高考生物一轮复习 限时强化练 强化练5　基因敲除及同源重组、融合基因与融合蛋白

基因敲除及同源重组、融合基因与融合蛋白强化练5

(时间：30分钟分值：45分)1.(2025·黑吉辽蒙卷，25)香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。

(1)可从

中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图1所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入

和

限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用

连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5kb(kb为千碱基对)，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。

基因序列数据库(或GenBank或DNA序列数据库)Xho

ⅠXba

ⅠDNA连接酶(2)进一步筛选构建的质粒，以1～4号菌株中提取的质粒为模板，使用引物1和引物2进行PCR扩增，电泳PCR产物，结果如图2。在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有________________________的污染。初步判断实验组

(从“1～4”中选填)的质粒中成功插入了基因N，理由是______________________________________________________________________________________________________________________________________________。外源DNA(或外源基因)1

基因N大小为重组质粒大小和质粒pYL大小的差值，约为2.3kb，对应实验组1的电泳条带(或实验组1电泳条带大小加质粒pYL大小约等于重组质粒大小)(3)为提高香树脂醇合酶催化效率，将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列，丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物，其配对模板与a的配对模板相同。据此分析，丙氨酸的密码子除GCA外，还有

。a：5′－…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…－3′b：5′－…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…－3′c：5′－…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…－3′d：5′－…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…－3′GCC(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的

含量并进行比较，可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。香树脂醇解析

(1)可从基因序列数据库中查询基因N的编码序列，设计特定引物。分析题图1可知，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5′端分别引入Xho

Ⅰ和Xba

Ⅰ限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用DNA连接酶连接DNA片段。(2)在第5组的PCR反应中，使用无菌水代替实验组的模板DNA，目的是检验PCR反应中是否有外源DNA的污染。

质粒pYL大小为7.2kb，重组质粒大小约9.5kb，假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变，基因N大小为二者的差值，约为2.3kb，结合图2电泳结果可知，实验组1的电泳条带大小约为2300bp，说明实验组1的质粒中成功插入了基因N。(3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列，与丙氨酸的密码子序列相同)，b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸编码序列替换为丙氨酸编码序列的引物，其配对模板与a的配对模板相同，据此分析，除编码第243位苯丙氨酸的碱基序列TTC替换为诱变序列，与丙氨酸的密码子序列相同，其后的编码序列应该与a相同，为TGG/CTG/TTT……，所以该引物是c，其中GCC为第243位诱变序列，故丙氨酸的密码子还可以是GCC。(4)本题旨在通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N并进行改造，提高香树脂醇合酶的催化效率，高效生产香树脂醇，所以检测转基因酵母菌发酵产物香树脂醇的含量并进行比较，可以选出香树脂醇合酶催化效率较高的香树脂醇合酶基因改造方案。2.(2025·河北卷，22)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。

回答下列问题：

(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是

和

。模板与引物在PCR反应的

阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为__________________________________________________________________。引物脱氧核苷酸复性PCR过程变性、延伸需要的温度较高，不耐高温的DNA聚合酶在高温下会变性失活(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GP1两端应添加

(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成

键。Sma

Ⅰ和EcoRⅠ磷酸二酯(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为

，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量

，则表明融合蛋白能结合镉离子。

(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6天后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是________________________________________________________________________________________________________________。发出黄色荧光高

转基因衣藻细胞壁上的融合蛋白可吸附培养液中的镉离子，减小了镉离子对细胞的毒害240μmol·L－1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是______________________________________________________________________________________________________________。注：镉离子对渗透压的影响忽略不计。

培养液中的镉离子浓度过高，融合蛋白的吸附能力有限，镉离子对转基因衣藻和野生型衣藻均造成了较强的毒害(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是

和

。(填标号)①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖②衣藻生长速率受镉离子浓度影响③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质④衣藻吸附的镉可沿食物链传递①③解析

