蛋白质组学全面实验操作课件

蛋白质组学全面实验操作课件样品制备·质谱鉴定·定量分析·前沿进展实验课件2026年课件导览01实验总览与样品制备建立全流程认知，掌握样品收集与蛋白提取02酶解除盐与质谱鉴定拆解酶解、除盐与质谱采集核心操作03定量分析与数据处理解析标记与非标记定量策略及生信分析04前沿进展与技术趋势呈现2026年技术突破与应用方向01实验总览与样品制备数据质量始于样品从样本到肽段的标准化起点自下而上法全流程总览高质量质谱数据始于标准化的样品制备1蛋白提取高质量质谱数据始于标准化的样品制备2蛋白酶解自下而上法（鸟枪法）核心步骤3肽段除盐去除盐类干扰，提升检测灵敏度4质谱检测由肽段反推蛋白鉴定与定量三大关键环节蛋白提取蛋白酶解肽段除盐衍生步骤蛋白定量稳定同位素标记分级分离修饰肽段富集全流程三大支柱样品制备是根基生物有机质谱是技术核心生物信息学是数据挖掘手段一次质谱检测常采集数万张二级谱图，横坐标为质荷比，纵坐标为信号强度样品收集与保存规范全程低温操作，按单次用量分装植物组织液氮速冻研磨成粉，加含PVPP的裂解液去除多酚干扰微生物细菌用溶菌酶1毫克每毫升破壁，真菌用0.5毫米玻璃珠涡旋破碎体液血清室温静置30分钟，血浆加抗凝剂，3000转离心15分钟取上清保存-80℃冻存，建议不超过6个月全程低温（4℃或冰浴）操作，减少蛋白氧化与降解；避免反复冻融，不超过

3次贴壁细胞预冷PBS洗2次0.25%胰酶37℃孵育1至2分钟1000转离心5分钟悬浮细胞800转离心5分钟PBS重悬洗涤2次后留沉淀动物组织预冷生理盐水去除筋膜脂肪剪成1立方毫米小块蛋白提取与裂解液选择充分释放蛋白，同时抑制降解充分释放蛋白，同时抑制降解裂解液核心成分SDS、SDC、NP40、TritonX100、Urea

等去垢剂，破坏样本固有结构、使蛋白变性溶解物理辅助结合

超声、研磨

等方法，促进蛋白质释放抗降解全程冰上操作，加入蛋白酶抑制剂

PMSF

等抑制蛋白降解减少人为修饰提前准备大量冰，冰上操作，降低操作引入的修饰深度纯化：杂质过多或引入SDS时，用丙酮沉淀蛋白并复溶去杂动物组织：取

50至100毫克

按

1比5

加预冷裂解液，冰浴研磨后静置

30分钟

让蛋白充分溶出特殊样本的专属处理通用流程之外，需按样本类型定制样本类型专属处理步骤FFPE组织二甲苯脱蜡处理SDS胶条脱色或脱银，清洗游离SDS血浆或血清试剂盒去除高丰度蛋白，提高鉴定深度杂质过多样本丙酮沉淀、复溶，进行深度纯化特殊处理共同目标：消除干扰成分，保证后续酶解与质谱检测不受影响血浆等体液样本去除高丰度蛋白，可显著提升低丰度蛋白的检出机会蛋白质控与浓度测定质控决定样本能否进入下一步质控决定样本能否进入下一步质控目的：检查提取到的蛋白是否满足后续实验要求两个环节蛋白质浓度测定SDSSDS可检测蛋白提取效率、是否污染、定量准确性、是否存在高丰度蛋白定量方法对比BCA法562nm碱性条件下蛋白将二价铜离子还原为一价铜离子，与BCA试剂形成紫色络合物，测定

562nm

处吸收值Bradford法595nm考马斯亮蓝与蛋白结合后，595nm

处光吸收与蛋白质含量成正比定量意义统一酶解反应条件，确保各样品质谱上样量一致，避免批次效应操作避坑要点九成问题出在样本前处理六项前处理避坑清单从研磨、离心、保存到去垢剂与抑制剂环节，每一步失误都可能直接影响蛋白完整性与质谱结果。6项组织研磨未冰浴温度升高导致蛋白变性血清离心转速过低低于

