CN119487175A 包含杜氏盐藻的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶的生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的微生物以及使用其生产类胡萝卜素或类视黄醇的方法 （Cj第一制糖株式会社）

2024.11.22PCT/KR2022/0110472022.07.27WO2023/182582KO2023.09.28KCCM12972P2021.04.09包含杜氏盐藻的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶质的微生物以及使用其生产类胡萝卜素或类视萝卜素为前体的物质的能力的耶氏酵母属微生以及该耶氏酵母属微生物或其培养物在生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质中22.根据权利要求1所述的微生物，其中所述牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶由SEQIDNO:913.根据权利要求1所述的微生物，其中所述牻牛儿牻将由所述耶氏酵母属微生物产生的视黄醇转化为除视黄醇以外含权利要求1至9中任一项所述的耶氏酵母属微生物述微生物具有通过表达来自杜氏盐藻的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶来生产类胡萝卜素或以3[0001]本公开涉及具有生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的能力的耶氏酵母属微生物，该微生物表达来自杜氏盐藻(Dunaliellasalina)的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合[0006]本公开中要解决的问题是提供生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的[0008]本公开的一个目的是提供具有生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的[0009]本公开的另一个目的是提供使用耶氏酵母属微生物生产类胡萝卜素或以类胡萝[0010]本公开的另一个目的是提供用于生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质[0011]本公开的另一个目的是提供耶氏酵母属微生物在生产类胡萝卜素或以类胡萝卜4[0013]本公开可以通过将来自杜氏盐藻的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶基因导入耶氏酵母[0014]图1显示了分别导入了来自各种微生物的GGPP合酶基因的菌株的摇瓶试验的结和引用了许多论文和专利文件。引用的论文和专利文件的公开内容通过引用整体并入本[0017]本公开的一个方面提供了具有生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的合成的酶。牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶的底物可以是异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦[0020]本公开的GGPPS蛋白的氨基酸序列可以是具有牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶活性的蛋[0022]在一个实施方案中，本公开的GGPPS蛋白可包含、具有SEQIDNO:80％或更高同源性或同一性的氨基酸序列或由SEQIDNO:91或与其具有80％或更高同源[0023]此外，尽管本公开的GGPPS蛋白的一个实施方案被描述为包含SEQIDNO:91的蛋[0024]具体地，本公开的GGPPS蛋白可包5要该氨基酸序列具有这样的同源性或同一性并且表现出与上述和/或C_末端的不改变蛋白质功能的序列、天然发生的突变、其沉默突变或保守取代的那[0026]“保守取代”指一个氨基酸被另一个具有相程序(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Riceetal.,[F.,][ETAL,JMOLECBIOL215]:403(1990)；GuidetoHugeComputers,MartinJ.Bishop,[ED.,]AcademicPress,SanDiego,1994和[CARILLOETA/.](1988)SIAMJ[0030]多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以通过使用GAP计算机程序(例如似的比对符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中阵(对于同一性包含值1，对于非同一性包含值0)和加权比较矩阵(或EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵)，如由Schwartz和Dayhoff编辑的AtlasOfProteinSequenceAndStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,pp.353_3586al.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ndEdition,ColdSpringHarborProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,[0037]在一个实施方案中，由SEQIDNO:1的核苷酸序列组成的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合的密码子，多核苷酸或基因可在不改变多肽氨基酸序列的范围内在编码区具有各种修饰。