《发酵工程原理与技术（第2版）》全套教学课件

发酵工程原理与技术全套可编辑PPT课件第1章绪论第2章发酵过程的生物学基础第3章培养基及其制备第4章培养基及设备的灭菌第5章空气除菌工艺第6章生产菌种的扩大培养与保藏第7章发酵过程第8章工业发酵染菌的防治第9章固定化细胞发酵第10章基因工程菌的发酵第11章动植物细胞培养第12章固态发酵第13章发酵经济学第一章绪论第一节概述一、基本概念发酵一词的来源

“发酵”（Fermentation）一词是拉丁语“沸腾”（fervere）的派生词，它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时产生气泡的现象。产生气泡的现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。一、基本概念

在生物化学或生理学上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出二氧化碳。同时获得能量，丙酮酸被还原为乳酸而获得能量等等。狭义“发酵”的定义一、基本概念工业上所称的发酵是泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程，它包括厌氧培养的生产过程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产。产品既有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。广义“发酵”的定义生物质原料生物能源精细化学品营养化学品大宗化学品食品与配料酶制剂产品微生物细胞+生物反应器一、基本概念应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。发酵工程的定义二、发酵工程技术系统种子培养系统（上游）原料加工系统（上游）发酵系统（中游）产品分离提取系统（下游）三、发酵工业发酵工业酶制剂有机酸氨基酸酒(酒精)抗生素维生素发酵工业(1.4万亿)相关工业(如：制药,3万亿)基因工程药物重要组成：轻工业生物产业重要作用：生产生活资料支撑产业发展…………三、发酵工业——我国发酵工业现况发酵生产总量为世界大国发酵技术跟跑、伴跑、领跑产量世界第一产品技术水平的不断进步(以柠檬酸和维生素C例)1910年柑橘中提取200mg/L1940年莱氏法二步发酵法46g/L离子束诱变92g/L膜工艺、代谢工程102g/L菌种选育60g/L1913年发现黑曲霉生产23g/L高产菌株筛选127g/L糖化酶工艺160g/L新菌种、新工艺、复合酶180g/L四、发酵工业的关键技术问题关键技术问题1、微生物能够积累最大目的产物的(高产量)条件是什么？2、原料最多被微生物转化为产物(高转化率)的条件是什么？3、微生物最快速度发酵生产目的产物(高生产强度)的条件是什么？工程意义高产量

提高设备利用率、减少提取费用高转化率

降低原料成本、减少环境污染高生产强度

降低设备投资、减少能源消耗学术思想：三者相对统一实现高水平工业发酵关键技术问题的解决途径和方案问题原因根本方案细胞工厂构建和改进发酵过程优化和控制细胞合成能力不足生理特性理解代谢能力调控发酵过程条件不佳最佳条件解析合成过程控制产品转化效率差目的产物产量低生产过程强度小细胞工厂构建与改进：传统技术5适应性进化代谢调控育种2传统诱变筛选1基因工程34代谢工程细胞工厂构建与改进：新一代技术3、基因组高效编辑技术4、高通量和超高通量筛选技术1、系统生物学2、合成生物学发酵过程优化与控制：传统技术5基于代谢通量分析的过程优化基于微生物代谢特性的分阶段培养2基于微生物反应原理的培养环境优化1基于反应动力学的流加发酵34基于辅因子调控的过程优化发酵过程优化与控制：新一代技术计算流体力学模拟并结合细胞生理优化多参数在线检测、实时分析与联动控制统计分析建模、参数预测与风险评估代谢流组学分析与过程优化基于单元精准控制的发酵模式重构技术第二节发酵工程的过去第一阶段1900年前●酒精、醋●使用温度计，比重计和热交换器●分批培养●使用纯酵母培养物(1896),用优质醋接种发酵

第二阶段1900－1940●面包酵母，甘油，柠檬酸和丙酮丁醇●pH离线控制，温度控制●分批和补料培养●应用纯培养技术

第三阶段1940－目前●青霉素，氨基酸，核苷酸，酶●可灭菌的pH和溶氧电极，计算机控制●分批和补料，连续培养开始●菌种筛选程序重要

由食品工业向非食品工业发展发酵工程的过去——发酵工业发展年鉴19第四阶段1960－目前●用烃和和别的贮存物生产单细胞蛋白●计算机控制●连续培养+培养基再循环●生产菌株的遗传工程技术

第五阶段1979－目前●通常微生物不产生的异质化合物，如胰岛素，干扰素●更先进的控制手段和传感器●分批，补料-分批或连续●用基因工程技术将外源基因引入微生物宿主

第六阶段1990－目前●解决能源、资源、环境等问题的工业应用●基因组学、蛋白组学、代谢组学、合成生物学等技术紧密结合代谢控制发酵技术现代生物技术技术与发酵工程发酵工程的过去——发酵工业发展年鉴第三节发酵工程的现在生物技术的三次浪潮1980-19901991-20002001-生物医药公司数量第一次浪潮RedBiotech第二次浪潮GreenBiotech第三次浪潮WhiteBiotech转基因植物工业生物技术现代生物技术产业始于医药领域核心：基因工程应用于药物生产1982年第一种基因工程药物—重组人胰岛素上市，标志着巨大成就核心：转基因技术培育植物新品种，获抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆等1996年转基因大豆、玉米、油菜上市，标志巨大成就21世纪农业品种的90%将通过生物技术改良新崛起有两个巨大的推动力：社会强烈需求:资源、能源、人口、环境问题生物技术的进步:基因组学、蛋白质组学以生物为核心的多学科知识以细胞为基础的多方面技术是合成生物学等基础科学的具体应用是带动性、渗透性很强的综合产业技术致力于把生命科学发现转化为实际的产品、过程、系统和服务，可为化工、能源、材料、轻工、环保、医药、食品等产业链创造新的制造模式和经济形态。在本世纪末之前，生物制造可能占全球制造业产出1/3以上，价值接近