(1)PCR过程中，每进行一轮的扩增，都需要消耗引物和作为原料的脱氧核苷酸，所以随着PCR反应进行，引物和脱氧核苷酸的数量逐渐减少，可作为模板的DNA会越来越多，DNA聚合酶的数量基本保持不变。PCR反应中，变性、延伸过程温度较高，DNA聚合酶的化学本质为蛋白质，为防止高温导致蛋白质变性失活，所以PCR过程中需要用耐高温的DNA聚合酶。(2)分析图示中几种限制酶可知，Nhe

Ⅰ与Xba

Ⅰ酶切后产生的黏性末端相同，为了防止载体和目的基因出现自身环化和二者之间反向连接，不能同时在目的基因两端添加这两种酶的识别序列。根据题图中几种基因和限制酶的顺序可得出目的基因与对应酶切位点的位置关系，如图所示，即GP1基因两端应分别添加Sma

Ⅰ和EcoRⅠ的识别序列。DNA连接酶催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键，完成DNA片段的连接。(3)由题干信息可知，该转基因体系构建了SP7、CADR、GP1、YFP融合蛋白表达载体，其中黄色荧光蛋白基因(YFP)可看作标记基因。若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻发出黄色荧光，说明YFP表达成功，即融合蛋白表达成功。

将两种衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁的镉离子含量高于野生型衣藻，则说明融合蛋白可结合镉离子。

(4)分析题图2可知，镉离子浓度为0时，两组的细胞密度相对值差异不大，镉离子浓度增大后，两组的衣藻数量均出现不同程度的减少，但转基因衣藻的细胞密度相对值均大于野生型衣藻，可能是转基因衣藻细胞壁上的融合蛋白可吸附培养液中的镉离子，减小了镉离子对细胞的毒害。当外界镉离子浓度为240μmol·L－1时，转基因衣藻的生长也被明显抑制，原因可能是培养液中的镉离子浓度过高，融合蛋白的吸附能力有限，镉离子对转基因衣藻也造成了较强的毒害。

(5)与施加化学药物相比，转基因衣藻在环境治理上的优势有衣藻作为生物材料在水体中可进行自我繁殖，免去了反复施加药物的危害和麻烦；同时衣藻可吸收水体中的N、P等元素，在一定程度上减轻了水体富营养化。衣藻生长速率受镉离子浓度影响和衣藻吸附的镉可沿食物链传递不是其在环境治理上的优势。3.(2026·湖北黄石二中质检)透明质酸是一种应用广泛的粘性多糖。研究者选择了含木糖诱导型启动子的p质粒改造枯草芽孢杆菌，通过添加诱导型启动子来控制基因的表达，从而协调菌体生长与产物生产之间的关系。回答下列问题： (1)已知透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，为了使图1中酶切后的H基因与p质粒正确连接，p质粒位点1所对应的限制酶是

，酶切后加入

酶使它们形成重组质粒。B酶DNA连接(2)在培养枯草芽孢杆菌的LB培养基中加入蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂、去离子水等，根据物理状态，该培养基为

培养基，常用

法对该培养基灭菌。(3)为筛选出含重组质粒p的枯草芽孢杆菌，在含

的培养基上筛选；将筛选出的菌株进行工业生产时，若要获得大量的透明质酸，培养基中需要添加

。固体高压蒸汽灭菌四环素木糖(4)如图2为研究者将重组质粒进行改造，并利用同源区段进行

的方法将H基因插入到枯草芽孢杆菌的基因组mpr位点，从而获得整合型枯草芽孢杆菌的过程图。已知导入受体细胞的外源基因拷贝数过大会导致基因不稳定、转化效率低，与导入重组质粒的枯草芽孢杆菌相比，整合型枯草芽孢杆菌的优势为

。互换导入的基因较稳定，转化效率较高解析

(1)透明质酸合成酶基因H以a链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5′→3′，即转录是从DNA链的3′端开始，再结合质粒中启动子的方向可知，图1中p质粒位点1和2所对应的限制酶分别是B酶和A酶。DNA连接酶可将两个DNA片段连接起来。(2)根据物理状态不同，培养基可分为固体培养基和液体培养基，该培养基含有琼脂，琼脂是常见的凝固剂，因此是固体培养基；培