【《电镜技术发展三维重构研究文献综述》5700字】

电镜技术发展三维重构研究文献综述1.1电镜显微镜概述电子显微镜（electronmicroscopy，EM)）是现代生命科学、材料科学和动植物学等研究必不可少的一种科学仪器。1933年德国科学家ErnstRuska和MaxKnoll研制出了第一台分辨率超越可见光的电子显微镜-透射电子显微镜。随后1937年，Mill和Klaus通过该电镜获得了第一张细菌的图像，分辨率达25nm，实验证实了电镜的分辨率超过光学显微镜。1939年世界上第一台商用电子显微镜面世，其分辨率优于10nm。1986年Ruska和扫描隧道显微镜的发明者GerdkBinning和HeinrichRohere共同获得了诺贝尔物理奖，同时，透射电子显微镜被誉为“20世纪最重要的发明之一”。经过一个世纪技术的发展，透射电子显微镜的分辨率已经可以的达到0.1-0.2nm，帮助人们实现了超微观察世界的能力。特别是近年三维重构计算方法和新型电子探测器的出现，让冷冻电镜的生物结构学对蛋白质的解析能力达到了近原子水平ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Glaeser,2016;Rodriguezetal.,2015)。同时2017年的诺贝尔奖颁给了瑞士、美国和英国三位科学家JacquesDubochet、JoachimFrank和RichardHenderson，以资奖励他们在“研发出冷冻电镜，用于溶液中生物分子结构的高分辨率测定”工作中所做出的贡献。电子显微镜与光学显微镜成像原理基本一致，但是所用光源不同，电子显微镜的光源为电子束，电磁场为透镜，光学显微镜的光源为照明光源。下面我将简单介绍两种电镜的原理和在生命科学领域中的应用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Lucic</Author><Year>2013</Year><RecNum>983</RecNum><DisplayText>(Lucicetal.,2013)</DisplayText><record><rec-number>983</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vrwdadt98e5druedp2b5e2dc9wz2des0w22f"timestamp="1614674813">983</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Lucic,V.</author><author>Rigort,A.</author><author>Baumeister,W.</author></authors></contributors><auth-address>Max-Planck-InstituteofBiochemistry,AmKlopferspitz18,82152Martinsried,Germany.</auth-address><titles><title>Cryo-electrontomography:thechallengeofdoingstructuralbiologyinsitu</title><secondary-title>JCellBiol</secondary-title></titles><periodical><full-title>JCellBiol</full-title></periodical><pages>407-19</pages><volume>202</volume><number>3</number><edition>2013/08/07</edition><keywords><keyword>*CryoelectronMicroscopy</keyword><keyword>DNA/*chemistry</keyword><keyword>*Imaging,Three-Dimensional</keyword><keyword>NucleicAcidConformation</keyword><keyword>ProteinConformation</keyword><keyword>Proteins/*chemistry</keyword><keyword>*Tomography</keyword></keywords><dates><year>2013</year><pub-dates><date>Aug5</date></pub-dates></dates><isbn>1540-8140(Electronic) 0021-9525(Linking)</isbn><accession-num>23918936</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/23918936</url></related-urls></urls><custom2>PMC3734081</custom2><electronic-resource-num>10.1083/jcb.201304193</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>(Lucicetal.,2013)。透射电子显微镜是直接收集透过样品的电子束成像。透射电子显微镜主要有三部分组成。分别是镜筒、真空系统和电子学系统。镜筒主要由照明系统、成像系统和观察记录系统组成。照明系统主要包括电子枪和聚光镜。电子枪是TEM的电子源，位于电镜顶端，可以产生稳定加速电子。电子枪种类包括发夹式钨灯丝、六硼化镧（LaB6）电子枪和场发射电子枪。聚光镜的作用是将电子枪所发射出来的电子束会聚到样品表面，调节样品表面处的电子束的孔径角、电流密度和光斑直径。现代电子显微镜都有双聚光镜系统。第一聚光镜是短焦距的强磁透镜，将交叉点缩小成像。第二聚光镜是长焦距弱磁透镜，控制照明束孔径角，调节亮度。成像系统由样品室和三级物镜（物镜、中间镜和投影镜）组成。样品室垂直方向在第二聚镜下方，样品插入有侧插或者底插的方式。样品室可以按照特殊的加热和制冷附件。物镜可以对样品放大和成像，是影响TEM分辨率的关键部件。物镜光阑要尽可能的靠近样品，挡住散射电子，提高图像反差。中间镜是控制终成像总放大倍数的弱透镜，高分辨率的TEM有两个中间镜。投影镜位于镜筒最下方，放大倍数是可变或者固定。