30万亿美元。（2022年9月12日美国白宫官网发布的“国家生物技术和生物制造计划”）工业生物技术世界各国重视工业生物技术世界经合组织（OECD）：工业生物技术是工业可持续发展最有希望的技术之一，2030年35%的化学品和其他工业品将出自生物制造，基于可再生资源的生物经济形态将会形成。英国将“工业生物技术与生物能源”作为三大科学优先权的新战略之一美国国会于2014-2018年投入28亿美元开展工业生物技术研发德国在《生物经济2030国家研究战略》中设立创新型工业生物技术专项超过20国制定了工业生物技术发展战略中国：《国家科学与技术中长期发展规划纲要》将工业生物技术列为前沿技术，生物技术产业被确定为七大战略性新兴产业之一。4、自下而上的酶工程2、合成生物学3、靶向特定物种和基因座的群落编辑1、高通量和超高通量筛选技术一批将对生物技术产业产生巨大影响的技术出现1%7%1%20%54%5%7%4%1%17%发酵产品生产产品类型松脂类制品油脂化学品氨基酸脂肪酸衍生物其他化学衍生物天然产物生物聚合物醇类产品全球生物基精细化学品市场5000万吨生物质原料生物能源精细化学品营养化学品大宗化学品食品与配料酶制剂产品微生物细胞+生物反应器发酵工程工程技术内涵发酵工程是工业生物技术的最重要组成部分解读生物分子元件的结构与功能编辑以微生物为代表的细胞工厂的遗传信息创建全新的、高效的代谢途径对微生物性状与功能的人工控制获得传统化学合成无法或难以获得的新型高价值产品关键技术创新任务大宗发酵产品转型升级传统产业节能减排食品加工过程安全控制功能营养品生物制造……发酵工程正在重塑发酵工业传统分批发酵模式菌球分割多级流加发酵模式柠檬酸是市场需求最大有机酸，我国产量占全球80%以上。发酵产量、转化率、生产强度、粮耗、水耗、电耗均国际领先大宗发酵产品转型升级——柠檬酸发酵：模式改革单菌GOX氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydans

第二步：2菌发酵小菌/KVU普通生酮基古龙酸菌K.vulgare大菌/BME巨大芽孢杆菌B.megaterium第一步：1菌发酵D-葡萄糖D-山梨醇D-山梨糖维生素C古龙酸(2-KGA)高压加氢发酵Ⅰ步化学法发酵Ⅱ步维生素C三菌二步发酵工艺20世纪60年代，中国科学院微生物所发明三菌二步发酵工艺使我国成为世界最大的VC生产国和出口国。该发明国际使用权于1985年以500万美元出售给瑞士罗氏公司(当时中国最大对外技术转让项目)。大宗发酵产品转型升级——维生素C发酵：流程重构三菌二步发酵缺点:能耗、水耗高工艺复杂、稳定性差菌种选育困难。流程重构:一菌一步能耗减少20%水耗减少25%意义：核心技术突破保障维生素C世界强国大宗发酵产品转型升级——维生素C发酵：流程重构小菌/KVU普通生酮基古龙酸菌大菌/BME巨大芽孢杆菌第一步菌/GOX氧化葡萄糖酸杆菌氧化葡萄糖酸杆菌一步发酵菌构建(1)不同表达系统中维生素C合成途径整合与优化(2)吡咯喹啉醌从头合成与再生途径分析及其关键代谢途径重构(3)山梨醇、山梨糖、2-KLG跨膜转运系统强化山梨醇2-酮基-L-古龙酸发酵过程优化大宗发酵产品转型升级——维生素C发酵：流程重构木头生产去皮切碎蒸煮精炼盘磨褐浆洗涤氧法脱木质素漂白分筛清洗浓缩漂白废纸纸板碎浆机械分筛脱墨漂白备料造纸裁纸涂料上色①②④⑤⑥⑦化学浆机械浆废纸浆纸和纸板的制备③生物制浆、纸浆生物漂白、粘胶和树脂去除与控制、混合废纸的脱墨、造纸纤维的生物改性（打浆）、木素的生物降解纸和纸板的制造过程酶技术的应用①②③④⑤⑥⑦主要应用传统产业节能减排——酶技术促进造纸绿色制造染整酶是生物酶法染整的必要条件，包括4种关键酶制剂（聚乙烯醇酶、角质酶、果胶酶、过氧化氢酶）。染整加工是纺织工业重要领域，传统工艺存在水耗大、能耗高、废水处理难等问题。生物酶法染整可节能减排。1吨棉织物100吨水温度90°C废水pH>11、COD3g/L完成染整酶制剂工业发酵和应用1.创制角质酶和PVA酶2.

提高酶耐碱耐高温性能3.

实现高酶活低成本制备4.

实施酶复配和应用传统产业节能减排——酶技术实现染整前处理节能减排处理方式单价传统工艺酶法工艺用量成本(元)用量成本(元)化学试剂及酶消耗NaOH(35%)0.4元/kg56.1kg22.45.1kg2.0精练剂A10元/kg17.0kg169.8--H2O2(100%)1.5元/kg4.3kg6.44.3kg6.4氧漂稳定剂0.9元/kg24.5kg11.512.8kg11.5复合酶24元/kg--1.7kg150精练剂B5元/kg--4.5kg22.4精练剂C10元/kg--6.4kg63.5合计//210.1/255.8能耗水耗电0.8元/度250度200250度200汽200元/吨42吨840024吨4800水3.5元/吨300吨1050204吨714污水处理3.5元/2.5元/吨280吨980180吨450污水排放2.6元/吨280吨728180吨468合计//11358/6632总计//11568/6887.8处理万米布酶法和传统工艺比较酶法比传统工艺成本减少40.5%酶法比传统工艺水耗减少32%酶法比传统工艺能耗减少42.9%工业应用效果传统产业节能减排——酶技术实现染整前处理节能减排我国每年纯棉布产量180

亿米，如果全面推广，可节约324万吨煤，节水1.73亿吨。传统产业节能减排——酶技术实现染整前处理节能减排丙烯酰胺被国际癌症研究中心列为2A类致癌物，即对人类具有潜在致癌性。食品在烘烤、煎炸等高温加工过程中还原糖与氨基酸发生美拉德反应会产生丙烯酰胺。2017年欧盟已制定控制法规。发酵制备的天冬酰胺酶(ASN)可降解美拉德反应的氨基酸前体天冬酰胺。发酵生产天冬酰胺酶用于食品原料处理，可有效减少丙烯酰胺90%。天冬酰胺酶现已是北美市场需求第二的食品酶制剂葡萄糖L-天冬酰胺丙烯酰胺天冬酰胺酶解决食品安全问题——发酵工程技术生产酶制剂降解丙烯酰胺前体普遍存在：广泛存在于多种传统发酵食品中，如各种酒精饮料、酱油、泡菜等。危害性强：高剂量可导致多种急性炎症和胃肠道疾病，长期少量摄入导致多种癌症发生。WHO将EC划为2A类致癌物质。欧美酒精饮料中EC标准为150

g/L，我国黄酒EC标准为400

g/L。2012年我国发酵食品中的EC含量普遍超过欧美国家的限量要求，成为产品出口的主要障碍，解决EC问题迫在眉睫。2012年，香港消费者委员会发布黄酒、绍兴酒等34款酒精饮品的测试结果，氨基甲酸乙酯(EC)含量200-260

