基于MWCNTs和AuNP的阪崎肠杆菌免疫传感器的研究

基于MWCNTs和AuNP的阪崎肠杆菌免疫传感器的研究摘要本研究旨在开发一种基于多壁碳纳米管（MWCNTs）和金纳米颗粒（AuNP）的高灵敏度阪崎肠杆菌免疫传感器。通过将MWCNTs和AuNP修饰在电极表面，利用其优异的电子传导性和生物相容性，显著增强了传感器的性能。实验结果表明，该免疫传感器对阪崎肠杆菌展现出良好的线性响应，检测限低至[X]cfu/mL，且具有出色的选择性和稳定性。本研究为阪崎肠杆菌的快速、准确检测提供了一种新的有效方法，有望在食品安全检测等领域得到广泛应用。关键词阪崎肠杆菌；多壁碳纳米管；金纳米颗粒；免疫传感器一、引言1.1阪崎肠杆菌的危害及检测研究现状阪崎肠杆菌（Enterobactersakazakii）是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于环境中，如土壤、水和灰尘等。该菌对婴幼儿尤其是早产儿、低体重儿以及免疫力低下的婴儿具有严重的威胁，可引发脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎等严重疾病，死亡率较高。据相关研究报道，婴幼儿感染阪崎肠杆菌后的死亡率可达20%-50%。目前，检测阪崎肠杆菌的方法主要有传统培养法、分子生物学方法和免疫学方法等。传统培养法操作繁琐、耗时较长，通常需要5-7天才能得出结果，且检测灵敏度较低，容易漏检。分子生物学方法如聚合酶链反应（PCR）虽然具有较高的灵敏度和特异性，但需要专业的设备和技术人员，且检测成本较高，难以实现现场快速检测。免疫学方法如酶联免疫吸附测定（ELISA）具有操作相对简便、检测速度较快等优点，但在灵敏度和检测限方面仍有待提高。因此，开发一种快速、灵敏、准确且成本低廉的阪崎肠杆菌检测方法具有重要的现实意义。1.2纳米材料在免疫传感器中的应用纳米材料由于其独特的物理化学性质，如小尺寸效应、表面效应和量子尺寸效应等，在免疫传感器领域展现出了巨大的应用潜力。多壁碳纳米管（MWCNTs）具有优异的电子传导性、较大的比表面积和良好的化学稳定性。其高电子传导性能够加速电子转移过程，提高传感器的响应速度和灵敏度；大比表面积则为生物分子的固定提供了更多的位点，有利于提高传感器的负载量和检测信号。金纳米颗粒（AuNP）具有良好的生物相容性、表面等离子体共振特性以及易于修饰等优点。AuNP能够增强免疫反应信号，通过与抗体或抗原的结合，实现对目标物的特异性识别和检测。同时，其表面等离子体共振特性可用于实时监测免疫反应过程，为传感器的检测提供可视化的信号。将MWCNTs和AuNP结合应用于免疫传感器的构建，有望综合两者的优势，进一步提高免疫传感器的性能。已有研究表明，基于MWCNTs和AuNP的免疫传感器在检测其他生物分子和病原体方面取得了较好的效果，但在阪崎肠杆菌检测方面的研究还相对较少。因此，本研究致力于探索基于MWCNTs和AuNP的免疫传感器在阪崎肠杆菌检测中的应用。二、实验部分2.1实验材料与仪器2.1.1实验材料多壁碳纳米管（MWCNTs，纯度>95%）购自[供应商名称1]；氯金酸（HAuCl₄・4H₂O）、硼氢化钠（NaBH₄）、牛血清白蛋白（BSA）、戊二醛（GA）、辣根过氧化物酶（HRP）、阪崎肠杆菌标准菌株（ATCC29544）、阪崎肠杆菌抗体（anti-E.sakazakii）等均购自[供应商名称2]；玻碳电极（GCE，直径3mm）、铂丝电极、饱和甘汞电极（SCE）购自[供应商名称3]；其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。2.1.2实验仪器电化学工作站（型号[工作站型号]），购自[仪器公司名称1]；扫描电子显微镜（SEM，型号[SEM型号]），购自[仪器公司名称2]；透射电子显微镜（TEM，型号[TEM型号]），购自[仪器公司名称3]；紫外-可见分光光度计（UV-Vis，型号[UV-Vis型号]），购自[仪器公司名称4]；恒温振荡器（型号[振荡器型号]），购自[仪器公司名称5]；离心机（型号[离心机型号]），购自[仪器公司名称6]。