的换算系数：242.2/（2×122.1）。结果保留两位有效数字。4.2.1典型实例——小麦粉中过氧化苯甲酰的测定4.2.1.5计算方法学习情境二高效液相色谱法的实验技术样品前处理的目的：①定量提取出欲测定的目标组分；②除去微粒；③减少干扰杂质，改善分离效果；④浓缩微量的组分；⑤提高检测的灵敏度及选择性；⑥有利于色谱柱及仪器的保护。4.2.2样品预处理学习情境二高效液相色谱法的实验技术在样品预处理时，还应注意以下几点：①处理后用于进样的样品应是一种均相溶液，它的溶剂强度要比流动相的起始强度低；②要尽可能避免待测组分的损失，一般预处理过程的回收率不应低于90%；③在清除原有干扰的过程中，不要带进新的干扰物质；④所用溶剂尽量做到无毒无害或低毒低害、价廉易得，衍生化试剂纯度要高，用量要适当，反应条件需严格掌握。具体的样品预处理方法应根据食品样品的种类、来源背景和待测项目要求，并参考相关文献资料而定。4.2.2样品预处理学习情境二高效液相色谱法的实验技术检测单一组分，理想的检测器应仅对所测成分响应，而其他任何成分均不出峰；检测目的是定性分析或是制备色谱，则最好用通用型检测器，以便能检测到混合物中的各种成分；检测目的是定量分析，检测器灵敏度越高、最低检出量越小越好；检测目的是制备分离，则检测器的灵敏度没必要很高。4.2.3检测器的选择学习情境二高效液相色谱法的实验技术4.2.4分离条件的选择学习情境二高效液相色谱法的实验技术4.2.5流动相选择学习情境二高效液相色谱法的实验技术1.黏度较小2.对样品有一定的溶解能力3.与检测器相匹配4.与色谱系统的适应性5.有足够的纯度6.有利于样品的回收7.应尽量避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证操作人员的安全。4.2.5.1流动相的基本要求4.2.5流动相选择学习情境二高效液相色谱法的实验技术采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。4.2.5.2流动相的pH4.2.5流动相选择学习情境二高效液相色谱法的实验技术在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加，通常采用烷烃加适量极性改性剂。反相色谱的流动相通常以水做基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性改性剂，如甲醇、乙腈等。一般情况下，甲醇-水系统能满足多数样品的分离要求，且黏度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。4.2.5.3流动相成分选择4.2.5流动相选择学习情境二高效液相色谱法的实验技术过滤：所有溶剂使用前都必须经0.45μm滤膜过滤，以除去杂质，色谱纯试剂也不例外。用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相滤膜和水相滤膜。脱气：所用流动相必须先脱气，否则容易产生气泡，影响泵的正常工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至导致无法检测。制备：用高纯度的试剂配制流动相。水应为新鲜制备的高纯水。贮存：流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。4.2.5.4流动相的过滤、脱气、制备、贮存4.2.5流动相选择学习情境二高效液相色谱法的实验技术卤代有机溶剂可能含有微量的酸性杂质，能与HPLC系统中的不锈钢反应。此外，卤代有机溶剂（如CH2Cl2）与一些反应性有机溶剂（如乙腈）混合静置时，还会产生结晶。总之，卤代有机溶剂最好新鲜配制使用。如果是和干燥的饱和烷烃混合，则不会产生类似问题。4.2.5.5卤代有机溶剂应特别注意的问题4.2.5流动相选择学习情境二高效液相色谱法的实验技术第一步，由强到弱。第二步，“三倍”规则。第三步，粗调转微调。4.2.5.6流动相选择步骤4.2.6定性和定量方法学习情境二高效液相色谱法的实验技术1.用已知标准样品定性如果在相同的色谱条件下被测化合物与标准样品的保留值一致，就可以初步认为被测化合物与标准样品相同。2.检测器的相对响应可以将两种检测器串联或分别使用，同一种化合物在两个检测器上的响应比，在相同的条件下应当是相同的。3.利用紫外检测器全波长扫描功能定性紫外检测器是高效液相色谱法中使用最广泛的一种检测器。全波长扫描紫外检测器可以根据被检测化合物的紫外光谱图得到一些有价值的定性信息4.2.6.1定性方法4.2.6定性和定量方法学习情境二高效液相色谱法的实验技术1.外标法外标法是用待测组分的纯物质配制标准系列浓度的溶液和待测试样同时做色谱分析来进行比较而定量的一种方法，可分为标准曲线法和直接比较法。2.内标法将已知量的参比物（称内标物）加到已知量的试样中，那么试样中参比物的浓度为已知。3.归一化法归一化法要求所有组分都能分离并有响应，其基本方法与气相色谱法中的归一化法类似。4.2.6.2定量方法4.3.1食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定学习情境三高效液相色谱法在食品分析中的应用1.原理不同样品经提取后，将提取液过滤，经反相高效液相色谱分离测定，根据保留时间定性，外标峰面积定量。2.试剂和材料3.仪器与设备4.分析步骤5.结果计算6.精密度4.3.2动物性食品中对乙酰氨基酚残留量的测定学习情境三高效液相色谱法在食品分析中的应用1.原理试料中残留的对乙酰氨基酚，用乙酸乙酯提取、HLB柱净化、甲醇洗脱、氮气吹干、流动相溶解、高效液相色谱测定、外标法定量。2.试剂和材料3.仪器与设备4.试料的制备与保存5.测定步骤6.结果计算7.检测方法的灵敏度、准确度、精密度4.4.1液相色谱的速率方程知识拓展高效液相色谱法的基本概念及理论基础，如保留值、分配系数、分配比、分离度、塔板理论、速率理论等与气相色谱法基本一致，其不同之处由流动相采用液体和气体的性质差异所引起。液这些差别对液相色谱的扩散和传质过程影响很大，Giddings等在范氏方程基础上提出了液相色谱速率方程，如下：式中，H为塔板高度；A为涡流扩散项（He）；B/u为分子扩散项（Hd）；Cu为传质阻力项，包括固定相传质阻力项（Hs），移动流动相传质阻力项（Hm）和滞留流动相传质阻力项（Hsm）。4.4.2影响速率方程的因素知识拓展其含义与气相色谱法的涡流扩散项相同。减小He可提高液相色谱柱的柱效能，可采用减小粒度和提高柱内填料装填均匀性的方式实现。目前多采用3～5μm的球形固定相，柱效能可达104塔板/m。涡流扩散引起的色谱峰形扩展如图4.4.2.1涡流扩散项4.4.2影响速率方程的因素知识拓展试样中组分在流动相带动下流经色谱柱时，由组分分子本身运动引起的纵向扩散导致色谱峰形扩展，又称纵向扩散，当流动相的线速度大于1cm/s时，分子扩散项对色谱峰形扩展的影响可以忽略，而气相色谱中此项却很重要。4.4.2.2分子扩散项4.4.2影响速率方程的因素知识拓展溶质分子从液体流动相转移进入固定相和从固定相移出重新进入液体流动相的过程，会引起色谱峰形的明显扩展。4.4.2.3固定相传质阻力项4.4.2影响速率方程的因素知识拓展当流动相流过色谱柱内的填充颗粒形成流路时，靠近填充颗粒的流动相流动得慢一些，而流路中部的流动相流动最快，即柱内流动相的流速并不是均匀的；靠近填充颗粒的组分，分子流速要比流路中部的组分分子流速慢，引起峰形扩展。4.4.2.4移动流动相传质阻力项4.4.2影响速率方程的因素知识拓展由于固定相填料的多孔性，微粒的小孔内所含的流动相处于停滞不动的状态。流动相中的组分分子要与固定相进行质量交换，必须先由流动相扩散到滞留区。有些分子在滞留区内扩散较短距离又回到流动相，而向小孔深处扩散的分子则在滞留区停留时间较长，由此引起的峰形扩展。4.4.2.5滞留流动相传质阻力项谢谢观赏！THANKS目标导航基础知识学习情境一质谱仪的认知与质谱法的应用学习情境二气相色谱-质谱联用仪的认知与应用学习情境三液相色谱-质谱联用仪的认知与应用1.掌握质谱法的特点和相关术语。2.掌握质谱仪的基本结构、工作原理及质谱法的应用。3.掌握色谱-质谱联用系统的特点和相关术语。4.掌握色谱-质谱联用仪的基本构造及各部件基本作用。5.了解色谱-质谱联用时要解决的重要问题、联用的接口及实验技术。4.了解色谱-质谱联用在食品检测中的应用。5.掌握色谱-质谱联用技术定性和定量分析的依据和基本方法。【知识目标】1.色谱-质谱联用技术中色谱和质谱各部分的作用。2