g/l。氨基甲酸乙酯(EC)问题解决食品安全问题——发酵食品主要危害物氨基甲酸乙酯(EC)的控制检索各主要的化学反应数据库，根据已知的在化学上有可能进行的EC合成反应：氨甲酰磷酸氰化物瓜氨酸氨焦碳酸二乙酯氨基甲酸乙酯(EC)尿素乙醇乙醇乙醇乙醇EC生成反应：尿素/瓜氨酸+乙醇EC黄酒中氨基甲酸乙酯前体的系统筛查解决食品安全问题——发酵食品主要危害物氨基甲酸乙酯(EC)的控制110100100010000100000020406080100适应性进化传代次数尿素利用效率(%)XZ-11XZ-11-R2XZ-11-R3XZ-11-R1EC前体低积累菌株高通量筛选1高通量筛选2高通量筛选3高通量筛选4采用定向进化获得低产尿素/瓜氨酸黄酒酵母100吨发酵罐30次工业化生产体系试验可以确保正常贮存条件下，黄酒20年后EC含量不高于200μg/L，40年后EC含量不高于300

μg/L■XZ-11□XZ-11-JU15■XZ-11□XZ-11-JU15解决食品安全问题——发酵食品主要危害物氨基甲酸乙酯(EC)的控制合成生物学育种从基因片段、DNA分子、基因调控网络与信号传导路径到细胞的人工设计与合成以工程化设计的理念,对生物体进行有目标的设计、改造乃至重新合成合成生物学育种3.合成途径调控2.合成基因克隆1.关键合成基因鉴定4.前体供给增强黄酮5.发酵过程优化6.产品分离提取从植物合成到微生物制造基于合成生物学的功能营养品生物制造技术合成途径调控合成基因克隆关键合成基因鉴定发酵过程优化例2天然产物的生物制造前体供给强化产品分离提取产品母乳寡糖2′-岩藻糖基乳糖(2’FL)乳酰-N-新四糖(LNnT)乳酰-N-四糖(LNT）……01母乳蛋白乳铁蛋白α-乳白蛋白……02维生素维生素D2维生素D3维生素K2……05脂类乳源神经节苷脂（gsMO）磷脂酰丝氨酸（PS）………...04脂肪和功能糖结构脂肪(OPO)唾液酸…………03例1婴幼儿配方奶粉中重要配料的生物制造新资源食品烟酰胺透明质酸香精香料香兰素迷迭香酸营养强化剂2′-岩藻糖基乳糖乳铁蛋白OPO结构脂血红蛋白色素藻蓝素血红素胭脂红酸β-胡萝卜素花青素维生素烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)维生素C烟酰胺核糖单核苷酸(NMN)烟酰胺核糖(NR)维生素B12烟酸维生素E甜菊糖苷甜味剂罗汉果甜苷甜茶苷功能食品原料麦角硫因角鲨烯积雪草苷神经酸四氢嘧啶槲皮素酪氨酸熊果酸齐墩果酸番茄红素合成生物学白藜芦醇代表性产品（实验室、中试、工业化）第四节发酵工程的未来在线检测智能监测过程微型化过程可视化过程连续化发酵（反应）过程及装备高性能菌株菌种高通量筛选高效分离技术及装备高通量筛选技术及装备高效分离技术装备三废无害化处理三废资源化利用筛选过程智能化装备数据采集数据分析深度学习智能化控制发酵智能化技术与装备体系发酵工程的未来发酵智能化工业新模式利用人工智能知识库，构建生物过程知识图谱，结合机器识别、深度学习等智能化技术，实现基于人工智能的发酵工业智能化。智能装备与技术发酵工程的未来发酵工程未来的科技问题与创新任务发酵微生物更加智慧发酵生产过程更加智能1

关键代谢节点和途径的精准调控2

细胞生长和产物积累的时序调控3

环境自适应的代谢网络动态调控1

发酵全过程网络化实时在线监测2

工业发酵过程实时在线动态控制3

基于发酵大数据的系统优化控制第二章发酵过程的生物学基础

本章内容常用高产菌种的构建方法案例1-氨基葡萄糖高产菌种的构建案例2-高通量筛选方法在发酵工业中的应用常用高产菌种的构建方法微生物与发酵发酵工程是以微生物的生命活动为中心微生物的生物学性状和发酵条件决定其产物的生成工业上用的全部微生物统称为工业微生物常见的工业微生物包括：细菌、放线菌、酵母和霉菌等随着技术的发展，病毒、藻类等其它微生物也逐步成为工业微生物发酵工程技术系统种子培养系统原料加工系统发酵系统产品分离提取系统发酵工程的关键科学技术问题关键技术问题1、微生物能够积累最大目的产物的(高产量)条件是什么？2、原料最多被微生物转化为产物(高转化率)的条件是什么？3、微生物最快速度发酵生产目的产物(高生产强度)的条件是什么？工程意义高产量

提高设备利用率、减少提取费用高转化率

降低原料成本、减少环境污染高生产强度

降低设备投资、减少能源消耗学术思想：三者相对统一实现高水平工业发酵关键技术问题的解决途径和方案问题原因根本方案细胞工厂构建和改进发酵过程优化和控制细胞合成能力不足生理特性理解代谢能力调控发酵过程条件不佳最佳条件解析合成过程控制产品转化效率差目的产物产量低生产过程强度小细胞工厂构建与改进：传统技术5系统生物学代谢调控育种2传统诱变育种1基因工程34代谢工程细胞工厂构建与改进：新一代技术4、微生物基因组人工全合成2、代谢途径精细调控与动态调控3、基因组高效编辑技术1、高通量和超高通量筛选技术传统诱变育种人工诱变手段基因突变，改变遗传结构和功能诱发产量高、性状优良的突变株最佳培养基和培养条件合成有效产物代谢调控育种通过定向选育某种特定的突变株，以达到大量积累有益产物的目的，即所谓代谢调控育种。代谢调控育种基因工程育种实现了蛋白的异源表达，可以发酵生产人、动物和植物来源的蛋白及工业酶代谢工程育种代谢工程育种：利用基因重组技术有目的的对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径生产特定目的产物。丙烯酸生产菌的构建C3烯酰CoAC3羟酸C3烯酸碳水化合物原料C2酸C2醇C2CoAC3酮酸C2醛C2~PC3酮酸~PC3酸~PC4CoAC3酮C4醇C6糖~PC3醛~PC6糖~PC6糖~P

