犊牛腹泻防治技术规范

1犊牛腹泻防治技术规范1范围GB/T41441.2规模化畜禽场良好生产环境第2部分：畜禽舍技术要求GB/T36195畜禽粪便无害化处理技术规范NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T4144动物源细菌抗菌药物敏感性测试技术规程纸片扩散法NY/T3075畜禽养殖场消毒技术病死及病害动物无害化处理技术规范农医发〔2017〕25号犊牛腹泻calfdiarrhea由细菌、病毒、寄生虫等病原微生物感染或其他因素(环境或日粮等因素的改变诱导胃肠道功衡)引起的一种以腹泻、脱水、粪便性状改变等为主要特征的消化道疾病，根据病因分为感染性腹泻和25诊断5.1流行特点不同性别和品种牛均可发生，多见于幼龄牛，尤其是出生至6月龄内的可达80%,死亡率可达50%。5.2临床症状5.2.1感染性腹泻5.2.1.1细菌性腹泻5.2.1.1.1大肠杆菌潜伏期很短，仅几个小时。可分为败血型、肠毒血型、肠型。5.2.1.1.1.1败血型：病犊表现为发热、精神不振，间有腹泻，常于症状出现后数小时至一天内急性5.2.1.1.1.2肠毒血型：较少见，常突然死5.2.1.1.1.3肠型：病初体温升高达40℃,数小时内开始下痢，体温降至正常。粪便初如粥样、黄5.2.1.1.2沙门氏菌：多数犊牛常于10日龄～14日龄以后发病，病初体温升高40℃~41℃,24h后排出灰黄色液状粪便，混有黏液和血丝，一般于病症出现后5d～7d内死亡。5.2.1.1.3多杀性巴氏杆菌：病初发烧，可达41℃~42℃,患病牛表现腹痛，开始下痢，粪便初为5.2.1.1.4溶血性曼氏杆菌：呼吸道症状为主，严重时引发全身败血症，部分犊牛出现腹泻、脱水。5.2.1.1.5产气荚膜梭菌：犊牛感染后，表现为急性腹泻，粪便呈暗红色或褐色，带腥臭味，伴随脱5.2.1.2病毒性腹泻5.2.1.2.1BCoV:犊牛在1周～3周龄易感，发病初期，病牛排黄色粪便，之后变为含有乳凝块和黏5.2.1.2.2BRV:多数感染表现为亚临床症状，部分犊牛感染后出现严重腹泻5.2.1.2.3BVDV:突然高热，体温可达40℃~42℃,持续4d～7d;精神沉郁，嗜睡，不愿站立或走动。初期流涎、口腔黏膜充血，随后出现糜烂或溃疡(多见于舌面、牙龈、颊部),继而发生剧烈腹泻，粪便呈水样、恶臭，混有黏液、血液或黏膜碎片，后期可能因脱水导致眼窝凹陷、皮肤弹性下降。5.2.1.3寄生虫性腹泻5.2.1.3.1球虫：犊牛感染球虫多表现为急性症状，病程初期表现为精神沉郁、嗜睡、被毛粗乱、食5.2.1.3.2隐孢子虫：初期表现为精神沉郁、被毛粗乱、食欲减退与腹泻，排出大量含有黏膜的水样35.2.2非感染性腹泻5.2.2.1泌乳母牛饲料突变或采食霉变饲料，以及犊牛遭遇温度变化、突然断奶、分群等应激，均可5.2.2.2通常表现为群发性的水样或糊状腹泻，粪便颜色多为黄色或灰白色，肛门及后躯常被稀粪污5.2.2.3伴有精神萎靡、食欲减退等全身症状。若持续腹泻，会5.2.2.4此类腹泻具有一过性特点，在消除诱因后多数可自行恢5.3病理变化5.3.1感染性腹泻5.3.1.1细菌性腹泻5.3.1.1.1大肠杆菌：败血症或肠毒血症死亡的病犊，常无明显的病理变化。腹泻的病犊，真胃黏膜5.3.1.1.2沙门氏菌：急性病例在心壁、腹膜、腺胃、小肠和膀胱黏膜有小点出血，脾充血肿胀、肠5.3.1.1.3多杀性巴氏杆菌：内脏器官出血，在黏膜、浆膜以及肺、皮下组织和肌肉都有出血点，脾脏无变化，或有小出血点。肝脏和肾脏实质变性。淋巴结显著水肿，胸腹腔内有大量渗出液。5.3.1.1.4溶血性曼氏杆菌：小肠、大肠黏膜轻度充血、水肿，表面附着少量黏液，严重病例可能出5.3.1.1.5产气荚膜梭菌：病变以瓣胃、肠管最为明显，瓣胃黏膜脱落，肠管大面积出血，尤其是空5.3.1.2病毒性腹泻5.3.1.2.1BCoV:小肠肠壁变薄、透明，肠腔液体增多，严重者引起腹腔积水，胃内有未消化的凝乳或灰白色假膜；小肠(尤其是空肠、回肠)黏膜充血、水肿，肠壁变薄，肠腔内充满水样或带血的恶臭5.3.1.3寄生虫性腹泻5.3.1.3.1球虫：肠道明显肿大、胀气或变形，肠浆膜面出现针尖大小、颜色为鲜红色，褐色或白色45.3.2非感染性腹泻性炎症变化(表现为黏膜充血、表面附着大量黏液)。