.色谱-质谱联用时要解决的重要问题、联用的接口及实验技术。3.质谱仪和色谱-质谱联用仪的基本构造及基本操作程序。4.色谱-质谱联用仪的日常维护与保养。5.色谱-质谱联用在食品检测中的应用。项目七质谱法及其在食品分析中的应用一、离子的主要类型在质谱中出现的离子有：分子离子、同位素离子、碎片离子等。1.分子离子分子丢失一个外层价电子而形成的带正电荷的离子，称为分子离子（常用M+·表示，也称为母体离子）。2.同位素离子组成有机化合物常见的十几种元素如C、H、O、N、S、C1、Br等（除F、P、I以外）都有同位素。由于以上元素（F、P、I除外）都有同位素，在质谱中会出现由不同质量的同位素形成的峰，称为同位素峰。同位素峰的强度比与同位素的丰度比是相当的。项目六质谱法及其在食品分析中的应用3.碎片离子碎片离子是由分子离子进一步产生键的断裂而形成的。由于键断裂位置不同，同一个分子离子可产生不同大小的碎片离子，而其相对量与键断裂的难易有关，即与分子结构有关。

项目六质谱法及其在食品分析中的应用（三）质谱的表示方法质谱的表示方法有三种：质谱图、质谱表和元素图。质谱图有两种：峰形图（7-1）和条图（7-2），目前大部分质谱都用条图表示。图7-1峰形图图7-2条图项目六质谱法及其在食品分析中的应用学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用一、质谱仪的基本结构质谱仪基本结构示意图质谱法是将样品离子化，变为气态离子混合物，并按质荷比分离的分析技术。质谱仪是实现上述分离分析技术,从而测定物质的质量与含量及其结构的仪器。质谱仪的种类繁多，一般均由五大部分组成，即进样系统、离子源、质量分析器、离子检测器和记录器组成。此外还包括真空系统和电气系统等辅助设备。学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用真空系统质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态，通常离子源的真空度应达1.3×10-4~1.3×10-5Pa。质量分析器中应达1.3×10-6Pa。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高，副反应增多，从而使谱图复杂化。

一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续运行以保持真空。学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用2.进样系统

若样品是气体或挥发性液体，可用如图7-5所示的进样系统，贮样器内的压力约为1Pa，比电离室内压力高1~2个数量级。因此，样品便从贮样器部分通过隔膜而扩散进人电离室。进样系统学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用3.离子源

离子源是样品分子的离子化场所，其作用是使试样中的原子、分子电离成离子。它的性能对质谱仪和分辨率等有很大的关系。常用的离子源有以下几种。（1）电子流轰击离子源（EI）在外电场作用下，用铼或钨丝产生的热电子流（8~100eV）去轰击样品，产生各种离子，这是最常用的一种方法。学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用化学电离源生成的（M+1）离子比较明显，（M+1）失去两个H，产生明显的（M-1）分子离子峰。此外，还有其他类型的离子源，如场致电离源（FI）、场解吸附离子源（FD）、快原子轰击离子源（FAB）等。其中FD特别适合于对一些难气化或热稳定性差的样品作定性鉴定和结构测定。（2）化学电离源（CI）它是将反应气体（如甲烷）预先电离，生成分子离子（CH+·），然后再与反应气体作用，生成高度活性的二级离子CH5+，CH5+再与样品进行离子—分子反应：学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用4.质量分析器