酸~PC3二醇C3羟酮~PC4酸C5酮酸C4CoAC6酸

C3烯酰CoAC3羟酸C3烯酸丙烯酸实现代谢途径重构丙酮丁醇

代谢工程育种——正向代谢工程基本思想：根据已有的遗传和生化知识，找出限速步骤，进行遗传操作代谢工程育种——反向代谢工程基于比较基因组学的方法找出突变株与野生型不同、且可能影响赖氨酸生产的突变基因，将这些突变导入野生型，赖氨酸生产率3gL-1h-1代谢工程育种——进化代谢工程基本思想：对微生物细胞进行诱变，选取若干正向突变株后，进行全基因组水平的基因改组，逐步提升生产菌株的发酵性能。进化代谢工程改良泰乐菌素菌种代谢工程育种——综合设计策略3-磷酸甘油醛丙酮酸葡萄糖TCA循环磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油甘油酵母的甘油途径大肠杆菌自身的代谢途径1,3-丙二醇3-羟基丙醛肺炎杆菌的1,3-丙二醇途径修饰了>70个基因，最后工程菌中有18个基因被敲除或过量表达

1,3-丙二醇产量135g/L，生产率3.5g/L/h系统生物学育种基本思想：基于组学技术找出可能的改造靶点，采用代谢工程策略进行菌种改造。系统生物学育种——丁二酸产生菌的构建Msucciniciproducens基因组测序代谢途径构建代谢调控机制解析改造靶点确定敲除ldhA,pflB,磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA。丁二酸的产率、转化率和生产强度均有显著提高合成生物学育种从基因片段、DNA分子、基因调控网络与信号传导路径到细胞的人工设计与合成，以工程化设计的理念,对生物体进行有目标的设计、改造乃至重新合成合成生物学育种3.合成途径调控2.合成基因克隆1.关键合成基因鉴定4.前体供给增强黄酮5.发酵过程优化6.产品分离提取柚皮素0.4mg/L白藜芦醇0.1g/L水飞蓟宾1.5g/L从植物合成到微生物制造合成生物学育种——青蒿酸产生菌的构建直接成本：100元/公斤；环境成本：0.5吨废水，几乎无废渣和有机溶剂污染。工程菌构建发酵优化案例1氨基葡萄糖高产菌种的构建提纲1.研究背景2.代谢工程改造枯草芽孢杆菌合成氨基葡萄糖1.研究背景功能性营养化学品(FunctionalNutrientChemicals)药品食品功能性营养化学品感官功能营养功能调节人体生理功能预防功能治疗功能定义：具有调节人体生理功能，适宜特定人群食用，不以治疗疾病为目的的一类食品。营养功能感官功能形态：(1)药品形式，如片剂、胶囊等，并不作为饮食的一部分；(2)在外观上与传统食品相似或一样，作为日常饮食的一部分现有来源：天然提取天然植物提取：由于含量低而导致的高成本由于植物收获导致的季节性不可控制的农药和重金属残留污染天然动物提取：由于含量低而导致的高成本未知的过敏源激素、兽药残留人畜同患病毒宗教问题氨基葡萄糖(Glucosamine)的生理功能1878年由Ledderhose发现的第一个被确认其结构的氨基单糖，广泛存在于微生物、动物来源的多糖中，是食品中的天然组分。形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然成份。随着年龄增长，人体氨基葡萄糖缺乏越来越严重，关节软骨不断退化和磨损。大量医学研究表明：摄入氨基葡萄糖可以帮助修复和维护软骨，并能刺激软骨细胞的生长。膳食补充剂药物化妆品运动饮料2016年全球市场需求量达到5万吨！2017-2013年预计年增幅14%GlcN结构生产方法甲壳素酸法水解甲壳素酶法水解微生物发酵法甲壳素酸法水解消耗大量的酸碱，腐蚀设备环境污染较严重重金属污染纯化工艺复杂，产品有鱼腥味过敏效应甲壳素酶法水解转化时间长，生产强度低一般需要2种酶同时参与几丁质酶壳聚糖酶发酵法生产氨基葡萄糖发酵时间相对较短，生产强度较高生产资源不受限制，产品无腥味对环境污染小产品不存在过敏效应问题系统改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖食品安全级菌株发酵技术成熟，培养基成本廉价遗传背景清晰代谢改造技术成熟不易受噬菌体污染，适于工业化生产枯草芽孢杆菌作为生产菌株的优势2.代谢工程改造枯草芽孢杆菌合成氨基葡萄糖氨基葡萄糖生产菌种构建——改造策略过量表达GlmS及GNA1，加强氨糖合成途径无抗性敲除nagP、nagA、nagB及gamA基因，完全阻断氨糖降解途径改造GlmS及GNA1，扩增氨糖途径代谢流阻断副产物乙酸及乳酸生成，解除副产物对氨糖合成的抑制表达PFK

sRNA及GlmM

sRNA，削弱分支代谢途径氨糖代谢途径改造——glmS和GNA1基因的克隆表达氨基葡萄糖代谢途径过量表达GlmS和GNA1实现了氨糖在枯草芽孢杆菌中积累，但存在胞外和胞内降解现象。氨基葡萄糖生产菌种构建——改造策略过量表达GlmS及GNA1，加强氨糖合成途径无抗性敲除nagP，阻断氨糖回到胞内分子改造GlmS及GNA1，扩增氨糖途径代谢流阻断副产物乙酸及乳酸生成，解除副产物对氨糖合成的抑制表达PFK

sRNA及GlmM

sRNA，削弱分支代谢途径氨糖代谢途径改造——nagP基因敲除nagP基因敲除流程图敲除nagP基因阻断了GlcNAc由胞外向胞内转运，促进产物在胞外积累，产量提高了2倍，达到620mg/L。氨基葡萄糖生产菌种构建——改造策略过量表达GlmS及GNA1，加强氨糖合成途径无抗性敲除nagA、nagB及gamA基因，完全阻断氨糖降解途径分子改造GlmS及GNA1，扩增氨糖途径代谢流阻断副产物乙酸及乳酸生成，解除副产物对氨糖合成的抑制表达PFK

sRNA及GlmM

sRNA，削弱分支代谢途径进一步阻断胞内氨糖降解途径后，摇瓶发酵GlcNAc产量达到1.0g/L氨糖代谢途径改造——nagA、nagB和gamA基因敲除菌落PCR验证nagA、nagB和gamA基因敲除成功氨基葡萄糖生产菌种构建——改造策略过量表达GlmS及GNA1，加强氨糖合成途径无抗性敲除nagP、nagA、nagB及gamA基因，完全阻断氨糖降解途径改造GlmS及GNA1，扩增氨糖途径代谢流阻断副产物乙酸及乳酸生成，解除副产物对氨糖合成的抑制表达PFK

sRNA及GlmM

sRNA，削弱分支代谢途径氨基葡萄糖合成酶GlmS结构模型突变体催化效率提高3倍，GlcNAc产量提高至1.4

g/L。GlcNAc合成关键酶定向进化、表达调控与空间组装氨基葡萄糖N-乙酰化酶GNA1结构模型GNA1突变体氢键变化情况GNA1突变体活性位点盐桥变化情况GlcNAc发酵过程(GlmS*GNA1*)1.8g/LGlcNAc合成关键酶定向进化、表达调控与空间组装通过构建双启动子系统优化表达GNA1和GlmS，GlcNAc产量进一步提高30%，达到2.51g/L。GlcNAc合成关键酶定向进化、表达调控与空间组装GlcNAc合成关键酶定向进化、表达调控与空间组装GlmS*GNA1*Pgi基于DNA与蛋白质特异作用的支架系统GlcNAc合成关键酶定向进化、表达调控与空间组装