2.2实验方法2.2.1MWCNTs的预处理将MWCNTs加入到浓硝酸和浓硫酸（体积比为1:3）的混合酸溶液中，在80℃下回流搅拌6h，以对MWCNTs进行酸化处理，使其表面引入羧基等官能团，提高其在水中的分散性和生物相容性。反应结束后，冷却至室温，用二次蒸馏水反复洗涤至中性，然后在60℃下真空干燥12h，得到预处理后的MWCNTs。2.2.2AuNP的制备采用柠檬酸钠还原法制备AuNP。具体步骤如下：将100mL0.01%的HAuCl₄溶液加热至沸腾，快速加入10mL1%的柠檬酸钠溶液，继续搅拌并保持沸腾状态15min，溶液颜色由浅黄色逐渐变为酒红色，表明AuNP已形成。停止加热，继续搅拌冷却至室温，得到粒径约为20-30nm的AuNP溶液，储存于4℃冰箱备用。2.2.3免疫传感器的制备（1）MWCNTs修饰电极的制备：将预处理后的MWCNTs超声分散在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，形成浓度为1mg/mL的MWCNTs悬浮液。取5μL该悬浮液滴涂在玻碳电极表面，在红外灯下干燥，使MWCNTs均匀修饰在电极表面，得到MWCNTs修饰电极（MWCNTs/GCE）。（2）AuNP修饰MWCNTs/GCE电极的制备：将MWCNTs/GCE电极浸入到新制备的AuNP溶液中，在室温下孵育1h，使AuNP通过物理吸附作用修饰在MWCNTs表面，然后用二次蒸馏水冲洗电极表面，去除未吸附的AuNP，得到AuNP/MWCNTs/GCE电极。（3）抗体固定化：将10μL浓度为1mg/mL的anti-E.sakazakii抗体溶液滴涂在AuNP/MWCNTs/GCE电极表面，在4℃下孵育12h，使抗体通过Au-S键固定在AuNP表面。然后用0.01MPBS缓冲液（pH7.4）冲洗电极表面，去除未结合的抗体。接着将电极浸入到1%的BSA溶液中，在室温下孵育1h，以封闭电极表面的非特异性吸附位点，得到免疫传感器（anti-E.sakazakii/AuNP/MWCNTs/GCE）。2.2.4免疫传感器的性能测试（1）电化学表征：采用循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）对免疫传感器的电化学性能进行表征。以饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，铂丝电极为对电极，免疫传感器为工作电极，在含有5mM[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻和0.1MKCl的PBS缓冲液（pH7.4）中进行测试。CV扫描范围为-0.2V至0.6V，扫描速率为50mV/s；DPV扫描范围为-0.2V至0.6V，脉冲幅度为50mV，脉冲宽度为0.05s，采样宽度为0.0167s。（2）检测性能测试：将制备好的免疫传感器分别浸入到不同浓度的阪崎肠杆菌标准溶液（浓度范围为10¹-10⁷cfu/mL）中，在37℃下孵育30min，使抗体与阪崎肠杆菌发生特异性免疫反应。然后用PBS缓冲液冲洗电极表面，去除未结合的细菌，将免疫传感器置于含有5mM[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻和0.1MKCl的PBS缓冲液（pH7.4）中，采用DPV法检测免疫传感器的电流响应。以电流响应值为纵坐标，阪崎肠杆菌浓度的对数为横坐标，绘制标准曲线，计算检测限和线性范围。（3）选择性测试：分别选取与阪崎肠杆菌结构相似的大肠杆菌（E.coli）、沙门氏菌（Salmonella）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），浓度均为10⁵cfu/mL，按照上述检测性能测试方法，检测免疫传感器对这些干扰菌的电流响应，考察免疫传感器的选择性。（4）稳定性测试：将制备好的免疫传感器在4℃下保存，每隔3天进行一次检测性能测试，考察免疫传感器的稳定性。（5）重复性测试：同一批次制备5个免疫传感器，对浓度为10³cfu/mL的阪崎肠杆菌标准溶液进行检测，考察免疫传感器的重复性。三、结果与讨论3.1免疫传感器的表征3.1.1SEM和TEM表征通过SEM和TEM对MWCNTs、AuNP以及免疫传感器的表面形貌进行了表征。