质量分析器是质谱计的重要组成部分，它的作用是将离子室产生的离子，按照质荷比的大小分开并排列成谱。（1）四极杆质量分析器（Q-MS）四极杆质量分析器示意图1—阴极；2—电子；3—离子；4—离子源；5—检测器四极杆质量分析器具有质量轻、体积小、操作方便、扫描速度快等特点，常用于色谱-质谱联用仪。学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用（2）离子阱质量分析器（IT-MS）离子阱结构示意图离子阱具有结构简单，易于操作，灵敏度高的特点。在有机质谱中已用于构成离子阱质谱仪与气相色谱仪的小型台式联用装置上。学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用5.离子检测器和记录器经过质量分析器出来的离子流只有10-9~10-10A，离子检测器的作用就是将这些强度非常小的离子流接受下来并放大，然后送到显示单元和计算机数据处理系统，得到所要分析的谱图和数据。

目前使用较多的是电子倍增器。学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用二、质谱法的应用质谱图可提供有关分子结构的许多信息，可以比较方便地测出未知分子的相对分子质量、化学式和结构式，因此。质谱分析的定性能力特别强。1、相对分子质量的测定从分子离子峰可以准确地测定该物质的相对分子质量，这是质谱解析的独特优点，它比经典的相对分子质量测定方法（如冰点下降法、沸点上升法、渗透压力测定等）迅速而准确，且所需试样量少（一般0.lmg）。由于在质谱中最高质荷比的离子峰不一定是分子离子峰，因此，测定未知物质相对分子质量的关键是分子离子峰的判断。

学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用（1）分子离子稳定性的一般规律分子离子的稳定性与分子结构有关。碳数较多，碳链较长（有例外）和有支链的分子，分裂概率较高，其分子离子的稳定性低；具有π键的芳香族化合物和共轭链烯，分子离子的稳定性高。分子离子稳定性的顺序为：芳香环>共扼链烯>脂环化合物>直链的烷烃类>硫醇>酮>胺>酯>醚>分支较多的烷烃类>醇。在判断分子离子峰时应注意以下一些问题。学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用（2）分子离子峰质量数的规律（氮律）由C、H、O组成的有机化合物，分子离子峰的质量一定是偶数。而由C、H、O、N组成的化合物，含奇数个N，分子离子峰的质量数是奇数；含偶数个N，分子离子峰的质量则是偶数。这一规律称为N律。凡不符合N律者，就不是分子离子峰。学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用（3）分子离子与邻近峰的质量差是否合理如有不合理的碎片峰，就不是分子离子峰。

例如分子离子不可能裂解出两个以上的氢原子和小于一个甲基的基团，故分子离子峰的左面，不可能出现比分子离子峰质量小3~14个质量单位的峰；若出现质量差15或18，这是由于裂解出·CH3或一分子水，因此这些质量差都是合理的。表7-2列出了从有机化合物易于裂解出的游离基（附有黑点的）和中性分子的质量差，这对判断质量差是否合理和解析裂解过程有重要参考价值。

学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用（4）M+1峰某些化合物（如醚、酯、胺、酞胺等）形成的分子离子不稳定，分子离子峰很小，甚至不出现；但M+1峰却相当大，这是由于分子离子在离子源中捕获一个H而形成的。（5）M-1峰有些化合物没有分子离子峰，但M-1峰却较大，醛就是一个典型的例子。因此在判断分子离子峰时，应注意形成M+1或M-1峰的可能性。学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用2、化学式的确定各元素具有一定的同位素天然丰度，因此不同的化学式，其（M+1）/M和（M+2）/M的百分比都有所不同。若以质谱法测定分子离子峰及分子离子的同位素峰（M+1，M+2）的相对强度，就能根据（M+1）/M和（M+2）/M的百分比来确定化学式。质谱法还可用于分子结构的鉴定、混合物的定量分析以及无机痕量分析。稳定同位素来“标记”各种化合物。用它作为示踪物，有时也可以用同位素的量，通过测定质谱中碎片离子和分子离子以此来确定化学反应中有关化合物的变化情况。学习情景一质谱仪的认知与质谱法的应用学习情景二气相色谱-质谱联用仪的认知与应用学生认知:

气相色谱法–质谱法联用，简称气质联用，英文缩写GC-MS，是一种结合气相色谱和质谱的特性，在试样中鉴别不同物质的方法。气相色谱（GC）具有极强的将复杂混合物中的各个组分分离开的能力，但它对未知化合物的定性能力较差，通常只是利用组分的保留特性来定性，这在欲定性的组分完全未知或无法获得组分的标准样品时，对组分定性分析就十分困难了；而质谱（MS）可以确定待测物的分子量、分子式，对未知化合物具有独特的鉴定能力，且灵敏度极高。但是，质谱只能对纯物质定性，对混合组分定性无能为力。基于上述原因，将气相色谱与质谱采用适宜的接口联接起来，诞生了气相色谱-质谱联用仪。一、气相色谱-质谱联用仪(一)气相色谱-质谱联用仪的分类按照仪器的机械尺寸，可以粗略地分为大型、中型、小型三类气质联用仪；按照仪器的性能，可以粗略地分为高档、中档、低档三类气质联用仪或研究级和常规检测级两类；按照质谱技术，可分为气相色谱-四极杆质谱、气相色谱-离子阱质谱、气相色谱-飞行时间质谱等；按照质谱仪的分辨率，可分为高分辨率（通常分辨率高于5000）、中分辨率（通常分辨率在1000和5000之间）、低分辨率（通常分辨率低于1000）气质联用仪。气相色谱-质谱联用色谱仪（如图为Agilent6890N-5973N气相色谱-质谱联用仪）是由三个主要部分组成：即气相色谱部分、质谱部分和数据处理系统。Agilent6890N-5973N气相色谱/质谱联用仪气相色谱法是一种以气体作为流动相的柱色谱分离分析方法。作为一种分离和分析有机化合物有效方法，气相色谱法特别适合进行定量分析，但由于其主要采用对比未知组分的保留时间与相同条件下标准物质的保留时间的方法来定性，使得当处理复杂的样品时，气相色谱法很难给出准确可靠的鉴定结果。质谱法的基本原理是将样品分子置于高真空（<10-3Pa）的离子源中，使其受到高速电子流或强电场等作用，失去外层电子而生成分子离子，或化学键断裂生成各种碎片离子，经加速电场的作用形成离子束，进入质量分析器，再利用电场和磁场使其发生色散、聚焦，获得质谱图。根据质谱图提供的信息可进行有机物、无机物的定性、定量分析，复杂化合物的结构分析，同位素比的测定及固体表面的结构和组成等分析。气-质联用(GC-MS)法是将GC和MS通过接口连接起来，GC将复杂混合物分离成单组分后进入MS进行分析检测。气相色谱-质谱联用系统的一般由下图所示的各部分组成：气相色谱仪，接口，质谱检测器，计算机系统和真空系统。GC-MS联用仪的组成示意图

