波谱分析课件

波譜分析

第一章緒論隨著科學技術的發展，新的儀器分析方法不斷出現，應用也越來越廣泛。近二十年來，紫外光譜，紅外光譜，核磁共振波譜，質譜等構成現代儀器分析的重要內容.這些方法與經典的分析方法相比不僅具有快速、靈敏、準確等優點，還具有樣品用量少，不破壞樣品等優點，現已成為化學工作者測定有機結構及定性，定量不可缺少的重要手段。人們通常將UV，IR，NMR和MS稱為“波譜分析”，也有稱為有機儀器分析。緒論[1]

一．波譜分析的發展1．

由於近代物理學，電子學和電腦的發展，產生了許多新的儀器分析方法，如變換紅外光譜法，脈衝變換核磁共振，色譜-質譜用等大型精密儀器已應用與科研和生產中。2．

儀器實現了自動化、數位化、電腦化。電子電腦提高分析的靈敏度、準確度和解析度，可進行連續自動分析、自動檢索等。3．分析方法互相滲透不同分析方法的連用，如：具有高度分離能力的氣相色譜、液相色譜與具有強的鑒別能力的質譜，紅外光譜聯用，可以達到快速剖析樣品，分析的目的。二．波譜分析的內容：波譜分析主要包括：UV，IR，NMR和MS。由於近年來有機化學的快速發展，要求先進的分析方法跟蹤反應過程，確定化合物結構及定性定量分析，因而自然地形成了波譜分析的分析方法。三．波譜分析的特點：

1．快速：獲得正確的情報比經典化學分析方法快得多。

2．樣品用量少：一般只需幾微克到幾十毫克（一般5-20mg）。

3．準確、重定性好：波譜分析法被廣泛地應用於各科研生產中，本校化學系實驗室具有：

HP6890/5973GC/MS產於美國惠普公司

GC-14B產於日本島津公司

Waters-510HPLC產於美國Waters公司

FT-IRMagna-550產於美國Nicolet公司

UN-Vis916產於澳大利亞GBC公司緒論[2]參考書：1．回瑞華，侯冬岩編著《近代有機儀器分析》吉林大學出版社2．DudleyH.Williams,M.A.Ph.D.Spectroscopicmethodsinorganicchemistry3．WilliamL.BuddeJamesW.EichelbergerOrganicsanaliysisusinggaschromatography/Msssspectrometry-Atechniques&proceduresmanual.4．姚新生等編著《有機化合物波譜分析》人民衛生出版社5．洪山海編著《光譜解析法在有機化學中的應用》科學出版社6．陳耀祖編著《有機分析》高等教育出版社7．陳德恒等編著《有機結構分析》科學出版社8．SiluerStein.R.M<SpectrometricidentificationoforganicCompounds>

諾貝爾化學獎享有世界最高榮譽，設有物理、化學、生物或醫學、文學和和平五項獎。1901年，瑞典皇家科學學院成立，根據諾貝爾遺願，諾貝爾獎金委員會首次頒獎。迄今為止，諾貝爾獎的頒發已有一百多年的歷史了。期間共頒發化學獎94次，8年因第一、二次世界大戰末頒獎。波譜分析與諾貝爾化學獎

從最近幾十年來諾貝爾化學獎頒獎的情況來看，化學科學逐漸出現了和生命科學相融合的趨勢。在20世紀的最後25年裏，諾貝爾化學獎有三分之一左右給予化學與分子生物學領域研究的成果。其中大部分獲得專案往往直接或間接地在波譜分析方面獲得了突破，可以說誰掌握了這一領域內的最先進的理論和實驗技能並能充分利用它，誰就有可能在這一領域處於領先地位，如：2002年諾貝爾化學獎由在質譜和核磁共振這兩個重要領域的科學家們分享。獲獎者，質譜領域的John．B．Fenn和KoIchiTanaka，核磁共振領域的KortWuthrich，在生物化學領域的進一步發展作出了貢獻。把波譜分析測試手段和設計合成方法應用於生命科學領域中的物質組成和結構的分析、新物質的設計與合成以及生命活動的反應機理的研究，將化學科學理論、技術和生命科學技術、應用逐步融合，將是未來一個非常重要的趨勢和這兩個學科發展的必然導向。