其余实质器官无明显病变。5.4结果判定新鲜粪便至少20.0g,使用无菌容器运送，肛拭子样品应取无菌棉拭子插入肛门中，旋转5圈～10圈，5.5.1.2病死牛解剖后无菌采集肠、肠系膜淋巴结、肠道内容物，编号并记录病料来源等相关信息。5.5.1.34℃以下保存和运输粪便样品，24h内送达实验室进行检测。5.5.1.4若无法立即检测，供细菌检验的样品应于2℃~8℃保存，供病毒检验的样品应在-20℃5.5.2细菌性腹泻诊断5.5.2.1仪器设备5.5.2.2试剂5.5.2.3细菌分离培养5.5.2.3.1预增菌5.5.2.3.2选择性培养基鉴别培养5.5.2.3.2.1用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取5.5.2.3.1增菌液，划线接种5.5.2.4细菌革兰氏染色镜检取5.5.2.3.2中的典型单菌落制片，按照革兰氏染色试剂盒具体操作步骤进行染色，染色结束后使55.5.2.5.1仪器设备5.5.2.5.3引物序列见附录B中表B.1。5.5.2.5.4试验程序5.5.2.5.4.1核酸提取将提取的核酸置于-80℃以下保存。每次提取核酸时应至少设置…个阳性对照和阴性对照。5.5.2.5.4.2核酸扩增阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板，空白对照应用无核酸酶水。按照附录B中表B5.5.2.5.5试验成立条件阳性对照的Ct值<30且出现特异性扩增曲线，阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值≥40且无特异性当无Ct值或Ct值≥40当38<Ct值<40且出现特异性扩增曲线，则判为疑似复Ct值<40且出现特异性扩增曲线即判为核酸阳性，否则判为核酸阴性。5.5.3.1仪器设备仪器设同5.5.2.5.1。65.5.3.2试剂5.5.3.3引物序列5.5.3.4试验程序试验程序同5.5.2.5.4。试验成立条件同5.5.2.5.5。结果判定同5.5.2.5.6。5.5.4寄生虫性腹泻诊断5.5.4.1球虫诊断5.5.4.1.1试剂饱和盐水，配制方法见附录A.5。60目和100目铜丝网或尼龙网、100mL量筒、50mL烧杯、50mL离心管、10mL玻璃瓶、吸管、5.5.4.1.3粪便虫卵诊断法a)将被检动物或动物群的新鲜粪便充分搅匀后取10g,放入50mL烧杯中，加入适量水；b)轻轻搅匀，经60月铜丝网或尼龙网过滤，滤液再经100目铜丝网或尼龙网过滤；c)将滤液移入50mL试管，2500r/min离心10min;e)用饱和盐水加满玻璃瓶，盖上盖玻片(盖玻片应与液面接触),静置10min;5.5.4.2隐孢子虫诊断5.6.1疑似感染7患病犊牛出现5.2部分或全部临床症状，死亡犊牛出现5.2、5.3部分或全部临床症状及病理变化符合5.2临床症状、5.3病理变化，并满足5.5实验室诊断结果为阳性的样品，判定为确诊病例。6.1产犊管理产房在生产前彻底消毒，新生犊牛脐带留存长度5cm~10cm,且用5%～10%碘酊浸泡2min~6.2饲喂管理6.2.1犊牛出生后1h～2h内，应喂足初乳；72h后转为饲喂常乳，整个过程应做到定时、定量、6.2.2人工哺育应坚持“一牛一瓶”,并于每次哺乳前后对所用器具进行严格消毒。6.2.3犊牛出生7天后，应转入面积不小于2平方米的独立牛栏饲养。6.2.4于犊牛3周龄～4周龄时开始补饲开口料，为断奶做准备；至6周龄～8周龄时完成断奶。6.3.1犊牛出生7天后转入面积不小于2m²的独立牛栏；哺乳期按犊牛月龄、体重和性别进行分群(10头/群～15头/群),并固定专人管护。