CN119487189A 新的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体及使用其产生5-肌苷酸的方法 （大象株式会社）

2024.12.30PCT/KR2023/0129682023.08.31WO2024/210280KO2024.10.10KCCM13339P2023.03.29新的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体及使用其本发明涉及新的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列中一个或更丙酮酸羧化酶变体的重组微生物可有效地产生21.磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体，其中SEQIDNO:4的氨基酸序列中第472和673位处的2.权利要求1所述的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体，其由SEQIDNO:2的氨基酸序列组3[0003]用于产生5’肌苷酸的方法包括对从酵母细胞中提取的核糖组技术应用于广泛用于产生有用物质例如核酸或L一氨基酸的微生物(例如大肠杆菌[0014]本发明的一个方面提供了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体，其中SEQIDNO:4的氨基酸序列中第472和673位处的一个或更多个氨基酸被其他氨基酸氧化碳的反应，并且其可以是由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成并具有磷酸烯醇丙酮酸羧4[0016]关于磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸和蛋白质序列的信息可从已知的序列数据库[0017]根据本发明的一个实施方案，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可由SEQIDNO:3的核[0018]根据本发明的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列或编码其的核苷酸序列可包过将参考核苷酸序列或氨基酸序列与任何其他核苷酸序列或氨基酸序列进行比对以尽可结构和/或化学特性的另一个氨基酸替换。保守替换可对蛋白质或多肽的活性具有极小影IDNO:4的氨基酸序列中第472位处的脯氨酸被丝氨酸替换，并且第673位处的甘氨酸被天[0024]更具体地，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体可包含与SEQIDNO:2的氨基酸序列氨基酸序列。5[0027]根据本发明的一个实施方案，多核苷酸可包含编码SEQIDNO:2的氨基酸序核苷酸序列。[0029]本发明的又一个方面提供了包含编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体的多核苷酸的[0030]本发明的又一个方面提供了包含磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体或多核苷酸的转化核酸序列在插入到宿主细胞基因组之后表达的载体和/或允许核酸序列独立表达的载体。该载体包含可操作地连接的必需调节元件，使得插入的基因可以表达。本文中使用的术语“可操作地连接”意指目的基因及其调节序列以使基因能够表达的方式功能性地连接在一6菌(Corynebacteriumcallunae)、Corynebacteriumsuranareeae、Corynebacteriumlubricantis、Corynebacteriumdoosanense、有效棒状杆菌(Corynebacterium7盐棒状杆菌(Corynebacteriumhalotolerans)、蝶科棒状杆菌(Corynebacteriumspheniscorum)、弗氏棒状杆菌(Corynebacteriumfreiburgense)、纹带棒状杆菌(Corynebacteriumstriatum)、犬棒状杆菌(Corynebacteriumcanis)、产氨棒状杆菌caspium、睾丸棒状杆菌(Corynebacteriumtestudinoris)、假性棒状杆菌野生型棒状杆菌属菌株或从野生型微生物突变的棒状杆地，由转化体产生的5’肌苷酸的量可以比由亲本菌株产生的5’肌苷酸的量高至少1％、8且可由本领域技术人员进行适当的修改。针对埃希氏菌属(Escherichiasp.)菌株的培养心以去除生物质并通过离子交换色谱分离所获得[0062]根据本发明的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体是通过替换构成磷酸烯醇丙酮酸羧化9[0066]为了评价磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(SEQIDNO:4)的氨基酸序列中第472位处用丝氨酸(S)替换脯氨酸(P)和第673位处用天冬氨酸(D)替换甘氨酸(G)的变体(SEQIDNO:2)对5’肌苷酸产生的作用，本发明人构建了用于表达磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体的载体和[0068]使用野生型停滞棒状杆菌ATCC6872的基因组DNA作为模板，使用引物1和2的引物72℃下反应5分钟。SEQIDNO.67[0074]将电感受态细胞制备方法(vanderRestetal.方法的修改形式)用作用于转化平板接种到无抗生素平板培养基(含10％蔗糖)上，并选择不具有卡那霉素抗性且能在含[0077]比较亲本菌株KCCM13339P与其中引入了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶变体的突变体菌[0078]将每种菌株(亲本菌株或突变体菌株)以1％体积接种到含有10mL下表2中所示的20.023.2[0087]保藏机构：韩国微