基因工程的操作复习

掌握基因操作的工具01掌握基因操作的基本步骤02了解获取目的基因的方法,掌握PCR技术与细胞内DNA分子复制的异同03掌握基因操作的工具在构建基因表达载体过程中的重要意义04掌握农杆菌转化法的过程,了解其它转基因的方法05掌握目的基因检测的方法06学习目标基因工程的操作基因工程的操作步骤目的基因的检测与鉴定获取目的基因构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞从基因文库中获取目的基因01基因文库包括基因组文库和cDNA文库02工具:限制酶，DNA连接酶03人工合成目的基因04条件是:05基因比较小,且核苷酸序列已知06方法:07从蛋白质合成08反转录法09PCR法10第一步:获取目的基因基因表达载体的构建:a、目的基因标记基因位于基因的首端,是mRNA聚合酶结合位点b、启动子位于基因的末端,终止转录c、终止子它们所处的位置和有什么作用?检测目的基因是否导入受体细胞d、标记基因第三步：将目的基因导入受体细胞

（又称为转化)将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞第四步:目的基因的检测与鉴定检测①导入检测:目的基因是否导入受体细胞方法——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定关于限制酶的问题一般来说，不同的限制酶有不同的识别序列，有不同的切点位置，切出不同的黏性末端，但也有两种特殊情况:1.不同的限制酶有不同的识别序列，但可以切出相同的黏性末端，如以下两种酶处理得到黏性末端均为AATT:酶I识别序列GAATTCCTTAAG酶IIAAAATTTTTTTTAAAA两种酶经常用于同一个基因工程中限制酶的选择使用A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割B.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割C.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割D.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割例题:基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作正确的是BamHⅠ抗四环素基因HinDⅢ变式训练1应选择哪种限制酶?EcoBHinDⅢBamHⅠ限制酶的选择使用限制酶的选择使用变式训练2抗四环素基因EcoBHinDⅢBamHⅠ使用的限制酶EcoBBamHⅠHinDⅢ含四环素的培养基上的生长情况含青霉素的培养基上的生长情况抗青霉素基因×√√×√√不同的限制酶有相同的识别序列，但可以切出不同的黏性末端，如:1酶I2识别序列3GGAATTCCCCTTAAGG4酶II5GGAATTCCCCTTAAGG6黏性末端7GAATTC8AATT9这两种酶不会在同一个基因工程中采用10关于限制酶的问题1.将目的基因导入植物细胞（1)农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞整合植物细胞染色体DNA表达新性状转入农杆菌转移至受体细胞整合到染色体上（2)基因枪法常用于单子叶植物的转化方法基因枪法又称微弹轰击法,是利用压缩气体产生的动力,将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中,使目的基因与其整合并表达的方法。

基因枪法——微弹轰击法特点:成本高适用于单子叶植物胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3)花粉通道法我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

2.将目的基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫早期胚胎新性状动物将目的基因导入动物细胞方法:显微注射法程序:目的基因表达载体提纯取受精卵显微注射受精卵新性状动物常用法:Ca2+处理1常用菌:大肠杆菌2微生物作受体细胞原因:繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少3过程:4Ca2+处理大肠杆菌5感受态细胞6表达载体与感受态细胞混合7感受态细胞吸收DNA83.将目的基因导入微生物细胞比较目的基因导入不同细胞的方法农杆菌转化法显微注射法Ca2+处理法体细胞受精卵原核细胞植物基因工程动物基因工程微生物基因工程常用方法受体细胞方法:检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤)DNA分子杂交过程:.首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（一)、检测2.检测目的基因是否转录出了mRNA方法:抗原抗体杂交分子杂交用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA鉴定（个体生物学水平)检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①原理:②方法:PCR技术原理:前提:原料:优点

过程:PCR扩增仪DNA复制已知目的基因的一段核苷酸序列:以_____方式扩增，

在短时间内大量扩增目的基因指数模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶)；离子变性

复性延伸问题:PCR技术也是合成DNA分子的过程，属于合成反应，是消耗能量的，但图1—8中未提到能量。

12试题中,若指出原料是dCTP、dGTP、dATP、dTTP,则条件中不再另写能量,若原料是四种游离的脱氧核苷酸,则另外还需要ATP提供能量。

3图1—8分析:PCR的原料是dCTP、dGTP、dATP、dTTP。这四种物质并不是必修二中我们熟悉的四种游离的脱氧核苷酸，而是脱氧核苷酸连接上了两个磷酸，和ATP一样，是高能化合物，在PCR过程中是可以提供能量的。