气相色谱仪分离样品中各组分，起着样品制备的作用；接口把气相色谱流出的各组分送入质谱仪进行检测，起着气相色谱和质谱之间适配器的作用；质谱仪将接口依次引入的各组分进行分析，成为气相色谱仪的检测器；计算机系统交互式地控制气相色谱、接口和质谱仪，进行数据采集和处理，是GC-MS的中央控制单元。真空系统保证整个质谱检测器在真空状态下工作。（三）气相色谱-质谱联用的接口在气相色谱-质谱联用中，主要问题是降低工作气压。通常色谱柱的出口气压为100kPa左右，而质谱仪却在低于10-3Pa真空下操作，所以必须有一个接口系统将载气压力降低约8个数量级，并将样品送入，或经浓缩后送入质谱仪，以保证两种仪器都能在所需正常的条件下操作。其次是除去真空系统承担不了的多余载气，将组分尽量传输至离子源。气相色谱-质谱联用仪接口是解决气相色谱和质谱联用的关键组件，起到传输试样、匹配两者工作压力的作用，使经气相色谱分离出的各组分依次进入质谱仪的离子源。接口一般应满足如下要求：（a）不破坏离子源的高真空，也不影响色谱仪的柱效和色谱分离结果；（b）使色谱分离后的组分尽可能多的进入离子源，流动相尽可能少进入离子源；（c）不改变色谱分离后各组分的组成和结构；（d）具有良好的重现性；（e）接口的控制操作应简单、方便、可靠等。目前常用的气相色谱－质谱联用仪的接口有下面三种：1.直接导入型接口毛细管柱直接导入型接口示意图1.气相色谱仪2.毛细管色谱柱3.金属毛细管接口4.温度传感器5.质谱仪6.四级杆质量分析器7.离子源8.加热器该接口最简单，其基本原理见上图。它是将毛细管色谱柱出口通过接口直接插入质谱仪的离于源，这种接口方式是迄今为止最常用的一种技术。该接口装置为一金属毛细管，通常用于内径在0.25至0.32mm，载气出口流量在1～2ml／min的毛细管色谱柱。毛细管色谱柱插入金属毛细管接口，直至有1～2mm的色谱柱伸出该金属毛细管。载气和待测物一起从气相色谱柱流出立即进入离子源的作用场。由于载气氦气是惰性气体不发生电离，而待测物却会形成带电粒于。待测物带电粒子在电场作用下加速向质量分析器运动，而载气却由于不受电场影响，被真空泵抽走，接口的实际作用是支撑插入端毛细管，使其准确定位。另一个作用是保持温度，使色谱柱流出物始终不产生冷凝。2.开口分流型接口色谱柱洗脱物的一部分被送入质谱仪，这样的接口称为分流型接口。在多种分流型接口中开口分流型接口最为常用。其工作原理。开口分流型接口工作原理1限流毛细管；2外套管；3中隔机构；4内套管

气相色谱柱的一段插入接口，其出口正对着另一毛细管，该毛细管称为限流毛细管。限流毛细管承受将近0.1MPa的压降，与质谱仪真空泵相匹配，把色谱柱洗脱物的一部分定量地引入质谱仪的离子源。内套管固定插色谱柱的毛细管和限流毛细管，使这两根毛细管的出口和入口对准。内套管置于一个外套管中，外套管充满氦气，当色谱柱的流量大于质谱仪的工作流量时，过多的色谱柱流出物和载气随氦气流出接口；当色谱往的流量小于质谱仪的工作流量时，外套管中的氦气提供补充。这种接口结构也很简单、但色谱仪流量较大时，分流比较大、产率较低，不适用于填充柱的条件。3.喷射式分子分离器接口Ryhage型喷射式分子分离器工作原理常用的喷射式分子分离器接口工作原理是根据气体在喷射过程中不同质量的分子都以超音速的同样速度运动，不同质量的分子具有不同的动量。动量大的分子，易保持沿喷射方向运动，而动量小的易于偏离喷射方向，被真空泵抽走。分子量较小的载气在喷射过程中偏离接受口，分子量较大的待测物得到浓缩后进入接受口。喷射式分子分离器具有体积小热解和记忆效应较小，待测物在分离器中停留时间短等优点。气相色谱柱洗脱物进入图中左边的三角形腔体后，经直径约为0.1mm的喷嘴孔以超声膨胀喷射方式向外喷射，通过约为0.15-0.3mm的行程，又进入更细的毛细管，进行第二次喷射分离。（四）气相色谱-质谱联用仪器的基本操作程序气相色谱-质谱联用仪的基本操作主要包括以下几个方面：①开载气先打开钢瓶阀门，调节压力②分别打开气相色谱仪、质谱仪电源；