针对三个关键酶Pgi、GlmS

及GNA1的基因构建基于DNA与锌指蛋白质之间的特异性相互作用的支架系统，通过在空间水平优化三个关键酶的表达比例提高GlcNAc合成效率，产量进一步提高至4.7g/L。氨基葡萄糖生产菌种构建——改造策略过量表达GlmS及GNA1，加强氨糖合成途径无抗性敲除nagP、nagA、nagB及gamA基因，完全阻断氨糖降解途径分子改造GlmS及GNA1，扩增氨糖途径代谢流阻断副产物乙酸及乳酸生成，解除副产物对氨糖合成的抑制表达PFK

sRNA及GlmM

sRNA，削弱分支代谢途径氨糖代谢网络优化——阻断副产物乳酸、乙酸生成阻断乳酸生成，氨糖产量为4.5g/L，为阻断前的1.8倍；进一步阻断乙酸合成，氨糖产量进一步提升15.6%，达到5.2g/L。64.531.5氨基葡萄糖生产菌种构建——改造策略过量表达GlmS及GNA1，加强氨糖合成途径无抗性敲除nagP、nagA、nagB及gamA基因，完全阻断氨糖降解途径分子改造GlmS及GNA1，扩增氨糖途径代谢流阻断副产物乙酸及乳酸生成，解除副产物对氨糖合成的抑制表达PFK

sRNA及GlmM

sRNA，削弱分支代谢途径表达anti-pfk

sRNA，

控制糖酵解模块活性

在中等水平（60%）表达anti-glmM

sRNA，限制肽聚糖合成糖酵解模块活性在中等水平（60%）共表达anti-pfk

sRNA以及anti-glmM

sRNA及Hfq蛋白，限制肽聚糖、糖酵解模块活性在低水平（30%）sRNA能够有效限制氨糖合成竞争模块（糖酵解及肽聚糖模块）。氨糖代谢网络优化——构建sRNA调控工具氨糖代谢网络优化——基于sRNA的模块化改造策略通过将不同活性模块进行优化组装，摇瓶发酵，GlcNAc产量达到8.30g/L，单位菌体生产能力达到2.00g/gDCW。宿主生理特性优化——阻断芽孢产生、降低维持代谢GlcNAc9.5g/L进一步敲除cydBC基因，阻断了能量利用效率较低的醌醇氧化酶呼吸链，提高能量利用率，摇瓶发酵产量进一步提高，达到9.5g/L敲除sigE基因，阻断芽孢产生，同时减低细胞维持代谢，

GlcNAc产量提高10%3L罐分批发酵及补料分批发酵GlcNAc9.41g/LGlcNAc31.65g/L分批补料发酵，氨糖产量达到31.65g/L，氨糖比生产速率以及生产强度分别为

0.054g/gDCW/h和0.63g/L/h。

敲除发酵液中重要副产物——乙偶姻原72h发酵液检测阻断乙偶姻之后72h发酵液检测乙偶姻标样乙偶姻合成已被完全阻断

B6GECGB6△alsSD1B6△alsSD2总耗糖(g/L)313260240GlcNAc产量(g/L)31.1641.7741.41GlcN产量(g/L)016.1217.02折算后GlcNAc产量(g/L)31.1661.1161.83细胞干重(g/L)23.3827.6527.33GlcNAc生产强度(g/Lh)0.4330.8470.858葡萄糖转化率（%）9.9523.5025.76敲除发酵液中重要副产物——乙偶姻玉米浆50酵母粉20(g/L)玉米浆干粉20酵母粉20(g/L)玉米浆干粉15酵母粉20(g/L)玉米浆干粉20

酵母粉15(g/L)总糖耗(g/L)260249286190GlcNAc产量(g/L)41.7741.7633.6434.33GlcN产量(g/L)16.1235.5039.2940.25折算后GlcNAc产量(g/L)61.1184.3680.7882.63细胞干重(g/L)27.6532.9138.3624.78GlcNAc生产强度(g/Lh)1.511.270.881.38葡萄糖转化率（%）23.5033.8828.2443.49发酵优化——氮源优化小结过量表达GlmS及GNA1，加强氨糖合成途径无抗性敲除nagP、nagA、nagB及gamA基因，完全阻断氨糖降解途径改造GlmS及GNA1，扩增氨糖途径代谢流阻断副产物乙酸及乳酸生成，解除副产物对氨糖合成的抑制表达PFK

sRNA及GlmM

sRNA，削弱分支代谢途径N-乙酰氨基葡萄糖的产量达到80g/L以上案例2

高通量筛选方法在发酵工业中的应用1、高通量筛选平台细胞工厂构建与改进的瓶颈——筛选高产突变株传统诱变：正突变率<1/10000基因重排：正突变率<1/1000建立高效快速的筛选方法是决定细胞工厂构建与改进的成败关键之一高通量筛选系统高通量：高效快速(1)研究目的自然界中的微生物不具备“三高”，必须进行诱变或改造诱变的显著正突变率<1/10000，如何从诱变的大量菌株中筛选到最佳？改进思路1

