【《显微注射技术的发展国内外研究现状文献综述》3200字】

-35-显微注射技术的发展国内外研究现状文献综述显微注射技术研究现状显微注射技术是一项高精度操作技术，指专业人员利用显微操作器，在高倍显微镜的环境之下，控制显微注射针对胚胎或者细胞进行一系列精密操作。在显微注射技术中使用的是玻璃针头，并且主要是以细胞微灌注技术和微注射技术为基础，现如今越来越多的实验生物学研究领域都能经常看到显微注射技术，常见的有遗传技术、转基因技术、生物制药技术及生物克隆技术等。这项技术所用到的器械有一个或多个筒状微量移液管、精确的定位装置以及微量注射器等，并且在单个生物细胞上进行显微操作。目前，显微注射技术已是细胞工程中的一项不可或缺的重要操作技术，例如，在细胞工程中常见的显微操作技术有显微切割、动物胚胎移植和干细胞注射等。图1-1为几种常见的显微操作技术。图（a）胚胎注射图（b）干细胞显微注射图（c）单精子注射图1-1显微注射操作是一项高精度的技术，目前依然是由专业的操作人员在显微操作系统上完成的。由于显微操作的胚胎或者细胞太小，尺寸一般为10~100um，而且有许多操作又是对目标细胞的一些特定结构来进行精密而又细微的操作，这就要求了操作人员需要有很高的专业水平。一般来说，有高专业水平的技术人员都是经过长期的特定训练，财力物力人力投入较大，而在工作时，操作人员工作时的状态和操作的态度在很大程度上决定了最后的操作结果。另外，像胚胎转基因注射和核移植都是需要批量进行操作，这又要求了操作人员需要有很高的精力和体力，这就使得这些操作很难重复进行。国外对细胞注射这项技术起步较早，一些学者在上世纪八十年代开始对细胞注射及细胞注射相关技术进行研究，他们将计算机技术、微型图像处理技术、伺服控制技术和微精密加工技术结合，到目前已经取得了阶段性的进展。日本湘川大学的S.X.Guo和J.Wang[3]建立了可以远程控制的微注射系统。为了克服微场中运动和操纵物体的困难，通过触觉、听觉和视觉通道获得微注射场景信息作为反馈控制信号。控制信号和反馈信号通过网络建立模拟现实的虚拟环境，通过在模拟现实的虚拟环境中的操作实现系统实时的控制。P.Kallio[4]团队建立了一显微注射系统，它的结构如图1-2所示，该操作系统中微操作手末端位置的控制方式有两种，分别是开环控制方式和闭环控制方式，其中闭环控制方式是通过一个反运动模型增长模式和两个单输入单输出的比例积分控制器来提高定位的精度，可以精确定位微注射针的位置并且精准实现细胞膜穿刺的操作。图1-2P.Kallio微操作手结构图NorthCarolina大学的L.Mattos[5]团队开发了一种微注射系统，这种注射系统是基于视频加速技术的，图1-3为该种系统，可以发现此系统的操作器被用于控制图形用户界面和直流驱动电机，并且通过对微注射系统的控制，可以实现二轴旋转、三维定位以及微注射等工作。图1-3半自动化胚胎显微注射系统上世纪在国内生物研究领域中，显微注射技术及其相关内容的研究较为落后，上世纪九十年代以来，国家对这一技术的重视程度不断加强，显微注射技术及其相关内容也有了长足的进步。但是，由于国内精密加工制造水平还没达到国外的那种高度，所以国内目前还没有生产显微注射系统的企业。南开大学孙明竹[6]团队开发了一种微注射系统，图1-5（a）所示为该系统，此微注射系统主要由三个功能模块组成，分别是传感，操作和控制模块。传感模块的作用是检测操作时微针的针尖位置和被操作的细胞的位置，检测这两种位置主要是通过CCD摄像头而实现的；控制模块则可以规划多轴操作的路径。图（a）南开大学微注射系统（b）中国科技大学微注射系统图1-5微注射系统中国科技大学[7-8]的研究人员利用光学的基础开发了光学生物细胞激光微注射系统，图1-5（b）所示为该系统。此系统相比于传统的机械加工系统，主要的区别是能够通过利用光的热学效应从而实现对生物细胞或者更小的微粒子来进行精密操作，并且可以利用光的力学效应实现了对细胞或者细胞器的捕捉以及搬运，操作精度比传统的机械加工系统更高。南京理工大学的刘天军[9]开发了具有细胞输送的功能的数字化细胞注射系统，该系统依据工业自动送料的原理实现了把被注射的细胞定点地输送到细胞吸持针的端口处，这相比于传统的注射系统，更简单且更方便，这一结论在斑马鱼卵细胞的注射实验中得到验证。除此之外，国内还有诸多高校科研团队在细胞显微操作系统这一领域取得成果，如南京理工大学[10]、中国矿业大学[11]、华南理工大学[12]等。1.2.2显微注射器的研究现状在现代生物科学领域中，显微注射技术有着极其重要的地位，越来越多的国内外学者以及各种机构开始对注射方式进行了深入研究。然而在细胞微损伤破膜这一方面，传统的细胞膜破膜是基于细胞膜穿刺原理的，现在主流的破膜方法仍然是基于这一方法，例如SUTTER公司的模拟微量注射器和XenWorksTM微注射手，以及Eppendorf手动微量注射器，这种方式存在弊端，那就是因为这种方式是利用细胞注射针直接对目标细胞膜进行穿刺，所以在对细胞破膜后很容易就对细胞内部造成较大损伤。图1-6XenWorksTM微注射手1995年，人们首次提出了压电显微注射技术[1-2]，并把这一技术应用在了单精子注射实验中。在该技术中，压电驱动注射针振动技术被首次运用于细胞膜的穿刺实验，并且成果显著，它使注射后的卵母细胞存活率达到了80%，并且接近72%的卵母细胞能够最终发育成囊胚。这一实验的成功验证了压电显微注射技术的意义重大，因为它对细胞的损害比之前的直接穿刺破膜方法更小。