③打开工作站；④打开真空控制，抽真空，点击自动启动，约4-5min，自动关闭；⑤设定基本实验参数（进样口、柱、质谱仪），稳定1-2小时；调谐仪器；⑥开始编辑实验方法

进入实验方法编辑参数对话框，分别编辑GC和MS的参数。GC参数：柱温、进样口温度、进样模式、设置载气参数、程序升温控制参数等。MS参数：离子源温度、进样口温度、溶剂切除时间、微扫宽度等；⑦样品注册

输入相关信息（必须输入数据名文件和调谐文件）确定。⑧准备进样⑨后处理样品分析；

⑩关机，关闭电源及载气。（五）气相色谱-质谱联用仪的维护与保养1.GC-MS仪器应定期检查，并有专人管理，负责维护保养。2.气体纯度必须达到99·999%,并使用专用钢瓶灌装。2.质谱真空泄漏的确认及检漏

质谱真空是否出现空气泄漏,可从压力和空气/水的背景图谱进行判断。3.进样系统中的进样隔垫应视情况及时更换，衬管应视进样口类型、样品的进样量、进样模式、溶剂种类等因素来选用。4.色谱柱根据需要更换柱接头螺帽、柱接头螺帽。二、气相色谱-质谱联用实验技术（一）蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法（气相色谱-串联质谱法GB/T18932.20-2003）1实验原理蜂蜜试样用水溶解后，用乙酸乙酯提取试样中残留的氯霉素，提取液浓缩后再用水溶解，OasisHLB固相萃取柱净化，经硅烷化后用气相色谱-质谱仪测定，外标法定量。2试剂与材料水：GB/T6682规定的一级水；甲醇：色谱级；乙腈：色谱级；乙酸乙酯：色谱级；乙腈+水（1+7）：量取20mL乙腈与140mL水混合；OasisHLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。使用前分别用3mL甲醇和5mL水预处理，保持柱体湿润；吡啶：色谱级；六甲基二硅氮烷：色谱纯；三甲基氯硅烷：色谱级；硅烷化试剂：将九份吡啶、三份六甲基二硅氮烷和一份三甲基氯硅烷混合；氯霉素标准物质：纯度≥

99%3.主要仪器气相色谱-质谱仪；固相萃取装置。4.溶液的配置和试样的制备与保存4.1溶液的配置4.1.1氯霉素标准储备溶液：0.1mg/mL。准确称取适量的氯霉素标准物质，用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液贮存在4℃冰箱中，可使用两个月。4.1.2氯霉素基质标准工作溶液：选择不含氯霉素的蜂蜜样品五份，按本方法提取和净化后，制成蜂蜜空白样品提取液，用这五份提取液分别配成氯霉素浓度为0.4ng/mL，1.0ng/mL，3.0ng/mL，10ng/mL，20ng/mL溶液，经硅烷化后配成标准工作溶液，在4℃保存可使用一周。4.2试样的制备对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待祥品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。分出0.5kg作为试样，置于样品瓶中，密封，并做上标记。4.3试样保存

将试样于常温下保存。

5测定步骤5.1提取称取5g试样，精确到0.01g，置于50mL具塞离心管中，加入5mL水，于液体混匀器上快速混合1min，使试样完全溶解。加入15mL乙酸乙酯，在振荡器上振荡10min，在3000r/min下离心10min，吸取上层乙酸乙酯12mL转入自动浓缩仪的蒸发管中，用自动浓缩仪在55℃减压蒸干，加入5mL水溶解残渣，待净化。5.2净化将提取液移入下接OasisHLB柱的贮液器中，溶液以小于等于3mL/min的流速通过OasisHLB固相萃取柱，待溶液完全流出后，用2*5mL水洗蒸发管并过柱，然后再用5mL乙腈+水洗柱，弃去全部淋出液。在65kPa的负压下，减压抽干10min，最后用5mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于10mL具塞试管中，于50℃水浴中用氮气吹干仪吹千，待硅烷化。5.3硅烷化在上述10mL具塞试管中加入50μL硅烷化试荆，混合0.5min~1min，立即用正己烷定容至1mL，待测定。5.4测定5.4.1气相色谱一质谱侧定条件a）色谱柱：BB-5MS（30m*0.25mm*0.25μm)石英毛细管柱或相当者；b）载气：氦气，纯度≥99.99%；c）流速：1.0mL/min；d）柱温：初始温度70℃，然后以25℃/min程序升温至250℃，保持5min；e）进样量：1μL；f）进样方式：无分流进样；g）进样口温度：280℃；h）接口温度:280℃；i）负化学源：150eV；i）离子源温度：1500C；k）反应气：甲烷，纯度≥99.99%；1）反应气流量：40%；m）选择离子检测：检测离子/(m/z)离子比/(%)允许相对偏差(/%)46610046880±2047021±2537618±305.4.2定性测定进行样品测定时，如果检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子比与标准样品衍生物的离子比相一致，则可判断样品中存在氯霉素。如果不能确证，应重新进样，以扫描方式（有足够灵敏度）或采用增加其他确证离子的方式或用LC-MS-MS仪器来确证。5.4.3定量测定用配制的基质标准工作溶液分别进样，绘制峰面积对样品浓度的五点标准工作曲线，仪器测定以m/z466为定量离子，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中氯霉素衍生物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。5.5平行试验以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。5.6空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。6.结果计算结果按式（1）计算：式中：X—试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；c—从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V—样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）；m—样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。注：计算结果应扣除空白值7.精密度本部分的精密度数据是按照GB/T6379的规定确定的，其重复性和再现性的值是以95%的可信度来计算。7.1重复性在重复性条件下，蜂蜜中抓霉素的含量在0.10μg/kg~4.0μg/kg范围内，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限（r），本部分的重复性限按式（2）计算：式中：m—氯霉素测定值的浓度，单位为微克每千克（μg/kg）。如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的侧定。7.2再现性在再现性条件下，蜂蜜中氯霉素的含量在0.10μg/kg~4.0μg/kg范围内，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限（R），本部分的再现性限按式（3）计算：式中：m—氯霉素测定值的浓度，单位为微克每千克（μg/kg）。（二）气相色谱-质谱分析条件的选择气相色谱-质谱分析条件要根据样品进行选择，在分析样品之前应尽量了解样品的情况，比如样品组分的多少、沸点范围、相对分子质量范围、化合物类型等，这些是选择分析条件的基础。一般情况下样品组成简单，可以使用填充柱；样品组成复杂，则一定要使用毛细管柱。根据样品类型选择不同的色谱柱固定相，如极性、非极性和弱极性等。与气相色谱中的分析一样，汽化温度一般要高于样品中最高沸点20~30℃.柱温可根据样品的具体情况来设定，如有必要也可以采用程序升温技术，选择合适的升温速率，以使各组分都实现基线分离。有关气相色谱-质谱分析中的色谱条件与普通的气相色谱条件相同。质谱条件的选择包括扫描范围、扫描速度、灯丝电流、电子能量、光电倍增器电压等。扫面范围就是可以选择分析器的离子的质荷比范围，该值的设定取决于欲分析化合物的分子量，应该使化合物所有的离子都出现在设定的扫描范围之内。扫面速度视色谱峰宽而定，一个色谱峰出峰时间内最好能有7~8次质谱扫描，这样得到的重建离子流色谱图比较圆滑，一般扫描速度可设在0.5~2s扫一个完整质谱即可。灯丝电流一般设置在0.20~0.25mA。灯丝电流小，仪器灵敏度太低；电流太大，则会降低灯丝寿命。电子能量一般为70eV，标准质谱图都是在70eV下得到的。改变电子能量会影响质谱中各种离子间的相对强度。如果质谱中没有分子离子峰或分子离子峰很弱，为了得到分子离子，可以降低电子能量到15eV左右。此时分子离子峰的强度会增加，但仪器灵敏度会大大降低，而且得到的不再是标准质谱。光电倍增器电压与灵敏度有直接关系。在仪器灵敏度能够满足要求的情况下，应使用较低的光电倍增器电压，以保护倍增器，延长其使用寿命。（三）气相色谱-质谱分析技术