关于PCR技术中的原料和能量PCR技术和DNA分子复制比较PCRDNA分子复制模板相同，均为DNA分子双链原料四种游离的脱氧核苷酸或dCTP、dGTP、dATP、dTTP四种游离的脱氧核苷酸解旋过程高温（90～95℃），不需要酶常温，需要解旋酶DNA聚合酶热稳定DNA聚合酶（Taq酶），最适温度（70～75℃）普通DNA聚合酶，最适温度为常温引物需要不需要03（24-1)×2=30022×（2n-1)(n为循环次数)011个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物?利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取从受体细胞中提取④利用PCR技术利用DNA转录 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥4.下列属于获取目的基因的方法的是()01A、化学合成法

B、基因组文库法

C、CDNA文库法

D.聚合酶链反应3.在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是025.加热至95摄氏度的目的是使DNA中的

断裂，这一过程在细胞内是通过

解旋酶

的作用来完成的。6.当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2个DNA分子，此过程中的原料

，遵循的原则是

。7.Taq酶的特点是（)A.耐强酸B.耐强碱C.耐高温D.最适温度37摄氏度8.请指出PCR技术与DNA复制过程的区别

9.在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是

①双链DNA分子为模板

②ATGTG或TACAC模板链

③四种脱氧核苷酸

④四种核苷酸

⑤DNA聚合酶

⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物

⑧温度变化

⑨恒温A.①③④⑦⑧⑨B.①②④⑥⑦⑧C.①②⑤⑥⑦D.①③⑥⑦⑧D10.在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个)放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个 B.8100个 C.17280个 D.7560个B基因的结构外显子内含子终止子启动子非编码区01原核编码区02真核非编码区03RNA聚合酶结合位点直接分离法供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(鸟枪法)多用于原核生物蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗?人工合成法:基因组文库的构建基因组文库将DNA片段与载体连接用适当的限制酶酶切导入受体菌中储存重组载体一定大小的DNA片段提取某种生物的全部DNAACA、染色体DNA

B、线粒体DNAC、总mRNA

D.tRNA1.构建基因组DNA文库时,首先应分离细胞的01某生物的全套基因就是一个基因文库将含有某种生物不同的许多DNA片段,导入某个生物体内,则这个生物就是一个基因文库含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库2.目的基因可从基因文库中获得,下列有关基因文库的描述正确的是02提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆)转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存cDNA文库的构建-----逆转录法：

非编码区编码区非编码区DNA聚合酶有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码系列。即不含非编码区和内含子思考?真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗?有哪些差异?原核生物基因呢?含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌培养培养培养导入含有氨苄青霉素的完全培养基含有四环素的完全培养基两种培养基均不能生长大肠杆菌

Ca2+

处理细胞形成感受态细胞检测（培养不具有氨苄青霉素

抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌)只有氨苄青霉素抗性基因质粒只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌完全培养基导入接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明:不存活含有四环素的完全培养基证明:大肠杆菌的受体细胞含有目的基因

四环素抗性基因

四环素抗性基因存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来?存活导入接种培养接种培养接种培养接种培养含有四环素的完全培养基完全培养基大肠杆菌不含抗四环素基因证明:不存活含有四环素的完全培养基证明:大肠杆菌含抗四环素基因证明:大肠杆菌的受体细胞含有目的基因

四环素抗性基因

四环素抗性基因完全培养基存活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来?5.目的基因与运载体结合所需的条件有

①同一种限制酶

②具有抗性基因的质粒

③RNA聚合酶

④目的基因

⑤DNA连接酶

⑥四种脱氧核苷酸

⑦ATPA.①②③④⑤⑥⑦B.①②④⑤⑥⑦C.①②③④⑤D.①②④⑤⑦6.（多选)一个基因表达载体的构建应包括A．目的基因B．启动子

C．终止子D．标记基因ABCDD7.下列关于基因