2500转，血细胞未完全分离尿液未及时离心细菌繁殖降解蛋白反复冻融超过3次破坏蛋白完整性残留去垢剂未去除影响后续酶解反应与质谱检测未加蛋白酶抑制剂蛋白降解与修饰丢失核心原则：从源头控制质量，才能获得可靠的质谱数据02酶解除盐与质谱鉴定让肽段干净上机酶解、除盐与采集模式全解析酶解前的还原与烷基化先打开结构，再封闭位点待解决问题：天然球状蛋白空间位阻降低酶解效率天然蛋白质呈球状稳定结构，空间位阻显著降低酶解效率第1步还原还原步骤加入二硫苏糖醇

DTT

或

TCEP

等还原剂，打开二硫键，使蛋白由球状变为链状结构。第2步烷基化烷基化步骤加入碘乙酰胺

IAA

或氯乙酰胺

CAA

等烷基化试剂，封闭暴露出来的游离巯基。防止巯基再次氧化形成二硫键第3步效果综合效果彻底舒展蛋白链，进一步破坏蛋白二级结构，显著提高酶解效率。胰蛋白酶酶解条件与策略最适配质谱的蛋白酶切割特性首选酶：胰蛋白酶，特异性识别并剪切赖氨酸（K）和精氨酸（R）的C端肽键。片段长度：生成6至25个氨基酸的肽段，长度适宜质谱检测；碱性残基使肽段带正电荷，利于离子化。酶解条件最佳pH7.5至8.5，温度

37℃。酶与底物质量比

1比20至1比50，反应

4至18小时。漏切策略可控漏切

5%至15%。反而可将抗体序列覆盖从

65%至75%

提升至

85%至95%。替代方案对赖氨酸与精氨酸分布异常、或需提高全序列覆盖的蛋白，可换用或顺序使用多种蛋白酶。肽段除盐的必要性与方法让肽段干净进入质谱肽段除盐是质谱上机前不可或缺的一步，去盐、保肽、护质谱风险一盐的双重危害堵塞喷雾针不可挥发的盐结晶残留喷雾针附近，易致堵塞，损耗质谱寿命。抑制离子化盐离子进入质谱后，可能抑制目标物质离子化，妨碍检测。除盐方案4项杂质来源组织自带杂质、提取溶液引入的盐、酶解残留的盐主要方法层析法核心原理SDB或C18层析柱结合肽段，盐类及其他杂质流穿，实现分离纯化后续处理纯化后肽段可干燥并短期保存，以备上机检测质谱采集模式深度对比DDA如机关枪扫射，DIA如地毯式轰炸DDA数据依赖采集DIA数据非依赖采集PRM平行反应监测DDA采集逻辑按信号强度挑选TopN母离子碎裂覆盖度偏重高丰度，易遗漏低丰度谱图利用约

30%

至

50%

有效解析适用场景探索性发现与鉴定DIA采集逻辑窗口内全部母离子无差别碎裂覆盖度全景扫描，覆盖更全面谱图利用数据可回溯，利用度高适用场景大规模定量与验证补充要点三大扫描模式DDA数据依赖采集、DIA数据非依赖采集、PRM平行反应监测早期文献早期文献中的鸟枪法蛋白质组学，通常即指DDADIA的优势与4D升级从三维到四维，选择性持续提升DIA定量能力接近金标准PRM，被

NatureMethods

评为2015年年度最受瞩目技术之一DIA核心优势4项全景扫描·可回溯选择随机性低、定量准确度高，定量能力接近金标准PRM重复性与稳定性好肽段选择无随机性不受样本数量限制克服标记定量对大批样本的局限年度瞩目技术被