气相色谱-质谱分析的关键是设置合适的分析条件，使各组分能够得到满意的分离，得到很好的重建离子色谱图和质谱图，在此基础上才能得到满意的定性和定量的分析结果。气相色谱-质谱分析得到的主要信息有3个：样品的总离子流图或重建离子色谱图；样品中每一个组分的质谱图；每个质谱图的检索结果。此外，还可以得到质量色谱图、三维色谱质谱图等。对于高分辨率质谱计，还可以得到化合物的精确相对分子质量和化学式。1.总离子流色谱图(TIC)在一般气相色谱－质谱分析中，样品连续进入离子源并被连续电离。分析器每扫描一次，检测器就得到一个完整的质谱图并送入计算机存储。由于样品浓度随时间变化，得到的质谱图也随时间变化。一个组分从色谱柱开始流出到完全流出大约需要10s左右。计算机就会得到这个组分不同浓度下的质谱图10个。同时，计算机还可以把每个质谱图的所有离子相加得到总离子流强度。这些随时间变化的总离子流强度所描绘的曲线就是样品总离子流色谱图(TIC)或由质谱重建而成的重建离子色谱图。总离子流色谱图是由一个个质谱得到的，所以它包含了样品所有组分的质谱。它的外形和由一般色谱仪得到的色谱图是一样的。只要所用色谱柱相同，样品出峰顺序就相同，其差别在于，重建离子色谱所用的检测器是质谱仪，而一般色谱仪所用检测器是氢焰、热导等。两种色谱图中各成分的校正因子不同。2.质谱图

由总离子流色谱图可以得到任何一个组分的质谱图。一般情况下，为了提高信噪比，通常由色谱峰峰顶处得到相应质谱图。但如果两个色谱峰有相互干扰，应尽量选择不发生干扰的位置得到质谱图，或通过扣本底消除其他组分的影响。3.质量色谱图

总离子色谱图是将每个质谱的所有离子加合得到的色谱图。同样，由质谱中任何一个质量的离子也可以得到色谱图，即质量色谱图。由于质量色谱图是由一个质量的离子得到的，因此，其质谱中不存在这种离子的化合物，也就不会出现色谱峰，一个样品只有几个甚至一个化合物出峰。利用这一特点可以识别具有某种特征的化合物，也可以通过选择不同质量的离子做离子质量色谱图，使正常色谱不能分开的两个峰实现分离，以便进行定量分析。图7-6（a）中总离子色谱图中A，B两组分没有分开，不便定量。如果在A组分中选一特征质量，如m/z91，在B组分中选一特征质量，如m/z136，A和B的质量色谱图，如图7-6（b）和（c），则A,B两组分便可以得到很好地分离。由于质量色谱图是采用一个质量的离子作图，因此进行定量分析时，也要使用同一离子得到的质量色谱图进行标定或测定校正因子。利用质量色谱图分开重叠峰（a）总离子流色谱图（b）以m/z91所作的质量色谱图（c）以m/z136所作的质量色谱图