观察记录系统位于投影镜的下方，有观察窗和摄影室。观察室内的荧光屏，由于含有硫化锌等荧光物质，可以在电子束照射下呈现终像。近年透射电镜的成像记录系统都是通过（Charge-CoupledDevice，CCD）相机快速拍照。扫描电子显微镜（SEM）的工作原理是从电子枪发射出的电子束在样品上进行逐点扫描，获得的电子信号被相应的探测器接收。经过放大和处理后所获得的样品图像。SEM图像观察的特点是视野大，景深长，成像直观、图像立体感强等。目前，扫描电镜的分辨率可以达到0.2nm，加速电压可在1-50kv范围。SEM主要有三个组成部分：镜筒、真空系统和电子系统ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Siew</Author><Year>1981</Year><RecNum>985</RecNum><DisplayText>(SiewandGoldstein,1981)</DisplayText><record><rec-number>985</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vrwdadt98e5druedp2b5e2dc9wz2des0w22f"timestamp="1614675075">985</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Siew,S.</author><author>Goldstein,M.L.</author></authors></contributors><titles><title>Scanningelectronmicroscopyofmucosalbiopsiesofthehumanuppergastrointestinaltract</title><secondary-title>ScanElectronMicrosc</secondary-title></titles><periodical><full-title>ScanElectronMicrosc</full-title></periodical><pages>173-81</pages><volume>4</volume><edition>1981/01/01</edition><keywords><keyword>Adult</keyword><keyword>Biopsy</keyword><keyword>DigestiveSystem/*ultrastructure</keyword><keyword>Duodenitis/pathology</keyword><keyword>Duodenum/*ultrastructure</keyword><keyword>Esophagus/*ultrastructure</keyword><keyword>GastricMucosa/*ultrastructure</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>IntestinalMucosa/*ultrastructure</keyword><keyword>Male</keyword><keyword>Microscopy,Electron,Scanning/methods</keyword><keyword>Microvilli/ultrastructure</keyword><keyword>MucousMembrane/*ultrastructure</keyword></keywords><dates><year>1981</year></dates><isbn>0586-5581(Print) 0586-5581(Linking)</isbn><accession-num>7347420</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/7347420</url></related-urls></urls></record></Cite></EndNote>(SiewandGoldstein,1981)。镜筒部分根据功能可以分为电子探针系统和样品室。电子探针系统中包括电子枪、磁透镜和扫描线圈。电子枪是SEM的电子光源，可以发射电子探针。电子枪种类同TEM类似，不再赘述。磁透镜主要起到缩小光斑的作用。一般SEM有三个磁透镜。由于磁透镜存在一定的像散，因此一般都会装有消像散器。扫描线圈是SEM重要的工作部件。通常由双偏转线圈组成，放置于末透镜的上方。扫描线圈可以控制电子探针的扫描范围和图像放大倍率。样品室位于镜筒的下方，样品台可以进行水平移动，倾斜和转动。同时可以装冷阱、加热等附件。样品室在仪器工作时为真空状态。真空系统和电子系统同TEM类似，不再本文中赘述。不同之处在于电子信号成像系统。SEM此系统的工作原理是电子探针和样品产生的信号（其中二次电子信号最好）被二次电子探头收集放大和处理，最后在显像管（长余辉荧光屏和短余辉荧光屏）显示并记录。根据透射电子显微镜的工作原理可知，电镜样品必须满足一些基本条件才可以进行观察。首先TEM观察的样品必须是干燥无水的，才能保持样品室内的真空和洁净度。其次，样品厚度不能超过其发射电压的穿过的能力，一般认为在加速电压为80kv左右时，样品厚度为60-80nm为宜。再次，样品反差要强才能获得相应的超微结构信息。最后，样品可耐受住电子束的轰击，并且在观察过程中不变形和升华。因此，介于以上因素，发展了一种对生物样品进行超微解剖的方法：超薄切片法（Ultrathinsectioning）。超薄切片法是经典、最常用的一种TEM制样方法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Kuo</Author><Year>2014</Year><RecNum>980</RecNum><DisplayText>(Kuo,2014)</DisplayText><record><rec-number>980</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vrwdadt98e5druedp2b5e2dc9wz2des0w22f"timestamp="1614662973">980</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Kuo,J.