美国Connecticut大学的研究人员研发了一种压电细胞注射装置。该细胞注射器的主体结构是内部封装有堆叠压电陶瓷块的圆柱形结构，该装置的前段有一个微针锁紧装置，这一装置是用来固定住注射微针的。这种压电细胞注射装置利用了压电陶瓷逆压电效应，给压电陶瓷加一定频率的电信号，这时压电陶瓷会在轴向发生振动，并且振动会通过装置主体传导至注射针的针尖，使针尖也发生振动从而刺破细胞膜。不过该装置也有弊端，实际实验中，研究者们发现针尖的纵向振动有利于穿刺细胞膜，但针尖的横向振动也较大，所以在穿刺细胞膜时对细胞的损害较大。为了减小横向振动，在之后的研究中，研究人员们在针尖的前端加了一小段水银，这可以有效针尖，但随之而来的问题是水银具有毒性，这又在很大程度上增加了细胞注射的风险，并且水银的毒性会降低细胞的存活率，所以水银的加入不仅增加了显微操作的复杂程度，而且限制了显微注射的应用领域。黄海波对上述细胞注射仪做了优化改进，具体是把压电陶瓷放置在前端，这样的结构不仅能够使得压电陶瓷的振动更易传至针尖从而提高了振动能量利用率，最重要的是，这种改进结构可以不用水银稳定针尖，消除了水银对该项技术的限制，还能在一定程度上减小了针尖横向振动幅值。黄海波之后在加拿大多伦多大学做博士后的期间又提出了一种新型压电显微注射装置的设计[13-14]，并且提出了基于两点支撑的压电显微注射装置[15]（图1-7（b）），而且实现了猪卵母细胞的压电显微注射。图（a)基于挠性机构压电显微注射装置；图（b)基于两点支撑的压电显微注射装置图1-7新型压电显微注射装置参考文献[1]KimuraY,YanagimachiR.Intracytoplasmicsperminjectioninthemouse[J].Biologyofreproduction,1995,52(4):709-720.[2]KimuraY,YanagimachiR.Mouseoocytesinjectedwithtesticularspermatozoaorroundspermatidscandevelopintonormaloffspring[J].Development,1995,121(8):2397-2405.[3]WangJ,GuoS.Operatingcharacteristicevaluationofahumanscaletele-operatingsystem[C].IntelligentMechatronicsandAutomation,2004InternationalConferenceon.IEEE,2004,10:6-11.[4]KALLIOP,ZHOUQ,LINDM,etal.Positioncontrolofa3DOFpiezohydraulicparallelmicromanipulator[C]//Pro2ceedingsoftheIEEE/RSJInternationalConferenceonIntelligentRobotsandSystems.Victoria,Canada,1998:770-775.[5]MATTOS,L.,GRANT,E.,THRESHER,R.Semi-automatedblastocystmicroinjection[C]//ProceedingsoftheIEEEInternationalConferenceonRoboticsandAutomation.Orlando,Florida,2006:1780-1785.[6]孙明竹.面向复杂作业的微操作机器人系统视觉反馈与定位研究[D].南开大学,2009.[7]王自强,王浩威,席时权,等.微束激光基因转移仪的研制[J].自动化仪表,2006,27(8):18.[8]JinHZ,LianJQ,KunY,etal.Observingnanometrescaleparticleswithlightscatteringformanipulationusingopticaltweezers[J].ChinesePhysicsLetters,2008,25(1):329.[9]刘天军.数字化细胞微注射技术及其应用研究[D].南京理工大学,2004.[10]田桂中.自动化细胞注射中微操作与微注射技术及实验研究[D]:[博士学位论文].南京:南京理工大学,2008.[11]杨雪锋.压电式生物细胞微操作台建模及控制策略研究[D]:[博士学位论文].徐州:中国矿业大学,2009.[12]吴志斌.用于显微操作的微小型机器人关键技术的研究[D]:[硕士学位论文].广州:华南理工大学,2011.[13]H.B.Huang,J.K.Mills,C.LuandD.Sun,Auniversalpiezo-drivenultrasoniccellmicroinjectionsystem,[J]BiomedicalMicrodevices,vol.13,no.4,pp.743-752,2011.[14]H.B.Huang,J.K.Mills,D.Sun,ANewPiezo-drivenUltrasonicCellMicroinjectionSystem[C],Proceedingsofthe2010IEEEInternationalConferenceonInformationandAutomation,pp.18-23,2010.[15]JiaqiHuang,HaiboHuang,LiguoChen,YaoweiLiu,XiangpengLi,HaoYang,YadiL