（四）定性、定量方法1.GC-MS定量分析GC-MS联用技术在定量方面具有一定优势，即可以在色谱峰分离不完全的情况下，采用选择性离子扫描，利用其各自特征离子保留时间的差异，根据化合物特征离子的峰面积或峰高与相应待测组分含量的比例关系，对其中的化合物分别进行定量。定量的操作方法是，先选定目标色谱峰，选取该峰附近两侧的基线噪声作为本底干扰予以扣除，然后对峰面积进行积分或计算峰高，然后换算成待测组分的浓度。同位素标记内标法是将稳定性同位素（如2H，13C，15N）标记到待测组分好和内标物中的内标校正曲线法，具有很高的灵敏度和专属性。这是GC-MS联用技术独有的技术，除质谱以外，其他色谱检测器均不能使用。2.GC-MS定性分析GC-MS联用技术可以在有标准品的情况下根据色谱并保留时间定性，与普通气相色谱的定性方法相同，即在色谱图中首先选定目标化合物的色谱峰，然后调出质谱图库进行比对，确定待测组分可能的结构及其他相关信息。若无标准品则可以利用质谱测定化合物特征离子并与标准质谱图库比对进行结构解析，以一般的质谱定性方法相同。在GC-MS联用中良好的分离是定性的基础，得到正确的质谱图是质谱定性准确的前提。三、气相色谱-质谱联用技术在食品分析中的应用GC/MS法在食品检验中的应用，主要是在农药残留分析、兽药残留分析、食品加工过程中产生的有害物检测和邻苯二甲酸酯类有机污染物分析等方面。（一）在农药残留分析中的应用有机磷农药作为一类高效、广谱的杀虫剂、除草剂，正被广泛地应用于农业生产中，但其大量使用后对人、动物和环境产生的危害也日益严重。下面是植物性食品中有机磷农药的测定方法。1.适用范围本方法适用于植物性样品中有机磷类农药残留的测定,定量限0.01-0.03mg/kg,检出限为0.005-0.01mg/kg。2.原理

试样经乙腈提取，氯化钠分层，有机相浓缩液经CARB/NH2固相萃取柱净化，用GC/MS进行定性定量分析3.主要仪器与耗材

气相色谱仪(安捷伦6890N)；带Ms检测器（5973i）；色谱柱：DB-1701石英毛细管色谱柱（30m×320μm(i.d.)×0.25μm（膜厚））；固相萃取柱：Carb/NH2

规格500mg/500mg/6mL4.试剂

乙腈：分析纯;丙酮：色谱纯;二氯甲烷：色谱纯;氯化钠：分析纯;无水硫酸钠：分析纯，600℃灼烧3小时;各农药标准品5.标准储备液配制

5.1标准储备液配制

称取各农药标准品各0.0500g,用丙酮溶解并定容至50mL，摇匀，浓度为1.00mg/mL。吸取上述溶液10.0mL于100mL的容量瓶中，用丙酮定容至刻度，摇匀，浓度为100ug/mL。5.2标准工作液的配制

按照需要，吸取各农药标准储备液，10倍法稀释至所需浓度，有机磷农药稀释至1.0μg/mL，配制成混合标准工作溶液。5.3淋洗液配制

用体积比为1∶1的丙酮和二氯甲烷的混合溶液做为淋洗液。6.操作步骤6.1样品采集

样品采集的标准化是获得准确数据的基础，抽样必须是随机的和有代表性的，能反映出样品的真实情况。6.2样品的制备和保存

取一定量（新鲜样品1kg左右，干性样品50g左右），新鲜样品初步切碎混匀（注意：样品无需洗涤，不要切的太碎，以免果蔬的组织液汁流失），干性样品磨碎过20目筛，四分法取样。所取的样品平均分为2份，1份供测定，另1份放置于-20℃冰箱中保存，备用。6.3提取

称取切碎或磨碎混匀的样品一定量，新鲜样品30g于高脚烧杯中，加入60mL乙腈，用高速组织匀浆机匀浆1min左右；干性样品（如茶叶）5g与具塞三角瓶中，加入30mL丙酮，超声提取30min；新鲜样品提取液经布氏漏斗抽滤，滤液倒入100mL具塞量筒（事先加入10g氯化钠）中，剧烈震荡，待分层清晰后，吸取上层溶液30mL，过无水硫酸钠于100mL平底烧瓶中，45℃水浴中减压浓缩近干，待净化；干性样品滤液直接过无水硫酸钠于100mL平底烧瓶中，45℃水浴中减压浓缩近干，待净化。6.4净化

用体积比为1∶1的丙酮和二氯甲烷的混合溶液做为淋洗液，先用5mL淋洗液活化Carb/NH2柱，然后用3×1mL淋洗液洗涤平底烧瓶，并分别把洗涤液转移到Carb/NH2柱上，液面到达SPE柱筛板表面后，再加入淋洗液12mL，收集此15mL淋洗液于50mL平底烧瓶中，45℃水浴中减压浓缩至近干，氮气吹干用1mL丙酮准确定容，待GC/MS分析测定。7.仪器条件色谱柱：DB-1701石英毛细管色谱柱（30m×320μm(i.d.)×0.25μm（膜厚））；载气：氦气（纯度＞99.99％）；恒流：1.0ml/min，不分流进样；进样口温度：250℃；离子源温度：230℃；接口温度：280℃，电子能量：70ev；柱温（程序升温）：初始温度：80℃（保持1min），20℃／min升至180℃（保持2min），10℃／min升至220℃(保持0min),10℃／min升至280℃（保持20min）；溶剂延迟：4min8.监测离子见书中表7-1（二）在兽药残留分析中的应用β-受体激动剂属于苯乙胺类药物，能显著提高动物酮体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率。但是，长期食用含有β-受体激动剂残留的食品将对人体健康产生极大的危害。（三）邻苯二甲酸酯类有机污染物分析邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸盐是一组化学化合物，主要用于聚氯乙烯材料，令聚氯乙烯由硬塑胶变为有弹性的塑胶，起到增塑剂的作用。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品（如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液）等数百种产品中。学习情景三