</author></authors></contributors><auth-address>UnivWesternAustralia,CtrMicroscopyCharacterizat&Anal,Crawley,WA,Australia</auth-address><titles><title>ElectronMicroscopyMethodsandProtocolsThirdEditionPreface</title><secondary-title>ElectronMicroscopy:MethodsandProtocols,3rdEdition</secondary-title><alt-title>MethodsMolBiol</alt-title></titles><alt-periodical><full-title>Drosophila:MethodsandProtocols,2ndEdition</full-title><abbr-1>MethodsMolBiol</abbr-1></alt-periodical><pages>Vii-Viii</pages><volume>1117</volume><dates><year>2014</year></dates><isbn>1064-3745</isbn><accession-num>WOS:000341167200001</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000341167200001</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>Book_Doi10.1007/978-1-62703-776-1</electronic-resource-num><language>English</language></record></Cite></EndNote>(Kuo,2014)。细胞的基本组成成份多为C、H、O、N等原子序数较低元素组成，并且含有丰富的水分，样品形态较大等因素都可以导致无法获得样品超微信息。因此超薄切片法的出现极大的推进了生命科学的发展，打开了人们对超微结构世界的探索。图1.19透射电子显微镜原理示意图展示了透射电子显微镜的工作原理图及三维电镜数据收取原理。电子束从上方经过透镜系统到达信号收集系统，最终被CCD所记录信号，获得图像信息（图片来源：/Html/5-1000072_29153.htm）。1.2电镜的样品制备方法常规的样品制备方法繁多，主要有常温化学样品制备方法和冷冻样品制备方法。下面我将逐一对这两种方法进行简述。常温化学样品制备方法主要是通过化学试剂的作用对样品进行固定杀死，并且把组织或者细胞的活体状、结构和成份都保存下来，最终获得原始样品信息。主要步骤如下：取材与固定。样品取材要秉持动作快速、样品损伤小、低温操作和大小事宜的特点。最大程度减小这个过程出现的组织自溶和组织破损。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂类和其它大分子物质发生交联。常用的固定试剂有戊二醛（Glutaraldehyde，GA）、锇酸（OsmiumTetroxide，OsO4）、多聚甲醛（Paraformaldehyde，PFA）和高锰酸钾（PotassiumPermanganate,KMnO4）等。不同固定剂具有不同的优缺点，没有一种固定剂可以全能的保存住细胞内的组分，因此需要根据实验目的选择相应的固定剂。目前常用的固定剂使用方式是GA和OsO4双固定，先后顺序为GA、缓冲清洗、OsO4。二者联合使用可以固定样品大部分结构信息。漂洗和脱水。漂洗的目的是清除残留在组织内的固定液，避免沉淀物对超微结构的干扰。常用的漂洗液有磷酸盐缓冲液和二甲砷酸盐缓冲液。脱水是将去除细胞组织内多余水分的过程。脱水剂一般是用既能和水，也能和包埋介质单体相混合的液体替代样品中所有游离态的水。常用的脱水剂有乙醇和丙酮。浸透与包埋。浸透是将组织细胞中的脱水剂逐渐被包埋剂替换掉的过程。具体的浸透时间、脱水剂和包埋剂比例根据不同的样品选择各异，例如植物样品由于含有细胞壁成分，浸透的时间就会相对较长。包埋是最后将浸透好包埋剂的样品固定到相应的模具中，待高温或低温聚合后便可进行超薄切片。常用的包埋剂有环氧树脂类（例如Epon812和Suprr）和水溶性树脂类（例如LRWhite和Lowicryls）。常温样品化学固定方法稳定，技术成熟，是目前应用最广泛的样品制备方法之一，但是由于固定剂不会固定保存好结构中所有的蛋白质、脂类和核酸等成分，会出现结构成分抽提、蛋白质成分丢失等现象。例如，含有丰富脂肪类的样品，在化学固定后脂类还有一定的流动性，因此最终结果会出现组织抽提的现象ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(McDonaldandAuer,2006;PaulandBeveridge,1992)。因此，为了更好的观察生物样品的形貌，发展了一种新的制样方法—高压冷冻样品制备方法。高压冷冻（HighPressureFreezing,HPF）样品制备方法是上世纪60年代提出的一种新的样品制备方法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Studer</Author><Year>2001</Year><RecNum>1009</RecNum><DisplayText>(Studeretal.,2001)</DisplayText><record><rec-number>1009</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vrwdadt98e5druedp2b5e2dc9wz2des0w22f"timestamp="1614751797">1009</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Studer,D.</author><author>Graber,W.</author><author>Al-Amoudi,A.</author><author>Eggli,P.