瑞典皇家科學院於10月9日宣佈，將2002年諾貝爾化學獎授予美國科學家約翰·芬恩(JohnB．Fenn)、日本科學家田中耕一(KoichiTanaka)和瑞士科學家庫爾特·維特裏希(KurtWuthrich)，以表彰他們發明了識別和分析生物大分子結構的方法即在質譜和核磁共振方面的貢獻

2002年諾貝爾化學獎簡介為什麼要研究生物大分子?

所有活的有機體—細菌，植物和動物—都包含有相同類型的大分子，這些大分子承擔著我們所稱之為生命現象的活動。細胞內發生的活動由核酸(如DNA)控制，核酸可以稱之為細胞的指揮者，同時各種蛋白質是細胞內活動的最主要的參與者。每種蛋白質都具有各自生物功能，並可能會隨著所處環境的變化而改變。例如血紅蛋白的功能是給身體中所有的細胞運送氧氣。蛋白質研究本身並不新鮮，但是，蛋白質組學，如研究不同的蛋白質和其他物質在細胞中怎樣相互作用，是一個比較新的研究領域，在最近幾年裏發展很快。隨著越來越多有機體基因序列作圖的完成及研究前沿的不斷推進，新的問題出現了：人的3萬多個基因是怎樣編碼成千上萬種不同的蛋白質的。如果一個基因受到損害或丟失會發生什麼情況?老年癡呆症或瘋牛病這樣的疾病是怎樣產生的?能否用新的化學物質更迅速地診斷及治療那些正在威脅人類的疾病。為了能夠解決這樣一些問題，化學家們一直不斷地探求更多的有關蛋白質的知識，以及它們之間，它們和細胞中其他分子是如何共同發揮功能的。這是因為蛋白質結構上的微小的變化會決定他們的功能。生物大分子革命性的分析方法

質譜是根據品質迅速鑒定一個物質。這一技術很久以來被化學家們用來分析小分子和中等大小的分子，這個方法非常靈敏，以至於每種含量極微的分子都有可能被檢測到。毒品和藥物的檢測，食品控制和環境分析都是目前常規使用質譜技術的領域。質諾—鑒定分子的方法

質譜技術早在十九世紀末就出現了，最早用於小分子分析是由JosephJ.Thompson在1912年報道的。二十世紀有許多諾貝爾獎直接依賴於質譜分析。例如，HaroldUrey發現氘(獲得1934年諾貝爾化學獎)，富勒烯，“足球碳”的發現使RobertCarl,SirHaroldKroto和RichardSmalley獲得1996年諾貝爾化學獎。將質譜用於大分子分析這一目標同樣長期吸引著科學家們。二十世紀70年代，在氣相中將大分子轉化為離子獲得了許多成功，這種技術稱為“解吸”技術，形成了在過去二十年裏這一領域革命的基礎。大分子相對於其他分子來說或許是大的，但是在這裏我們還是認為它具有小的不可思議的結構。例如血紅蛋白分子，它的品質是10-19克，如何去稱這麼小的重量。秘訣就是使單個的蛋白質分子與其它分子分離，擴散成一簇自由飛行，帶電的蛋白質離子。接下來測量這些離子的品質—並因此而鑒定這個蛋白質的常用方法是讓它們在一個真空室內加速並測量它們的飛行時間。它們按順序到達目的地，這一順序是由它們的電荷和它們的品質決定的，最快到達的是那些最輕的，帶有最高電荷的離子。