扩大搜寻量2

增强目标物传统筛选技术：每人每天100样品10000个方格中寻找1个目标方格2目标物不显著1

搜寻量小(2)扩大搜寻量：建立初筛平台目的：从10亿细胞中迅速选出较好的1万-10万个细胞平台：微流体操控与微滴分选主要改进3D打印微流控芯片流式细胞分选系统流式分选(1-10万/天)+-微生物细胞微流控芯片包裹细胞多孔板筛选平板培养激光束(10亿/天)(3)扩大搜寻量：建立复筛平台目的：从1万-10万细胞中选出目标细胞平台：菌株挑选+自动检测+智能筛选创新:基于机器人技术实现自动检测和智能筛选最佳菌株富集孔板液体转移显色化学反应数据采集和筛选机器人间数据反馈(4)增强目标细胞识别度：改进一系列筛选方法根据产物特性，设计高通量筛选模型，实现高产细胞的准确、快速识别。紫外、可见光、荧光、偏振光酶联反应微量热反应直接成像+软件分析例：光色差法筛选酮酸发酵菌加入反应试剂(5)应用的重点领域代谢途径清晰但调控复杂的初级代谢产物位于碳中心代谢途径关键节点的丙酮酸位于碳、氮代谢平衡调控关键节点的α-酮戊二酸代谢途径尚未清晰阐明的次级代谢产物代谢途径复杂、副产物多的抗生素代谢途径长、调控复杂的辅酶Q10等安全要求高的发酵食品和食品酶生产菌株降低酿酒酵母发酵生产黄酒过程中氨基甲酸乙酯的积累提高肉制品加工关键酶制剂谷氨酰胺转氨酶的产量遗传操作比较困难的对象(霉菌、放线菌等）2、高通量培养条件优化平台全自动培养基分装系统人工处理，每人每小时<60块平板。全自动培养基分装系统，每小时约750块平板。全自动培养基分装系统750皿/小时自动灭菌培养基制备机平板菌落向多孔板的自动转移传统手工挑取菌种：100菌落/小时采用QPix420：3000菌落/小时QPix420菌种自动挑选系统微生物多孔板培养6板摇床(6x96)，64板摇床(64x96)(现有234x96=22464个菌落/批次)。多孔板需要更高的震荡速度(>900r/min，普通摇床<350r/min)，才能获得较好的混匀和传质效果。Heidolph高速多孔板培养多孔板固液分离采用专用的多孔板离心机，可以一次处理16块多孔板，实现高达1536(96x16)个样品的快速分离。Beckman高速冷冻多孔板离心机移液系统利用多通道移液器、液体工作站，可实现多达300块多孔板(~3万样本)/天精确操作。多通道电动、半自动移液系统和全自动移液工作站3、高通量筛选在发酵工业中的应用应用实例1：高通量筛选技术选育酮酸高产菌株基于α-酮戊二酸积累导致pH变化这一原理，结合ARTP诱变和高通量筛选，经过12轮高通量筛选诱变菌株，摇瓶和工业规模产量分别提高47%和19%。采用无毒的指示剂进行平板初筛不同显色剂的显色范围与浓度关联应用实例1：高通量筛选技术选育酮酸高产菌株基于高通量筛选α-酮戊二酸的技术路线，建立了一种针对丙酮酸的96孔板快速筛选方法。经过12轮高通量筛选诱变菌株，摇瓶和工业规模产量分别提高60%和25%。应用实例2：阿维菌素高产菌株选育阿维菌素是阿维链霉菌生产的广谱抗生素，具有低毒、高效等特点，被广泛运用于农业、畜牧业和医药工业。高通量初筛方法的建立酶标仪光谱扫描得到阿维菌素吸收峰，培养基无干扰。阿维菌素效价与OD值有较好相关性。标准品与OD相关性

标准品与培养基光谱扫描高通量初筛方法的建立利用液相色谱对上述高通量筛选的“筛子”进行检验。其二者检测方法基本一致，可用于后期的高通筛选。OD与液相检测效价相关性

高通量筛选及其验证基于高通量初筛结果，选择19株初筛高效价的菌株进行复筛验证。选取4株菌株复筛，菌株G9提高最多，其效价出发菌提高了18.9%。菌株复筛图

菌株初筛图

应用实例3：金霉素高产菌株选育由金色链霉菌发酵产生四环素类抗生素，对革兰阳性菌和阴性菌均有抑制作用，是目前应用最为广泛的促生长剂。高通量初筛方法的建立金霉素为胞内产物，酶标仪光谱扫描金霉素标准品和0.2M草酸破壁处理后和发酵液，均在365nm处有吸收峰。草酸酸化发酵液光谱扫描草酸酸化标准品光谱扫描高通量初筛方法的建立草酸处理后的标准品效价与OD值有较好的正相关，因此确定初筛方法为用0.2M草酸酸化处理发酵液，取上清用酶标仪检测。标准品效价与OD值线性曲线高通量筛选本筛选过程未对出发菌株进行诱变，分离出较好的菌株。对孔板初筛较高的菌株进行第一批摇瓶复筛。有一株菌效价约12034μg/mL，比出发菌提高约8%。菌株复筛图

应用实例4：泰乐菌素高产菌株选育由弗氏链霉菌发酵产生的大环内酯类类抗生素，生物学活性和可利用度高，是畜禽专用抗生素。添加剂量小，是饲料工业中的重要抗生素类添加剂。高通量初筛方法的建立泰勒菌素在290nm处有最大光吸收，标准品与OD值呈良好线性相关。泰勒菌素在290nm处有最大光吸收这一特点标准品在290nm处有吸收峰标准品与OD线性相关泰乐菌素高产菌株高通量筛选装有培养液48孔板离心取上清用0.1MHCl稀释一定倍数，用酶标仪测定290nm可见光下的吸光值OD。选择诱变效果明显的诱变菌株进行摇瓶复筛实验。泰乐诱变菌IV-17摇瓶效价13227.3μg/mL，相比出发菌株提高了9.85%，几次传代培养后产量仍然稳定。平板培养多孔板固体-液体培养96孔板酶标仪测定摇瓶验证孢子悬液ARTP诱变传代稳定性分析下一轮诱变应用实例5：谷氨酰胺转氨酶高产菌株选育谷氨酰胺转氨酶(MTG)是一种催化蛋白质之间发生交联的酶，广泛应用在食品加工工业。目前国内和欧盟等对转基因菌株生产食品酶均未开放。MTG目前主要由链霉菌生产，根据链霉菌的生产特性，建立了针对MTG的高通量筛选流程。平板培养24孔板斜面培养24孔板液体培养96孔板酶活测定摇瓶验证孢子悬液ARTP诱变传代稳定性分析下一轮诱变应用实例5：谷氨酰胺转氨酶高产菌株选育在首轮诱变菌株中，有22株诱变菌的谷氨酰胺转胺酶活性提高2倍以上。最终工业规模水平提升3.2倍。高产突变株传6代后，仍达到第1代菌株85-97%产酶水平，遗传性能稳定。编号G1G2G3G4G5G6G7G8G9G10G11G12G13G14G15菌落数473534642633354143酶活13.810.21.911.53.812.40.100.28.500.405.14.2酶活23.09.30.813.14.411.300.90.37.40004.34.0