液相色谱-质谱联用仪的认知与应用学生认知：液相色谱-质谱（LC－MS）联用技术的研究开始于20世纪70年代，与气相色谱-质谱（GC－MS）联用技术不同的是，液相色谱－质谱联用技术似乎经历了一个更长的实践、研究过程，直到90年代才出现了被广泛接受的商品接口及成套仪器。气相色谱-质谱联用技术只适用于分析可以气化的样品，其电离方式不适合分析髙极性，热不稳定，难挥发的生物大分子及极性分子。与气相色谱相比，液相色谱的分离能力有着不可比拟的优势，其应用不受沸点的限制，并能对热稳定性差的试样进行分离、分析。然而液相色谱的定性能力更弱，因此液相色谱与有机质谱的联用，其意义更大。而且面对日益增加的大分子量（特别是蛋白，多肽等）和不挥发化合物的分析任务，也迫切需要用液相色谱-质谱联用来解决实际问题。液相色谱-质谱联用除了可以弥补气相色谱-质谱联用的不足之外，还具有高分离能力，高灵敏度，应用范围更广和具有极强的专属性等特点，越来越受到人们的重视。据估计已知化合物中约80%的化合物均为亲水性强、挥发性低的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，这些化合物广泛存在于当前应用和发展最广泛、最有潜力的领域，包括生物、医药、化工和环境等方面，它们需要用液相色谱分离。因此，液相色谱与质谱的联用可以解决气相色谱-质谱联用无法解决的问题。液相色谱-质谱联用仪(一)液相色谱-质谱联用仪

液相色谱-质谱联仪（如图为安捷伦Agilent1100液相色谱-离子阱质谱联用仪）主要由高效液相色谱、接口装置（同时也是离子源）、质谱仪和数据处理系统构成。安捷伦Agilent1100液相色谱-离子阱质谱联用仪高效液相色谱仪和一般的液相色谱仪基本相同，其作用是将混合物试样分离后进入质谱仪。该仪器的关键部分是液相色谱仪和质谱仪之间的接口装置，其主要作用是出溶剂并使试样离子化。由于接口装置同时就是离子源，因此质谱仪部分只包括质量分析器，对进入的离子进行质量分离，分离后的离子按质量的大小先后由收集器收集，并记录质谱图。（二）液相色谱-质谱联用要解决的重要问题液相色谱-质谱联用要解决的重要问题首先就是色谱仪与质谱仪的压力匹配问题。其次问题是色谱仪与质谱仪的流量匹配问题。要解决以上矛盾，实现液相色谱仪与质谱仪的联机，一般要用接口除去大量色谱流动相分子，浓集和汽化样品。接口性能很大程度上决定着液相色谱-质谱联用仪性能的优劣。（三）液相色谱-质谱联用的接口

近30年来，发展了许多接口技术，常用的液相色谱-质谱联用技术的接口主要有直接液体导入接口（DLI）、传送带式接口（MB）、热喷雾接口（TSP）、粒子束接口（PB）、快原子轰击（FAB）、基质辅助激光解吸离子化（MALDI）、大气压离子化技术（API）等。传送带式接口和液体直接导入接口开发较早，目前已少用。热喷雾接口和粒子束接口设计，缺乏专一性和足够的灵敏度。大气压离子化技术（API）是一类软离子化方式，它的出现成功地解决了液相色谱和质谱联用的接口问题，使液相色谱-质谱联用逐渐发展成为成熟的技术，适用范围非常广泛。下面简单介绍几种常见接口。1.电喷雾电离（ESI）在ESI中，离子的形成是被测分子在带电液滴的不断收缩过程中喷射出来的，即离子化是在液态下完成的。经液相色谱分离的样品溶液流入离子源。在N2流下汽化后进入强电场区域，强电场形成的库仑力使小液滴样品离子化，借助于逆流加热N2分子离子颗粒表面液体进一步蒸发，使分子离子相互排斥形成微小分子离子颗粒（见图）。这些离子可能是单电荷或多电荷，这取决于所得的带有正、负电荷的分子中酸性或碱性基团的体积和数量。电喷雾接口示意图在电喷雾过程中，溶液中一种极性离子（比如正离子）随着喷出的雾滴而离去（见图7-13），相反极性的离子（比如负离子）则留在毛细管的溶液中，如果毛细管为金属材料并与高压电源的一极相连，那么留在毛细管中的这些离子会在金属管壁上发生氧化或还原反应，通过这些电化学反应使溶液中电荷消失，从而维持连续地喷雾，例如OH-在金属管壁上发生以下电化学反应：4OH-→2H2O+O2电化学反应示意图2.大气压化学电离（APCI）用于LC-MS的APCI技术与传统的化学电离接口不同，它并不采用诸如甲烷一类的反应气体，而是借助电晕放电启动一系列气相反应以完成离子化过程，就其原理，它也可被称为放电电离或等离子电离。从液相色谱流出的样品溶液进入一具有雾化气套管的毛细管，被氮气流雾化，通过加热管时被气化。在加热管端进行电晕尖端放电，溶剂分子被电离，充当反应气，与样品气态分子碰撞，经过复杂的反应过程，样品分子生成准分子离子：S+e-→S++2e-

S++S→SH++S-SH++M→S+MH+上式表示一种正离子模式的化学电离过程。S代表溶剂，M代表样品分子，MH+代表生成的准分子离子。如果溶剂比样品碱性弱，则生成MSH+，都属于准分子离子。大气压化学电离接口示意图大气压电离技术的出现使LC-MS成为一种灵敏度高、选择性强、样品用量少、分析速度快的仪器联用分析方法。（四）气相色谱-质谱联用仪器的基本操作程序①开机

开空气泵、液相色谱和质谱仪电源开关,开PC机后使其联机成功，之后打开真空泵阀门。

②设定液相色谱和质谱参数

选择合适的色谱柱、流动相，设置梯度程序及柱温。

选择离子源模式，设置质谱参数。

③本底检查

按设定的色谱条件运行一遍空程序以检查基线和本底，若发现柱子不干净则应冲洗柱子和质谱仪，直至基线平稳无峰为止。

④运行样品PC机上运行设置好的程序。⑤关机

放真空，再关液相色谱、质谱电源。

⑥分析数据

调出谱图，根据定性及定量分析的需要，分别打开离子色谱图和质谱图，进行分析。

（五）液相色谱-质谱联用仪的维护与保养1.LC-MS仪器应定期检查，并有专人管理，负责维护保养。

2.实验完毕要清洗进样针，进样阀等，用过含酸的流动相后，色谱柱，离子源都