热点微练11　PCR技术与电泳相关问题

热点微练11PCR技术与电泳相关问题(时间：40分钟)【精准强化】1.(2024·广东茂名调研)PCR又称聚合酶链式反应，在基因工程中常用它特异性地快速扩增目的基因。下列有关PCR的叙述错误的是()A.以DNA半保留复制为原理，反应需要在缓冲液中进行B.耐高温的DNA聚合酶只能从引物的5′端开始连接脱氧核苷酸C.反应过程中的每一轮循环依次包括变性、复性、延伸三步D.常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物答案B解析耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，B错误。2.(2023·浙江6月选考，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。下列叙述正确的是()A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子答案B解析由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于转录和翻译的方向均是沿mRNA的5′→3′，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3－GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3－GFP基因纯合子均能扩出条带，仅有Gata3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。3.(2024·河北唐山质检)如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T-DNA，要想对T-DNA两侧的未知序列进行测序，下列做法正确的是()A.用引物①和引物④直接进行PCR扩增之后再测序B.用引物②和引物③直接进行PCR扩增之后再测序C.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物①④PCR扩增后测序D.用DNA连接酶连接成环状后，再用引物②③PCR扩增后测序答案C解析直接选用引物①、④组合进行PCR，引物选择方向相反，无法完成扩增，A错误；用引物②和引物③可实现对已知的T-DNA序列进行扩增，但达不到预期目的，B、D错误；用DNA连接酶连接成环状后，用引物①④PCR扩增后测序，恰好可扩增出T-DNA两侧的未知序列，C正确。4.(2024·河南名校联盟)重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，获得想要的目的基因。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因的特定位点引入特定突变，以实现基因的定点突变，原理如图。下列说法错误的是()注：引起凸起处代表与模板链不能互补的突变位点。A.过程②需要含Mg2＋的缓冲液、DNA模板、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等B.若引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次DNA分子的复制后，一共会产生2种DNA分子C.经过程④获得的杂交DNA有2种，其中只有一种可以经过程⑤获得目的基因D.过程⑤使用耐高温的DNA聚合酶延伸，不需要引物答案B解析过程②为PCR反应，需要在添加了Mg2＋的缓冲液中才能进行，需要提供DNA模板、分别与两条模板链结合的引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等，A正确；两个反应系统中各自形成两种DNA分子，但由于引物1和引物4形成两个与原DNA相同的DNA分子，所以含有引物1和4的DNA属于同一种DNA，故总共形成3种DNA分子，B错误；过程④获得的杂交DNA有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，5′端为单链的杂交DNA为所需DNA，C正确；过程⑤是延伸过程，该过程使用耐高温的DNA聚合酶进行催化，不需要引物，D正确。5.(2024·广东七校联考)H18L是宫颈癌病毒(一种DNA病毒)特有的蛋白。科研人员利用转基因技术在植物细胞中表达H18L用于研究。研究发现，不同植物翻译时会有偏好的密码子，若提高H18L基因中编码受体细胞偏好的密码子对应的碱基序列比例，将大幅度提高翻译效率。为实现上述目的，需要对H18L基因序列进行改造。原理如图所示。步骤一：步骤二：回答下列问题：(1)步骤一：将预期的碱基序列设计在PCR的引物中，制备出PCR“体系1”和“体系2”，分别进行PCR扩增。①补全下表中的两个PCR体系的成分。成分PCR体系1PCR体系2模板引物a和bc和d酶其他成分四种脱氧核苷酸、缓冲液等②PCR扩增时，引物b、c与体系中加入的模板(填“完全结合”或“部分结合”)。(2)步骤二：将体系1、2的产物(即图中的ef和gh)混合后，继续进行下一次PCR反应。在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到50℃左右时，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有种结合的可能，其中能进行进一步延伸的有种。(3)步骤二的最终产物即为优化后的H18L基因序列，其长度为bp。用(填限制酶名称)处理该序列和载体，构建表达载体。再用法将该载体转入植物的愈伤组织，生产H18L蛋白。(4)上述实验中，利用引物实现了哪些实验目的？请写出两条：______________________________________________________________________________________。答案(1)H18L基因耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)部分结合(2)41(3)942BamHⅠ和XhoⅠ农杆菌转化(4)在DNA片段两侧引入限制酶的切割位点、替换DNA序列中的部分碱基对、扩增目的基因解析(1)PCR反应体系由引物、4种dNTP、TaqDNA聚合酶、模板DNA和缓冲液组成。①扩增的是H18L基因，模板是H18L基因。酶是耐高温的DNA聚合酶，即TaqDNA聚合酶。②依据图中信息，与原模板相比，引物b、c替换了部分碱基，与模板无法完全结合，只能部分结合。