目前，有兩種原理可以使蛋白質在不破環結構和構型的狀態下轉移到氣相，正是這些方法背後的發現將要共同獲得諾貝爾化學獎金的一半。其中一個由JohnB．Fenn發明的方法中，樣品由很強的電場導致噴霧並產生小的，帶電荷的自由飛行的離子。另一種方法是用一束強鐳射脈衝使樣品離子化。如果處在合適的條件下(如能量，樣品的結構和化學環境)，分子吸收部分鐳射脈衝能量並成為自由離子被釋放。第一個表明這種“軟鐳射解吸”現象可能被用於分析蛋白質這樣的大分子的是KoIchiTanaka。

在1988年，JohnB．Fenn發表了兩篇有關大分子的電噴霧現象的論文，對質譜技術具有突破性意義。在第一篇論文裏，對未知品質的聚乙二醇的分析表明這一方法可以使大分子帶高電荷。第二篇文章報導了用這一方法分析中等大小的完整蛋白質。離子的產生是通過電場使樣品噴霧形成帶電液滴，隨著水分子逐漸從液滴蒸發，僅留下“光禿禿”自由飛行的蛋白質分子。這一方法被稱為電噴霧離子化(ESI)。當分子帶有很強的電荷時，品質／電荷比變得很小，這樣該物質就可以用普通的質譜儀進行分析。另一個好處是同一個分子會產生一系列峰，因為每一個峰都帶有不同數目的電荷。雖然這一複雜的譜圖在最初使研究者深感迷惑，但它給出的資訊使鑒定更容易了。

JohnB．Fenn的貢獻：(通過噴霧飛行)

與此同時，在日本京都島津儀器公司，一個年輕的日本工程師報導了一種完全不同的技術進行了這一研究。即在1987年的一個討論會及1988年發表的論文中，表述了蛋白質分子應該可以通過軟鐳射解吸(SLD)的方法被離子化。一束鐳射脈衝打在樣品上，與噴霧的方法不同樣品是處在固相或粘液相中，當樣品從鐳射脈衝中吸收能量，被爆破成很小的單位，分子一個接一個被釋放，以帶低電荷的完整的分子離子形式飛行，這些離子被一個電場加速並用上面提到的記錄它們的飛行時間的方式檢測。Tanaka第一個報導了鐳射技術對生物大分子分析應用的可能性。這一原理是今天多種有力的鐳射解吸方法的基礎，特別是簡稱為MALDI(基質輔助鐳射解吸離子化)，SELDI(表面增強鐳射解吸離子化)，DLOS(直接晶片離子化)的技術。Tanaka的貢獻：(通過爆破飛行)

電噴霧離子化和軟鐳射解吸都有許多應用領域。複雜的生化分析在幾年前還只是夢想，而現在已經成為可能。研究蛋白質的相互作用對了解生命中的信號系統是非常重要的，這種非共價生物分子複合物可用ESI分析，這一方法在速度，靈敏度和鑒別實際的相互作用方面都優於其他方法，使得這一技術迅速在世界各地的實驗室傳播。今天，軟鐳射解吸(以MALDI的形式)和電噴霧已經成為多肽，蛋白質和糖結構分析的標準方法。這使得迅速分析完整細胞和活組織中的蛋白質成為可能。下麵一些當前研究領域內的例子描繪了今年諾貝爾獎產生的應用的多樣性。包括：質諾的應用藥物開發：藥物開發的早期階段已經發生了變化。與液相分離相結合ESI—MS使每天分析幾百個物質成為可能。瘧疾：科學家最近發現了研究瘧疾傳播的新方法。由於軟鐳射解吸方法的出現使早期診斷成為可能，在這裏攜氧的血紅蛋白被用來吸收鐳射脈衝能量。卵巢癌，乳癌和前列腺癌：在過去幾年中，不斷有用於各種不同類型癌症早期診斷的新方法的報導。通過使用粘附有腫瘤分子的表面並用SLD分析，化學家能夠比醫生更早發現癌症。食品控制：