甚至更具体地是99％或更高的同源性或同一性)能够相互杂交，而具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的多核苷酸则不能相互杂交；或者Southern杂交的普通洗涤条7列互补的分离的核酸片段以及与其基本相似的核酸杜氏盐藻的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶基因或编码来自杜氏盐藻的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合8[0050]在一个实施方案中，与不表达本公开的来自杜氏盐藻的GGPPS的耶氏酵母属微生物相比，表达本公开的来自杜氏盐藻的GGPPS的耶氏酵母属微生物可以具有增强的牻牛儿[0051]在一个实施方案中，与没有导入来自杜氏盐藻的GGPPS基因的耶氏酵母属微生物相比，导入了本公开的来自杜氏盐藻的GGPPS基因的耶氏酵母属微生物可以具有增强的牻盐藻的GGPPS基因编码的本公开的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶的耶氏酵母属微生物可以具有的GGPPS基因或多核苷酸以及包含该基因或多核苷酸的载体的微生物；经修饰以表达本公开的来自杜氏盐藻的GGPPS蛋白或GGPPS基因的微生物；表达本公开的来自杜氏盐藻的[0055]本公开的菌株可以是天然具有牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶或具有生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的能力的微生物；或其中通过将本公开的来自杜氏盐藻的野生型微生物或牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶未修饰焦磷酸合酶基因(SEQIDNO:10)的耶氏酵母属微生物或其中没有导入来自杜氏盐藻的牻胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的能力的重组菌株可以是具有增强的生产类胡萝9[0057]例如，与不包含来自杜氏盐藻的GGPPS(例如，SEQIDNO:9为前体的物质的能力的菌株可以是具有增强的生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的饰的微生物是用于比较生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的能力是否增强的传变异改变性状之前的菌株。例如，未修饰的微生物可以是其中不表达来自杜氏盐藻的[0061]在本公开的微生物中，多核苷酸的部分或全部修饰可通过(a)使用载体在微生物中进行染色体插入的同源重组或使用工程核酸酶(例如CRISPR_Cas9)进行基因组编辑和/[0062]本公开的微生物可以是经修饰以进一步包含编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(crtYB)和八氢番茄红素去饱和酶(crtI)蛋白质的多核苷酸，从而表现出该蛋白质活案中，编码番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶或八氢番茄红素去饱和酶的多核苷酸可以分别具有或可以分别包含基于在国家生物技术信息中心搜索数据库(NCBI)注册的核苷酸红素环化酶/八氢番茄红素合酶或八氢番茄红素去饱和酶的多核苷酸可以分别具有或包含地，多核苷酸可以具有或可以包含与SEQIDNO:59或SEQIDNO:60的序列具有80％或更100％同源性或同一性的核苷酸序列，或者可以由或可以基本上由与SEQIDNO:59或SEQ[0063]本公开的微生物可以是经修饰以进一步包含编码β一胡萝卜素15,15’一加氧酶加可以包括表现出最初不具有的活性和表现出与内源活性或修饰前的活性相比改善的活状改变前的亲本菌株或未修饰的微生物原本具有的特定多肽的活性和/或浓度(表达水平)[0065]这种增强可以通过导入外源多肽或基因或增强多肽的内源活性和/或浓度(表达水平)来实现。多肽活性的增强可以通过相应多肽的活性程度和表达水平的增加或相应多Vol.2.116,Sambrooketal.Molecu[0072]5)修饰编码多肽的多核苷酸序列以增强多肽的活性(例如，修饰多肽基因的多核[0078]1)编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数的增加可以通过向宿主细胞中导入载体[0079]2)用显示强活性的序列替换编码多肽的染色体上的基因表达调控区(或表达控制[0082]4)和5)氨基酸序列或多核苷酸序列的修饰可以是由于多肽的氨基酸序列或编码[0083]6)导入显示多肽活性的外源多核苷酸可以是将编码显示与多肽相同或相似活性[0084]7)编码多肽的多核苷酸的密码子优化可以是内源多核苷酸的密码子优化以增加[0086]多肽活性的这种增强可以是基于野生型或修饰前微生物菌株中表达的多肽的活[0087]在一个实施方案中，本公开的微生物可以通过导入来自杜氏盐藻的GGPPS基因而该方法包括在培养基中培养本公开的耶氏酵[0102]通过本公开的培养产生的类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质可以被释放[0103]本公开的生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的方法可以进一步包括[0104]本公开的生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的方法可以进一步包括从培养耶氏酵母属微生物得到的培养基(其中已经进行了培养的培养基)或从本公开的耶并且可以通过使用本领域已知的合适方法从培养基或微生物中回当本公开的生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的方法包括回收步骤和纯化步[0107]本公开的生产类胡萝卜素的方法可以进一步包括将由本公开的耶氏酵母属微生[0108]本公开的生产类视黄醇的方法可以进一步包括将由本公开的微生物产生的视黄骤或回收步骤之后还可以包括转化步骤。可以使用本领域已知的合适方法进行转化步骤。