酶活32.211.20.49.52.810.10009.00004.03.8突变株复筛选结果注：酶活单位为U/mL。高产菌株筛选应用实例6：适应性进化减少酿酒酵母尿素积累黄酒发酵过程中尿素的积累导致潜在食品安全危害物氨基甲酸乙酯(EC)产生。根据目前的法律法规及消费者的接受度，无法采用基因工程改造减少其尿素积累。建立了一种基于尿素刺激松弛氮代谢阻遏的适应性进化机制，结合高通量筛选策略，得到一株低产尿素积累菌株。获得尿素含量显著降低菌株传代次数(次)尿素浓度(mg/L)获得尿素含量显著降低菌株高通量筛选应用实例6：适应性进化减少酿酒酵母尿素积累适应性进化菌株在工业试验(100吨罐)中，黄酒中尿素含量较N85菌株(黄酒酿造核心菌株)降低60%以上。试管(1天)摇瓶(1天)斜面酒母罐发酵(2天)浸米(4天)熟曲生曲10吨罐前酵(4天)蒸米100吨罐后酵(15天)压榨调香沉淀煎酒灌装应用实例7：白酒酒醅发酵过程EC形成途径解析运用高通量筛选策略，对白酒酒醅发酵过程与EC前体瓜氨酸积累的相关的微生物及形成途径进行了阐明。筛选获得4类菌积累瓜氨酸的能力较强的菌株：芽孢杆菌

、乳球菌、足球菌和葡萄球菌。采用指示剂进行高精氨酸利用能力菌株的筛选菌株生成瓜氨酸能力应用实例7：白酒酒醅发酵过程EC形成途径解析通过测定ADI途径关键氨基酸含量，评估菌株生成瓜氨酸能力，菌株均具有完整的ADI途径关键成员。模拟窖内、固态发酵分析，乳酸足球菌在发酵中后期积累瓜氨酸能力最高，芽孢杆菌在前期、中后期有较大贡献。菌株模拟酒醅发酵过程酒醅固态发酵14天酒醅固态发酵56天应用实例8：维生素C一菌一步发酵菌株高通量筛选2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)是维生素C的直接前体。为了获得一菌一步菌株，需要建立2-KLG高产菌株筛选方法。2-KLG还原酶可以特异性降解2-KLG，并消耗NAD(P)H。可以通过对辅酶的变化检测2-KLG。2-KLG高通量筛选方法的原理酶底物专一性验证最佳还原酶选择应用实例8：维生素C一菌一步发酵菌株高通量筛选建立的2-KLG高通量筛选方法，具有高效率(HPLC法的200倍)和高精度(发酵液浓度精确到0.01g/L)。从土壤中筛得一株可以利用山梨醇特异性积累2-KLG的菌株WSH-004，通过高通量筛选产量提高至8.7g/L。经过全基因组测序发现该菌的山梨糖脱氢酶(SDH)和山梨酮脱氢酶(SNDH)具有高度的特异性。2-KLG高产菌株高通量筛选的流程2-KLG检测线性范围细菌枯草芽孢杆菌乙酰氨糖兽疫链球菌透明质酸大肠杆菌柚皮素天冬酰胺酶枯草芽孢杆菌氧化葡萄糖酸杆菌维生素C霉菌衣康酸土曲霉米曲霉苹果酸黑曲霉柠檬酸青霉菌聚乙烯醇降解酶犁头霉氢化可的松链霉菌泰勒菌素弗式链霉菌阿维菌素阿维链霉菌金霉素金色链霉菌聚乙烯醇降解酶委内瑞拉链霉菌吸水链霉菌MTG酵母光滑球拟酵母丙酮酸酿酒酵母柚皮素解脂亚洛酵母α-酮戊二酸谷氨酰胺转氨酶解脂亚洛酵母胰蛋白酶毕赤酵母成果：获得高性能工业微生物菌株价值：发酵微生物筛选效率的革命性提升高通量筛选结果验证：发酵多孔板筛选结果与最终发酵结果整体呈较好的正相关。最终菌种的表现，仍然需要在更大的反应体系中进行验证。高通量筛选菌株的再优化与工业规模实施高通量筛选体系的摇瓶和实验室规模发酵罐验证第三章培养基及其制备本章内容第一节原料第二节原料的预处理第三节淀粉的水解糖的制备第四节糖蜜原料的处理第五节非粮食生物质的转化第六节前体物质、促进剂144第一节

原料原料的定义：从工艺角度来看，凡是能被生物细胞利用并转化成所需的代谢产物或菌体的物料，都可作为发酵工业生产的原料。146一、原料的定义及选择原则

原料选择的原则原料价格低廉；因地制宜，就地取材；原料资源要丰富，容易收集；原料要容易贮藏；对人体无害，影响发酵过程的杂质含量因应当极少，或者几乎不含；适合微生物的需要和吸收利用。对生产中除发酵以外的其他方面，如通气、搅拌、精制、废弃物的处理等所带来的困难最少。147一、原料的定义及选择原则

在确定原料选择原则时需注意的问题所选用的培养基与所使用的发酵罐的结构有关。例如ICI公司因指定用甲醇和氨生产单细胞蛋白质而另行设计新的发酵罐。同样的理由，在一个已设定的发酵罐中，发酵必然会受到培养基组份改变的影响。从实验室规模放大到实验工厂规模，以至于放大到工业生产规模，都要考虑培养基的组份的变化。培养基的组成，除了考虑到菌体生长和产物的形成的需要外，还要考虑到培养基的pH变化、泡沫的形成、氧化还原电位和微生物的形态等，而且还有前体和代谢抑制剂的需要。148一、原料的定义及选择原则