ESI技術同樣使小分子分析向前發展，我們已經知道我們所吃的食品的製備過程會產生許多對健康有害的物質，例如丙烯醯胺會導致癌症。使用質譜技術，食品在各種不同的生產階段都可以進行分析，通過改變溫度和配方，有害物質可以被避免或減少。期診斷的新方法的報導。

質譜能夠回答諸如“是什麼”和“有多少種”蛋白質這樣的問題，而核磁共振則回答這種蛋白質“是什麼樣子”的問題。對任何一種顯微鏡而言，即使是最大的蛋白質都顯得太小而不能獲得足夠的解析度。因此，要想能夠獲得一個蛋白質真正的圖像，必須採用其他手段。核磁共振就是這樣一種方法。通過對核磁共振譜圖中的譜峰進行解釋，人們可以得到所研究的分子的三維結構。核磁共振所用的樣品是處於溶液狀態，類似於蛋白質在細胞內的環境。核磁共振在生物大分子中的應用

早在1945年，物理學家Felix和EdwardPurcell就發現把有些原子核放在強磁場下，由於所謂核自旋的作用，它們能夠吸收特定波長的電磁波，即發生共振。這項發現使他們贏得了1952年的諾貝爾物理學獎。隨後，人們發現核共振的頻率不僅依賴於磁場的強度和原子類別，還依賴於原子所處的環境。而且，不同核的核自旋能夠相互影響，從而產生精細結構，即在核磁共振譜圖中產生更多的譜峰。最初，核磁共振的應用受到其低靈敏度的限制，因而需要濃度極高的樣品。但是在1966年，瑞士化學家RichardErnst(1991年諾貝爾化學獎得主)認為，如果用非常短而強的射頻脈衝來照射樣品，以取代緩慢改變照射頻率的方法，將會極大地提高靈敏度。在上世紀70年代，他還在發展核磁共振方法學上作出了貢獻，如尋找怎樣確定分子中相鄰核(例如由化學鍵相連的原子)的方法。通過對核磁共振譜圖中的信號進行解釋，人們能夠獲得分子結構的資訊。這種方法被成功地應用於小分子。但對大分子而言，要想將不同原子核的共振信號區分開來是非常困難的。一張大分子的核磁共振譜圖有數幹個譜峰，看起來就象一片片的草坪，根本不能確定哪個峰屬於哪個原子。最終解決這個問題的科學家是瑞士的化學家KurtWuthrich。

在上個世紀80年代初，KurtWuthrich發展了一套怎樣將核磁共振方法延伸到生物大分子領域的思路。他發明了一套系統方法，將每一個核磁共振信號與大分子中的氫核(質子)一一對應起來。這種方法叫做“序列指認”，目前已經成為所有核磁共振結構研究的基石。他還指出了怎樣能夠在大量質子中確定每一對質子間的距離。利用這些資訊，通過基於距離幾何的一種數學方法，就能夠計算分子的三維結構。1985年，利用KurtWuthrich的方法確定了第一個蛋白質的結構。到目前為止，在上萬個已知的蛋白質結構中，有大約15—20％的結構是由核磁共振方法確定的。其他的結構則主要是由x—射線晶體學方法確定的，只有有很少幾個是由其他方法如電子衍射或中子衍射確定的。

KurtWuthrich使核磁共振應用於蛋白質成為可能

在許多方面，核磁共振都能對x—射線晶體學結構測定進行補充。如果對同一種蛋白質用兩種方法進行研究，一種在溶液狀態，一種在結晶狀態，通常可以得到相同的結果，只是在一些受環境影響的表面區域二者有不同。這些區域在晶體中受到緊密堆積的臨近蛋白質分子的影響，而在溶液中則受到周圍溶劑分子的影響。x—射線晶體學的能力體現在能夠精確測定相當大的分子的三維結構，而核磁共振則有另外一些獨特的優勢。在溶液中進行研究就意味著可以模擬生理條件。核磁共振的一項特殊能力就是可以研究分子中無結構的和非常活動的部分，因而可以闡明分子的運動性，動力學以及這些特性在蛋白質鏈中各部分的差異。對蛋白質進行穩定同位素標記也有助於確定分子結構。用核磁共振確定的蛋白質結構的一個例子就是：與一系列危險疾病(如瘋牛病)的發展相關的阮病毒蛋白(StanleyPrusiner因此獲得1997年諾貝爾醫學獎)。和他的同事們利用核磁共振對該蛋白的研究結果表明，正常形態的阮病毒蛋白由兩部分構成。在水溶液中，其中大約一半的蛋白鏈形成一個有序的、相當剛性的三維結構(見下圖的121—231殘基)，而另一半則沒有任何結構而且非常活動。核磁共振還能用來研究其他生物大分子如DNA和RNA的結構和動力學。