NatureMethods

评为2015年年度最受瞩目技术之一4D-DIA升级3项新增离子淌度维度在保留时间、质荷比、离子强度三维基础上增加离子淌度维度基于CCS分离离子越大、结构越蓬松，碰撞阻力越大、移动越慢提升选择性提高母离子选择性，大幅降低谱图解析复杂度质谱仪器与碎裂方式分辨率与碎裂方式决定数据质量依据样本复杂度与定量需求，匹配分辨率与碎裂模式。分辨率与碎裂方式，是决定质谱数据质量的两把标尺。仪器性能3项分辨率需求常规酶切肽段带2或3个电荷，所需最低分辨率约

10000至30000质量精度Orbitrap质谱仪可实现

1ppm

质量精度，适用于复杂样本分析主流平台赛默飞

OrbitrapExploris240、布鲁克timsOmni系列等碎裂与采集3项碎裂方式碰撞诱导解离

CID

或高能碰撞解离

HCD，获取二级质谱数据，提供肽段序列信息常用仪器Orbitrap系列（17500或30000

分辨率）与Q-TOF数据产出原始谱图横坐标为质荷比，纵坐标为检测到的信号强度，每个峰代表一个离子信号03定量分析与数据处理从谱图到结论定量策略与数据挖掘路径定量策略的两大路径按样本量与精度需求选择路径标标记定量SILAC体内标记iTRAQ体外标记TMT体外标记非非标记定量LFQ非标定量DIA定量靶靶向绝对定量PRMSureQuant选选择依据样本数量定量精度要求是否需要内参试剂预算iTRAQ与TMT技术原理等量异位标记，一次上机多样本比较等量异位标记的核心，是让不同样本的同一肽段在一级质谱中表现为同一峰，再由报告离子强度读出各自的表达量。iTRAQ（ABSCIEX研发）体外同位素标记技术采用

4或8种

同位素标签特异性标记多肽氨基基团可同时比较4或8个样本TMT（ThermoScientific研发）标记通道数从2增至6、10、11、16个最多可同时比较

18个

样品定量原理试剂三部分：报告基团、平衡基团、肽反应基团反应基团：与赖氨酸ε氨基和所有肽链氨基末端连接，可标记所有氨基酸定量原理：不同标记的同一肽段在一级质谱中表现为同一峰；二级质谱中平衡基团中性丢失，报告基团释放报告离子，其信号强度代表该标记样品的表达量iTRAQ试剂结构与定量计算报告离子峰面积决定相对丰度报告基团与平衡基团质量之和恒为

145Da，等量异位设计使同一肽段在一级质谱中质荷比相同试剂质量参数3项报告基团质量113

至

121Da，无

120Da平衡基团质量28

至

31Da等量异位设计报告基团与平衡基团质量之和保持

145Da，使不同样本来源的同一肽段在一级质谱中质荷比相同定量计算与要求4项二级碎裂平衡基团发生中性丢失，报告基团在低质量区产生多个报告离子定量计算根据报告离子的峰面积，计算同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值样本要求蛋白量不低于

50微克，浓度不低于

5微克/微升仪器要求需

QExactivePlus

等高精度质谱系统完成分析标记定量的优势与局限高精度与高成本并存“标记定量以通道并行换取通量与准确度的提升，同时以相对定量和成本为代价。”三大优势3项通量高iTRAQ单次最多

8

个样品，TMT最多

18

个；超通道数可设内参搭桥，多次上机数据可比较定量准确、重复性高不同样本标记后混样统一处理上机，减少样本处理和上机误差检测范围广无物种特异性限制，胞浆、膜、核、胞外、分泌蛋白皆可检测，可检出低于

10KD

或高于

200KD

的蛋白三大局限3项仅相对定量无法提供绝对定量信息标记偏差风险可能导致定量结果误差分析复杂、成本高需专业生物信息学工具，试剂成本较高选型需在通量、准确度与成本、分析复杂度之间权衡非标记与靶向定量策略无标记也能定量，靶向更精准LFQ非标定量相对定量：高性能液质联用单独测试优势：无需标记试剂，成本较低样本数量不受限制SILAC体内标记：氨基酸同位素重形式替代天然轻形式高分辨质谱分析实现相对定量SureQuant基于