</author></authors></contributors><auth-address>UnivBern,InstAnat,CH-3000Bern9,Switzerland 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10.3389/neuro.04.004.2009</electronic-resource-num><language>English</language></record></Cite></EndNote>(Kubotaetal.,2009)。应用这种方法，Sun等人解析了果蝇力感受器MO处NompC蛋白的规律性排布，为NompC蛋白功能以及钟型受体感受机械刺激的工作机制研究提供了可靠的结构信息ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(Sunetal.,2019)。扫描电子显微镜三维重构方法。主要包括应用以下三种仪器：场发射扫描电子显微镜（FieldEmissionScanningMicroscopy，FE-SEM）、内置切片机扫描电子显微镜(Serialblocksurfacescanningelectronmicroscopy，SBF-SEM)和聚焦离子束连续切片扫描电镜(Focusedionbeamserialblockfacescanningelectronmicroscopy，FIB-SEM)。FE-SEM方法主要是处理过的样品经过超薄切片机获得连续的切片，并按照顺序置于导电胶带上，放置于扫描电镜中进行图像数据采集。这种方法的优点在于数据采集自动化程度高，不需要人工耗费时间等待，样品可以反复成像保存。缺点是数据量较大，需要较强的计算能力；同时图像分辨率不高，连续超薄切片的获得也是技术难点ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Bogner</Author><Year>2007</Year><RecNum>1029</RecNum><DisplayText>(Bogneretal.,2007)</DisplayText><record><rec-number>1029</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vrwdadt98e5druedp2b5e2dc9wz2des0w22f"timestamp="1614770731">1029</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Bogner,A.</author><author>Jouneau,P.H.</author><author>Thollet,G.</author><author>Basset,D.</author><author>Gauthier,C.</author></authors></contributors><auth-address>INSA,UMRCNRS5510,GrpEtudesMetPhys&PhysMat,F-69621Villeurbanne,France 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10.3389/fncir.2014.00068</electronic-resource-num><language>English</language></record></Cite></EndNote>(Hayworthetal.,2014)。FIB-SEM是近年应用比较广泛的一种三维重构仪器。特别是对于相对体积较小的组织和细胞。这种方法主要是把镓离子照射到样品表面，去除掉生物样品表面的树脂，电子束获得相应的表面信息，根据实验设置每次去除样品的厚度，重复操作，即可最终得到连续的样品信息，数据经过处理后能够得到结构的三维图ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA(BoergensandDenk,2013;Drobneetal.,2005)。这种方法的优点在于可精准控制每层去除样品厚度，即Z轴分辨率稳定；不需要连续切片技术；理想分辨率3nm（实验中多为20-50nm）；理想分辨率3nm（实验中多为20-50nm）；缺点在于对样品的结构识别区域不精准，需要技术人员对样品信息掌握非常清楚；可获得样品的XY图1.223D重构数据采集的不同方案TEM观察连续超薄切片，图像对中后进行密度分割和建模。利用电子断层扫描技术收集±70°系列倾转角度的二维投影，图像对中、三维重构后建模ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Miranda</Author><Year>2015</Year><RecNum>1013</RecNum><DisplayText>(Mirandaetal.,2015)</DisplayText><record><rec-number>1013</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vrwdadt98e5druedp2b5e2dc9wz2des0w22f"timestamp="1614754294">1013</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Miranda,K.</author><author>Girard-Dias,W.</author><author>Attias,M.</author><author>deSouza,W.</author><author>Ramos,I.</author></authors></contributors><auth-address>LaboratoriodeUltraestruturaCelularHerthaMeyer,InstitutodeBiofisica,CarlosChagasFilhoandInstitutoNacionaldeCienciaeTecnologiaemBiologiaEstruturaleBioimagens-UniversidadeFederaldoRiodeJaneiro,RiodeJaneiro,Brazil. DiretoriadeMetrologiaAplicadaaCienciasdaVida,InstitutoNacionaldeMetrologia,QualidadeeTecnologia(INMETRO),Xer,e,m,RiodeJaneiro,Brazil. LaboratoriodeBioquimicadeInsetos,InstitutodeBioquimicaMedica,LeopoldodeMeis-UniversidadeFederaldoRiodeJaneiro,RiodeJaneiro,Brazil.