在制藥工業中，核磁共振還被用來確定潛在靶蛋白質分子的結構和性質。新設計的藥物分子要能夠與蛋白質的結構相配合，就象鑰匙和鎖那樣。也許核磁共振在工業中最重要的用途是用來尋找能夠與指定生物大分子相互作用的潛在小分子藥物。如果小分子能夠與大分子作用，那麼大分子的核磁共振譜圖通常就會發生變化。用這種方法可以在新藥研發的早期對大量的候選藥物分子進行“篩選”。

我們把100多年來諾貝爾化學獎的獲獎專案進行了分類整理和統計分析，直接或間接地與波譜分析相關的獲獎專案如下：從中可以看到波譜分析在化學、生物研究領域內的發展中的作用

波譜分析與諾貝爾化學獎1902HERMANNEMILFISCHER(1852-1919,德國柏林大學)他在糖和嘌呤衍生物合成上的特殊貢獻得到認可。

1907

EDUARDBUCHNER(1860-1917,德國柏林農業大學)因為他的生物化學研究和發現無細胞發酵現象。

1915

RICHARDMARTINWILLSTATTER(1872-1942,德國慕尼克大學)因為他在植物色素，特別是葉綠素方面的研究

1918FRITZHABER(1868-1934,德國

Kaiser-Wilhelm研究所)因為他發明了工業合成氨的方法

1923

FRITZPREGL(1869-1930,奧地利Graz大學)因為他發明了有機化合物的微量分析方法。

1926THE(THEODOR)SVEDBERG(1884-1971,瑞典Uppsala大學)因為他在分離體系方面的研究

1927

HELNRICHOTTOWIELAND(1877-1957,德國慕尼克大學)因為他在膽汁酸與相關物質構成方面的研究

1928ADOLFOTTOREINHOLDWINDAUS(1876-1959,德國Goettingen大學)表彰他在研究固醇類成分及其與維生素關係上作出的貢獻。

1929SirARTHURHARDEN(1865-1940,英國倫敦大學)、HANSKARLAUGUSTSIMONVONEULER-CHELPIN(1873-1964,瑞典斯德哥爾摩大學)因為他們在糖發酵和發酵酶類方面的研究。

1930

SFISCHER(1881-1945,德國慕尼克技術研究所)因為他在血紅素成分和葉綠素成分方面的研究，特別是在血紅素合成上的貢獻。

1937

SirWALTERNORMANHAWORTH(1883-1950,英國伯明翰大學)因為他在碳水化合物和維生素C方面的研究；PAULKARRER(1889-1971,瑞士蘇黎世大學)因為他在類胡蘿蔔素、核黃素、維生素A和B2方面的研究。1938RICHARDKUHN(1900-1967,德國海德堡大學和德國Kaiser-Wilhelm研究所)表彰他在類胡蘿蔔素和維生素方面的研究。

1939ADOLFFRIEDRICHJOHANNBUTE-NANDT(1903-1995,德國柏林大學和德國Kaiser-Wilhelm研究所)表彰他在性激素方面的工作；LEOPOLDRUZICKA(1887-1976,瑞士聯邦技術研究所)表彰他在聚亞甲基和高級萜烯方面的工作。