(2)假定原本H18L基因中替换前的控制一个氨基酸的碱基对为ACT//TGA，然后中间碱基对C//G被替换为A//T，设计引物b时该位置序列为TTA，设计引物c时该位置序列为AAT，反应体系1以引物a和b得到的产物有两种情况，即这三个碱基为ACT//TGA和这三个碱基为AAT//TTA；反应体系2以引物c和d得到的产物有两种情况，即这三个碱基为ACT//TGA和这三个碱基为AAT//TTA。将体系1、2的产物(即图中的ef和gh)混合后，继续进行下一次PCR反应，在该PCR反应体系中经过高温变性后，当温度下降到50℃左右时，能够互补配对的DNA链相互结合，理论上有4种结合的可能(①这三个碱基为ACT的e与这三个碱基为TGA的h相互结合；②这三个碱基为AAT的e与这三个碱基为TTA的h相互结合；③这三个碱基为TGA的f与这三个碱基为ACT的g相互结合；④这三个碱基为TTA的f与这三个碱基为AAT的g相互结合)。其中能进行进一步延伸的只有引物a与引物d结合的类型。(3)步骤二的最终产物即为优化后的H18L基因序列，其包含了两个限制酶的识别序列，故其长度为500＋30＋400＋6＋6＝942(bp)。该DNA两端分别含有BamHⅠ和XhoⅠ的识别序列，因此可用BamHⅠ和XhoⅠ处理该序列和载体，构建表达载体。将目的基因导入植物愈伤组织常用的方法是农杆菌转化法。(4)据题图分析可知，该实验中，利用引物实现了在DNA片段两侧引入限制酶的切割位点、替换DNA序列中的部分碱基对、扩增目的基因等实验目的。6.(2023·广东卷，20改编)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与植株的种子大小相近。(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备___________________________________________________。(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了________________________________。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约%的培养基中幼苗继续培养。③将②中选出的T2代阳性植株(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。答案(1)野生型(2)Ti质粒启动子和终止子(3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因②75③自交100解析(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和作为载体的Ti质粒进行切割，再用DNA连接酶将两者连接。在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。(3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没于农杆菌(T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)菌液进行转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入。根据题意，选出单一位点插入的植株，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将②中选出的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：7.(2023·山东卷，25)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(1)与图甲中启动子结合的酶是。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有__________________________________________(答出2个结构即可)。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了，条带2所检出的蛋白(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。答案(1)RNA聚合酶复制原点、标记基因、限制酶切割位点(2)F1和R2或者F2和R1a链(3)J-V5融合蛋白不是解析(1)与图甲中启动子结合的酶是RNA聚合酶。图甲中有启动子和终止子等，作为载体，质粒还需具备的结构有限制酶切割位点、标记基因、复制原点等。(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位均包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′，图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。(3)据图乙可知，只有抗V5抗体时，出现条带1，抗V5抗体能与V5编码序列表达标签短肽V5特异性结合，只有抗J蛋白抗体时，出现条带1和条带2，且条带1较宽，说明该物质能与抗J蛋白抗体特异性结合，因此出现条带1证明细胞内表达了J-V5融合蛋白，而条带2可能是杂质。8.(2024·北京顺义区检测)基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重排等变异。下图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图，图乙是研究人员利用基因M1构建基因表达载体的过程。请回答下列问题：(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加入；图甲所示的基因定点突变技术需要次PCR；获得产物A需要的引物是。(2)研究人员对PCR的中间产物A、B进行纯化后，利用图中相关酶对基因M和产物A、B进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图中基因敲除片段的长度为，基因M1的长度为。项目基因MAB长度3.24、2.8、0.15、0.132.8、0.093.24、0.05(3)通过图甲过程获得的基因M1仍需要大量扩增，此时选择的引物是，为了与图乙中的Ti质粒相连，还需要分别在它们的端引入限制酶的识别序列。(4)构建基因表达载体时，M1基因必需插入Ti质粒的中，原因是_______