6.3.2根据季节变化及时调节圈舍温度，在保证有效通风的前提下，维持舍内干燥、卫生与温暖。6.3.4每日坚持刷拭牛体，并密切观察其精神、采食、粪便等状态，发现异常立即隔离处理。按规定程序完成去角(7日龄～35日龄)、免疫接种及断奶时的驱虫工作。6.4消毒管理6.4.2夏季每3天、冬季每7天对圈舍及活动场所进行喷雾消毒；断奶后或出现病死牛时，应对栏位6.4.3所有消毒操作均按NY/T3075的规定执行，参考消毒药见附录E中表E.1。6.5疫苗免疫疫苗及参考免疫程序见下表2。8表2参考免疫程序疾病类别疫苗类别牛多杀性巴氏杆菌病免疫时间说明书牛溶血性曼氏杆菌病牛病毒性腹泻/黏膜病牛病毒性腹泻/黏膜病、传染性鼻气管炎二联灭活疫苗、6.6治疗6.6.1治疗原则6.6.2.1参考抗生素见附录D中表D.1。条件允许的应按NY/T4144要求开展药敏试验，按照试验结6.6.2.2参考抗寄生虫药物见附录D中表D.1。7档案管理录、患病犊牛治疗记录等，档案保存期为20年。9(资料性)细菌培养基、试剂配制方法及细菌鉴别诊断A.1麦康凯琼脂平板称取蛋白胨20.0g、乳糖10.0g、牛胆盐5.0g、氯化钠5.0g、中性红0.03g、结晶紫0.001分装，121℃高压灭菌15min,冷却至45℃~50℃时，倾注无菌平皿，凝固后备用。A.2血琼脂平板称取胰蛋白胨15.0g、大豆胨5.0g、氯化钠5.0g、称取蛋白胨15.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖5.0g、硫乙醇酸钠1.0g、柠檬酸铁铵0.5g、琼脂15.0g,加纯化水至1000mL,充分混合，加热煮沸至完全溶解，将培养基放至室温，分装，121℃高压灭菌15min,冷却至45℃~50℃时，加入0.5g过滤除菌的D-环丝氨酸溶液，混匀后倾注无称取蛋白胨5.0g、牛肉浸粉3.0g、磷酸二氢钾0.4g、硫酸镁0.1g、葡萄糖2.0g、孟加拉红0.033g,加纯化水至1000mL,充分混合，微热溶解，将培养基放至室温，分装，121℃高压灭菌30A.5饱和盐水配制称取400g食盐，放入烧瓶中，加1000mL水，加热烧瓶至沸腾，充分搅拌后冷却至室温，有少量表A.1细菌选择培养基菌落及革兰氏染色特征大肠杆菌马丁肉汤液体培养基镜检可见革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌菌，多单个散在排列镜检可见革兰氏阳性、两端钝圆的粗大杆菌，多单个或成双排列多杀性巴氏杆菌血琼脂平板上呈细小、湿润、透明的露滴状菌落，不溶血杆状，两端钝圆溶血性曼氏杆菌血琼脂平板上呈细小、湿润、透明的露滴状菌落，a溶血(窄溶血环)(规范性)荧光定量PCR引物、探针序列及荧光定量PCR反应体系、反应条件检测病种检测靶基因引物及探针序列(5'-3')大肠杆菌Probe:CY5-TTCGCCTCATTAACCTATGGATTCAGProbe:FAM-CCTTTCCCGCTATCGGTAAProbe:FAM-CCTGCTAATGTTACTGCCGTTGATAGCG多杀性巴氏杆菌Probe:FAM-TCCCCATCTCGTCGAAAAATTGATTGTC溶血性曼氏杆菌Probe:FAM-CCCAACGTGTTGCAGCAGGTTTATCTT牛轮状病毒Probe:FAM-ATGAGCACAATAGTTAAAAGCTAACACTGTC牛冠状病毒NProbe:FAM-TGCCAAAGACCAGTATGGCACCG牛病毒性腹泻黏膜病毒Probe:FAV-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGC表B.2荧光定量PCR/RT-PCR反应体系荧光PCR预混液(2x)95℃预变性5min;液(2x)52℃反转录5min;时收集荧光信号。22总体积总体积(资料性)牛球虫虫卵模式图图C.1牛球虫虫卵及其孢子化模式图(资料性)参考抗生素及抗寄生虫药物表D.1