[0110]本公开的另一方面提供了用于生产类胡萝卜素或以类胡萝卜素为前体的物质的[0113]本公开的又一方面提供了本公开的微生物或其培养物在生产类胡萝卜素或以类于红发夫酵母的番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(crtYB)和八氢番茄红素去饱和酶(crtI)基因插入高脂肪酵母解脂耶氏酵母CC08_0125(登录号KCCM12972P)菌株的基因组[0120]关于crtYB，基于在国家生物技术信息中心搜索数据库(NCBI)注册的核苷酸序列苷酸序列(GenBank:AY177424.1)获得了SEQIDNO:60的多核苷酸。crtYB和crtI的多核苷酸序列由Macrogen分别以TEFINtp_crtYB_CYC1t(SEQIDNO:61)和TEFINtp_crtI_CYC1t(SEQIDNO:62)的形式合成。使用解脂耶氏酵母的URA3基因(SEQIDNO:63)作为选择标记，设计插入MHY1(YALI0B21582g)基因位点的盒。使用合成的crtYB和crtI基因和将使用SEQIDNO:76和SEQIDNO:77的引物确认了盒插入到基因组中的菌落铺在5_FOA固[0125]设计用于用TEFINt启动子替换通过实施例1_1制备的菌株的3_羟基_3_甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的天然启动子(SEQIDNO:78)区域的盒，并且使用KCCM12972P含尿嘧啶的固体培养基(YLMM1)上形成。将使用SEQIDNO:89和SEQIDNO:90的引物确认[0133]实施例2.来自杜氏盐藻的牻牛儿牻牛儿焦磷酸合酶(GGPP合酶)基因的插入菌株[0134]如下将来源于不同来源的四种类型的GGPP合酶基因(下文称为GGPPS基因)导入实施例1中制备的菌株CC08_1023的基[0136]为了将来自杜氏盐藻的GGPPS基因(下文称为Ds体中，基于在国家生物技术信息中心搜索数据库(NCBI)注册的核苷酸序列(GenBank:适用于解脂耶氏酵母，并且基因(SEQIDNO:4)由Macrogen以TEFINtp_密码子优化的插入LIG4(YALI0D21384g)基因[0137]使用合成的Ds.GGP基因和KCCM12972P的基因组DNA作为模板，并分别以表3所示SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、SEQIDNO:1IDNO:26、以及SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物对左侧同源区、TEFINt启动子、的固体培养基(YLMM1)上形成。将使用SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物确认了盒插入[0143]为了将来自红法夫酵母的crtE变体基因crtEM1(SEQIDNO:6,Hongetal.,AppliedMicrobiologyandBiotechnology,2019Jan；103(1):211_223用解脂耶氏酵母的URA3基因(SEQIDNO:5)[0144]使用合成的crtEM1DNA和KCCM12972P的基因组DNA作为模板，并分别以表4所示SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、的固体培养基(YLMM1)上形成。将使用SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物确认了盒插入[0150]为了将来自酿酒酵母的BTS1基因(下文称为Sc.BTS1)插入解脂耶氏酵母的染色体中，基于在KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)中注册的核苷酸序列(YPL069C)，获得BTS1的SEQIDNO:8的多核苷酸。该基因是使用BTS1的多核苷酸由Macrogen以TEFINtp_Sc.BTS1_TDH3t(SEQIDNO:9)的形式合成的。使用解脂耶氏酵母的[0151]使用合成的Sc.BTS1DNA和KCCM12972P的基SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、SEQIDNO:1IDNO:26、以及SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物对左侧同源区、TEFINt启动子、的固体培养基(YLMM1)上形成。将使用SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物确认了盒插入[0156]为了将来自解脂耶氏酵母的GGS1基因(下文称为Yl.GGS1)插入解脂耶氏酵母的染色体中，基于在KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)中注册的核苷酸序列以TEFINtp_Yl.GGS1_TDH3t(SEQIDNO:11)的形式合成的。使用解脂[0157]使用合成的Yl.GGS1基因和KCCM12972P的基SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、SEQIDNO:1IDNO:26、以及SEQIDNO:27和SEQIDNO:28的引物对左侧同源区、TEFINt启动子、的固体培养基(YLMM1)上形成。将使用SEQIDNO:29和SEQIDNO:30的引物确认了盒插入株、导入Sc.BTS1的菌株和导入Yl.GGS1的菌株中的β_胡萝卜素浓度分别为5.49mg/L、221.22mg/L。同样地，与CC08_1023菌株相比，在导入GGPPS的情况下，角鲨烯减少了[0171]为了将来自未培养的海洋细菌66A03的β_胡萝卜素15,15’加氧酶(下文称为Mb.BCO)基因导入解脂耶氏酵母的染色体，基于在UniProt知识库(UniProtKB)中注册的氨Mb.BCO_CYC1t(SEQIDNO:13)的形式合成的。使用解脂耶氏酵母的URA[0178]对总共5个物种进行摇瓶试验，包括实施例4中获得的菌株和实施例1中获得的亲本菌株CC081023。将每个菌株以2的初始OD接种到含有20ml酵母提取物蛋白胨葡萄糖(DMSO，Sigma)，并通过在55℃搅拌(2000rpm)10分钟来破碎细胞。另外，