1943GEORGEDEHEVESY(1885-1966,瑞典斯德哥爾摩大學)表彰他在利用同位素作為化學研究中的示蹤原子方面的工作

1945ARTTURIILMARIVIRTANEN(1895-1973,芬蘭赫爾辛基大學)表彰他在農業和營養化學，特別是飼料保藏方法方面的研究和發明。

1946

JAMESBATCHELLERSUMNER(1887-1955,美國Cornell大學)因為他發現了酶能夠結晶；JOHNHOWARDNORTHROP(1891-1987,美國洛克菲勒醫學研究所)、WENDELLMEREDITHSTANLEY(1904-1971,美國洛克菲勒醫學研究所)因為他們製備了純淨狀態的酶和病毒蛋白質。

1947SirROBERTROBINSON(1886-1975,英國牛津大學)表彰他在有關植物產品的生物價值，特別是在生物鹼價值方面的研究。

1948ARNEWILHELMKAURINTISELIUS(1902-1971,瑞典Uppsala大學)表彰他在電泳和吸附分析方面的研究，特別是在血清蛋白的複雜性上的發現。

1952ARCHERJOHNPORTERMARTIN(1910-,英國國立醫學研究所)、RICHARDLAU-RENCEMILLINGTONSYNGE(1914-1994,英國Rowett研究所)因為他們發明了分配色譜法。

1953HERMANNSTAUDINGER(1881-1965,德國Freiburg大學和國立大分子化學研究所)因為他開創了大分子化學研究領域。

1954

LINUSCARLPAULING(1901-1994,美國加州理工學院)表彰他在有關化學鍵本質及其應用於解釋複合物結構方面的研究。

1955

VINCENTDUVIGNEAUD(1901-1978,美國Cornell大學)表彰他對在生化方面具有重要性的硫化物的研究，特別是首次合成了多肽激素。1957LordALEXANDERRTODD(1907-1997,英國劍橋大學)表彰他在研究核苷酸和核苷酸輔酶上的成績。1958FREDERICKSANGER(1918-,英國劍橋大學)表彰他在蛋白質結構，特別是胰島素結構方面的工作。

1961MELVINCADVIN(1911-,美國加州大學)表彰他在研究植物的二氧化碳吸收方面取得的成績。1962MAXFERDINANDPERUTZ(1914-,英國劍橋分子生物學實驗室)、SirJOHNCOWDERYKENDREW(1917-1997,英國劍橋分子生物學實驗室)表彰他們在研究球蛋白結構上取得的成績。

1964DOROTHYCROWFOOTHODGKIN(1910-1994,英國皇家協會，牛津大學)因為她用X射線技術來確定重要生化物質的結構。

1970

LUISFLELOIR(1906-1987,阿根廷布宜諾斯艾利斯生物化學研究所)因為他發現了糖核苷酸及其在碳水化合物生物合成中的作用。

1972

CHRISTIANBANFINSEN(1916-1995,美國國立衛生研究院)因為他在核糖核酸酶，特別是氨基酸序列和生物活性結構之間的聯繫上的研究；STAN-FORDMOORE(1913-1982,美國洛克菲勒大學)、WILLIAMHSTEIN(1911-1980,美國洛克菲勒大學)表彰他們對核糖核酸酶分子活性中心的化學結構與催化活動之間關係的認識。

1975SirJOHNWARCUPCORNFORTH(1917-,英國Sussex大學)表彰他在酶催化反應的立體化學方面的研究；VLADIMIRPRELOG(1906-,瑞士工業大學)表彰他在有機分子立體化學和反應方面的研究。

1978PETERD.MITCHELL(1920-1992,英國格林研究所)表彰他通過化學滲透理論公式來認識生物能量轉移過程。

1980

PAULBERG(1926-,美國斯旦福大學)因為他對核酸生化特性的基礎研究，特別是對重組DNA的研究；WALTERGILBERT(1932-,美國坎布裏奇生物實驗室)、FREDERICKSANGER(1918-,英國劍橋醫學研究協會