</auth-address><titles><title>Threedimensionalreconstructionbyelectronmicroscopyinthelifesciences:Anintroductionforcellandtissuebiologists</title><secondary-title>MolReprodDev</secondary-title></titles><periodical><full-title>MolReprodDev</full-title></periodical><pages>530-47</pages><volume>82</volume><number>7-8</number><edition>2015/02/06</edition><keywords><keyword>Imaging,Three-Dimensional/*methods</keyword><keyword>Microscopy,Electron/*methods</keyword></keywords><dates><year>2015</year><pub-dates><date>Jul-Aug</date></pub-dates></dates><isbn>1098-2795(Electronic) 1040-452X(Linking)</isbn><accession-num>25652003</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/25652003</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1002/mrd.22455</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>(Mirandaetal.,2015)。3D重构数据采集的不同方案(Mirandaetal.,2015)（A）TEM观察连续超薄切片，图像对中后进行密度分割和建模。（B）利用电子断层扫描技术收集±70°系列倾转角度的二维投影，图像对中、三维重构后建模。（C）（D）（E）利用SEM观察连续超薄切片。（C）将连续超薄切片收集在硅片上，在背散射模式下成像；（D）利用SBF/SEM制样，SEM内置钻石刀进行切片；（E）利用FIB-SEM制样，FIB将样品表面的树脂去除，观察新形成的表面。将SEM获得的图像反色，图像对中、密度分割、三维渲染。面积不大，不适合做大面大尺度样品三维重构ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Uchic</Author><Year>2006</Year><RecNum>1028</RecNum><DisplayText>(Uchicetal.,2006)</DisplayText><record><rec-number>1028</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="vrwdadt98e5druedp2b5e2dc9wz2des0w22f"timestamp="1614769160">1028</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Uchic,M.D.</author><author>Groeber,M.A.</author><author>Dimiduk,D.M.</author><author>Simmons,J.P.</author></authors></contributors><auth-address>USAF,Mat&MfgDirectorate,WrightPattersonAFB,OH45433USA OhioStateUniv,DeptMatSci&Engn,Columbus,OH43210USA</auth-address><titles><title>3Dmicrostructuralcharacterizationofnickelsuperalloysviaserial-sectioningusingadualbeamFIB-SEM</title><secondary-title>ScriptaMaterialia</secondary-title><alt-title>ScriptaMater</alt-title></titles><periodical><full-title>ScriptaMaterialia</full-title><abbr-1>ScriptaMater</abbr-1></periodical><alt-periodical><full-title>ScriptaMaterialia</full-title><abbr-1>ScriptaMater</abbr-1></alt-periodical><pages>23-28</pages><volume>55</volume><number>1</number><keywords><keyword>microstructure</keyword><keyword>focusedionbeam(fib)microscopy</keyword><keyword>ion</keyword><keyword>microscopy</keyword></keywords><dates><year>2006</year><pub-dates><date>Jul</date></pub-dates></dates><isbn>1359-6462</isbn><accession-num>WOS:000237762400005</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000237762400005</url></related-urls></urls><electronic-res