PRM方法的靶蛋白绝对定量在一系列样品中可靠检测和定量数百到数千个靶标DIA定量适合大样本队列研究克服标记定量对大批样本的局限01探索性研究用

DDA与LFQ02大样本队列用

DIA03靶向验证用

PRM送样标准与样本要求送样量不足是实验失败的常见起点各样本类型送样量要求样本类型送样量要求动物组织湿重不少于

200毫克植物组织湿重不少于

2克血清样品体积不少于

500微升细胞样品1×10^7个

或沉淀不少于

50微升菌体样品沉淀不少于

100毫克

或体积不少于

100微升蛋白样品蛋白量不少于

1毫克，浓度不低于

2毫克每毫升软骨或骨头等样本建议不低于

400毫克；建议送原始样本，除非已熟练掌握蛋白质组学的蛋白提取方法数据分析与生物信息学一次检测几万张谱图，靠算法解析质谱数据与已知蛋白质序列数据库比对，确定样品中存在的蛋白质并推断修饰与变异定量矩阵结果以矩阵形式展示每一行一个蛋白，每一列一个样品常用软件MaxQuant、ProteomeDiscoverer、Spectronaut等差异分析筛选不同条件间的差异蛋白功能富集GO与KEGG富集分析挖掘差异蛋白的功能特征互作网络PPI蛋白互作网络分析有效缩小核心靶点筛选范围数据库检索质谱数据与已知蛋白质序列数据库比对确定样品中存在的蛋白质并推断修饰与变异结果验证与生物学解释筛选结果必须经得起功能验证结果验证与生物学解释，是筛选走向应用的关键环节验证必要性确保筛选出的靶点具有功能性与可靠性。常用手段Westernblot、Co-IP、qRT-PCR细胞或动物实验生物学解释探索蛋白质的功能、调控机制及其在疾病中的作用。应用转化筛选出的核心蛋白可作为疾病诊断的生物标志物和治疗靶点。01筛选→验证→机制，形成研究闭环04前沿进展与技术趋势技术边界持续拓展2026年蛋白质组学新动向2026年前沿方向总览更高灵敏度，更深覆盖，更精准分析核心趋势随着高分辨质谱与样本制备技术突破，蛋白质组学正快速向更高灵敏度、更深覆盖、更精准分析方向发展。四大前沿方向新技术新方法空间与单细胞蛋白质组学翻译后修饰蛋白质组学AI蛋白质组学会议动态2026年8月27日第八届蛋白质组学新技术新方法研讨会召开亮点技术靶蛋白鉴定技术PELSAAI虚拟细胞单细胞精密蛋白测量高通量单细胞蛋白质组学新方法非变性质谱AI赋能质谱数据分析工具GproDIADeepGlyco高分辨质谱平台性能突破布鲁克

timsUltraAIP

系统结合razor-PASEF方法与Spectronaut21软件，实现性能突破空间与单细胞蛋白质组学从群体平均走向单细胞分辨率空间与单细胞蛋白质组学，正推动蛋白质研究从群体平均走向单细胞分辨率代表性成果空间图谱：2026

年Nature刊出迄今分辨率最高、覆盖范围最广的人体蛋白质组空间图谱。单细胞成果：Neuron发表小鼠衰老小胶质细胞的单细胞蛋白质组学图谱。技术支撑新方法：高通量单细胞蛋白质组学新方法

Chip-Tip

结合SC-pSILAC与SPRINT。配套硬件：单细胞蛋白质组学分析专用柱温箱等专用设备同步推出。核心挑战单细胞样本蛋白量极低，对样品前处理与质谱灵敏度提出极高要求。技术价值揭示细胞异质性，为疾病机制研究提供单细胞层面的分子证据。AI与蛋白质组学的融合从蛋白质鉴定走向虚拟细胞里程碑NatureM