SEM图像显示，预处理后的MWCNTs呈现出管状结构，管径均匀，长度在微米级别，且在电极表面分布较为均匀。TEM图像进一步证实了MWCNTs的管状结构，同时可以清晰地观察到AuNP均匀地分散在MWCNTs表面，粒径约为20-30nm，与预期相符。在免疫传感器的SEM图像中，可以看到抗体固定在AuNP/MWCNTs修饰的电极表面，使得电极表面变得更加粗糙，这为免疫反应提供了更多的活性位点。3.1.2电化学表征采用CV法对不同修饰电极的电化学性能进行了研究。图1为裸GCE、MWCNTs/GCE、AuNP/MWCNTs/GCE和anti-E.sakazakii/AuNP/MWCNTs/GCE电极在含有5mM[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻和0.1MKCl的PBS缓冲液（pH7.4）中的CV曲线。从图中可以看出，裸GCE电极的氧化还原峰电流较小，表明其电子传递速率较慢。MWCNTs修饰后，电极的氧化还原峰电流显著增大，这是由于MWCNTs具有优异的电子传导性，能够促进电子在电极与溶液之间的传递。AuNP修饰MWCNTs/GCE电极后，氧化还原峰电流进一步增大，这是因为AuNP不仅具有良好的导电性，还能增加电极的比表面积，提高电极对[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻的吸附能力。当抗体固定在AuNP/MWCNTs/GCE电极表面后，氧化还原峰电流明显降低，这是由于抗体的固定阻碍了电子的传递，同时免疫反应形成的免疫复合物也在一定程度上阻挡了[Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻向电极表面的扩散。3.2免疫传感器的检测性能3.2.1标准曲线与检测限在优化的实验条件下，采用DPV法检测了免疫传感器对不同浓度阪崎肠杆菌的电流响应，结果如图2所示。随着阪崎肠杆菌浓度的增加，免疫传感器的电流响应逐渐降低，且在10¹-10⁷cfu/mL浓度范围内呈现出良好的线性关系。线性回归方程为I（μA）=-[a]lgC（cfu/mL）+[b]，相关系数R²=[c]，其中I为电流响应值，C为阪崎肠杆菌浓度。根据3倍信噪比（S/N=3）计算得到检测限为[X]cfu/mL，表明该免疫传感器对阪崎肠杆菌具有较高的灵敏度。3.2.2选择性免疫传感器的选择性是其实际应用中的关键性能之一。图3为免疫传感器对阪崎肠杆菌（10⁵cfu/mL）以及干扰菌大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌（浓度均为10⁵cfu/mL）的电流响应。从图中可以看出，免疫传感器对阪崎肠杆菌具有明显的电流响应变化，而对其他干扰菌的电流响应变化较小，表明该免疫传感器对阪崎肠杆菌具有良好的选择性，能够有效区分阪崎肠杆菌与其他结构相似的细菌。这是由于抗体与阪崎肠杆菌表面的抗原具有特异性结合能力，而与其他细菌的结合较弱，从而保证了免疫传感器的选择性。3.2.3稳定性免疫传感器的稳定性对其长期应用至关重要。将制备好的免疫传感器在4℃下保存，每隔3天进行一次检测性能测试，结果如图4所示。在保存15天内，免疫传感器对10³cfu/mL阪崎肠杆菌的电流响应仍能保持初始值的[Y]%以上，表明该免疫传感器具有较好的稳定性。这主要得益于MWCNTs和AuNP良好的化学稳定性以及抗体在电极表面的牢固固定，使得免疫传感器在储存过程中性能不易发生变化。3.2.4重复性同一批次制备5个免疫传感器，对浓度为10³cfu/mL的阪崎肠杆菌标准溶液进行检测，计算电流响应值的相对标准偏差（RSD）。结果显示，5个免疫传感器的电流响应值的RSD为[Z]%，表明该免疫传感器具有良好的重复性，能够满足实际检测的需求。这说明本实验制备免疫传感器的方法具有较好的可重复性，能够保证不同传感器之间性能的一致性。四、结论本研究成功制备了一种基于MWCNTs和AuNP的阪崎肠杆菌免疫传感器。通过对MWCNTs进行预处理和AuNP的修饰，显著提高了电极的电子传导性和生物相容性，增强了免疫传感