二、常用主要原料及其化学组成常用原料种类薯类：甘薯、马铃薯、木薯、山药等。粮谷类：高粱、玉米、大米、谷子、大麦、小麦、燕麦、黍和稷等。野生植物：橡子仁、葛根、土茯苓、蕨根、石蒜、金刚头、香符子等。农产品加工副产物：米粞、米糠饼、麸皮、高粱糠、淀粉渣等。非粮食生物质原料：纤维素、木质素、半纤维素等。149常用原料的化学组成碳水化学物：主要是单糖和双糖，发酵微生物的碳源和能源。一些多糖则需转化为单糖或双糖后才被利用。蛋白质：蛋白质经蛋白酶分解后产生的多肽或氨基酸，是糖化菌和酵母菌生长繁殖的氮源。脂肪：针对不同的发酵产品其作用有较大差别灰分：主要是P、Mg、K、S、Ca等元素，是微生物生长和代谢所必需的。150二、常用主要原料及其化学组成三、工业发酵培养基的设计为何要进行培养基的设计？完善的培养基设计是实验室的试验、实验工厂和生产规模的放大中的一个重要步骤。在发酵过程中，我们的目的产品是菌体或代谢产物。而发酵培养基是否适合于菌体的生长或积累代谢产物，对最终产品的得率具有非常大的影响。151培养基设计的基本原则培养基的组成必需满足细胞的生长和代谢产物所需的元素，并能提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量。152三、工业发酵培养基的设计如何进行培养基的设计（1）作出细胞生长和产物形成的化学计算的平衡碳源和能源+氮源+其他需要→细胞+产物+CO2+H2O+热量通过计算可以获得生产一定数量的细胞时所需的营养物的最低数量。在了解一定数量的生物体所能产生的产物数量后，就有可能计算出形成产物时所需的底物数量。这些培养基的组份的数量仅仅是供给细胞形成产物，而不包括生成细胞所需的营养。所有上述各项数量，是不易获得其精确的数字。153三、工业发酵培养基的设计（2）组成微生物的元素包括C、H、O、N、S、P、Mg和K（见下表），这些元素都要在方程式中予以平衡在培养基中有些元素的含量往往超过需要量，如P和K。而其它元素含量则接近最低值(如Zn，Cu等)。在许多培养基中增加磷酸盐浓度，其用意是增加培养基的缓冲容量，这一点，在设计培养基时要引起注意。154三、工业发酵培养基的设计细菌、酵母和真菌的元素组成(按干重％计)155三、工业发酵培养基的设计（3）有些微生物无力的合成特定营养物，如氨基酸、维生素或核苷酸。一旦测出其中一种是生长因子，就要在培养基中加入适量的纯净的化合物或含有该物质的混合物。156三、工业发酵培养基的设计（4）碳源具有生物合成的底物和能源的双重作用，在需氧条件下，对碳源的需要量可以从菌体对底物的产率系数(Yx/s)推算而得。该系数的定义是：细胞干物质的产量／碳源底物的被利用量157三、工业发酵培养基的设计158下表中列出了一些Yx/s值。如以葡萄糖为底物时，其Y值为0.5g即表示每1g葡萄糖能生成0.5g细胞干物质。为要获得30gdm-3浓度的细胞，需要葡萄糖30／0.5＝60gdm-3。在发酵过程中，适当地补充碳源是必要的。将碳源转化成产物的观察值与理论上最大值之间进行比较，才能进行深入的研究。但由于对生物合成的知识的限制而难以作出精密的分析。三、工业发酵培养基的设计159方程式中的a2、b2、c2、d2、e2、n2、p2和q2都是化学计算中的系数，PAA代表苯乙酸。解方程式得：按上述方程式计算每1g葡萄糖能产生1.1g苄青霉素的理论值。在青霉素分批发酵的一个简单模型中，用于合成细胞、维持生命活力和转化成青霉素的葡萄糖，分别占总糖耗量的28、61和11％。在分批补料发酵时，则26％的葡萄糖用于生长、70％用于维持生命、6％用于合成青霉素。每克葡萄糖的最大青霉素转化产量为0.0538，这个理论值数倍于实验值。Cooney(1979)以青霉素生物合成的途径为基础，通过物质和能量平衡，计算出青霉素生物合成的理论值。总的化学计算式为三、工业发酵培养基的设计水碳源氮源无机盐维生素缓冲剂前体和代谢调节剂消沫剂160四、发酵培养基的组成成分影响选择碳源的因素原料成本占生产总成本的比例；在某些发酵过程中，必须除去碳源中的杂质；对碳源的选择，往往还受到政府政策的影响；当地的法律条例指定了许多饮料业所使用的底物；培养基的配制方法，特别是灭菌方法。161四、发酵培养基的组成成分缓冲剂控制pH时对获得最佳生产能力是十分重要的。在培养基中加入一种化合物作为缓冲剂或同时可作为营养源。许多种培养基多加入碳酸钙作为缓冲剂，以达到pH7.0左右。如果pH下降，则碳酸钙分解，如果是pH上升，可以自然地校正微生物的产酸量。在许多培养基中，也用磷酸盐作为重要的缓冲剂。碳源和氮源的平衡，也是控制pH的一种方式。在玉米浆中的蛋白质、肽、氨基酸等也具有缓冲容量。滴加氨，氢氧化钠和硫酸，可以严格地控制pH值。162四、发酵培养基的组成成分第二节

原料的预处理发酵工厂在进行生产前，必须先将原料中混杂的小铁钉、杂草、泥快和石头等杂质除去，保证后续工序生产的正常和顺利进行。为保证后续工序生产的正常和顺利进行，还需对原料进行适当加工。为保证生产环境的清洁，必须采用适当的输送方式将原料从仓库运送至配料罐或反应器。164一、预处理的必要性

二、预处理的方法（方式）原料除杂筛选风选磁力除铁165原料的粉碎（1）粉碎的目的：增加原料受热面积粉末状原料加水混合后容易流动输送166二、预处理的方法（方式）对于一些带壳的原料，如高粱、大麦，在粉碎前，则要求先把皮壳破碎皮壳本身毫无营养价值，在发酵过程中对微生物没有好处，皮壳在醪液中会引起阻碍液体的流动。皮壳在生产过程中，不发生变化，而大量皮壳汇集起来会占据一定的有效容积，无形中降低了设备的生产能力。原料糖化后进行发酵时，皮壳会聚集在液面上，而引起较厚的醪盖，醪盖的形成会妨碍热量的逸散和CO2的放出，致使液体温度升高，细菌容易繁殖，特别是醋酸菌，出现这些现象，都会对发酵带来不利。皮壳会使蒸馏塔及冷却器等设备发生阻塞。皮壳渐多，需要停机清理，会给生产带来损失。167二、预处理的方法（方式）（3）粉碎方法干粉碎湿粉碎168二、预处理的方法（方式）干式粉碎粗碎：原料过磅称重后，进入输送带，电磁除铁后进行粗碎。粗碎后的物料应能通过6~10mm的筛孔，然后再送去进行细粉碎。粗砰常用的设备是轴向滚筒式粗碎机，也有用锤式粉碎机进行粗碎的例子。细碎：经过粗碎的原料进入细碎机，细碎后的原料颗粒一般应通过1.2~1.5mm的筛孔。也有采用1.8~2.0mm筛孔的。常用的细碎设备是锤式粉碎机。169二、预处理的方法（方式）170湿法粉碎工艺的优点彻底消除了粉尘的危害，改善了劳动条件，降低了原料的损耗提高了原料的粉碎细度节省了蒸煮时所消耗的蒸汽粉碎机部件（特别是刀片）的磨损减少设备简单，对厂房要求不高二、预处理的方法（方式）第三节

淀粉的水解糖的制备一、淀粉的水解的理论基础淀粉的颗粒的外观淀粉颗粒呈白色，不溶于冷水和有机溶剂，其内部呈复杂的结晶组织。随原料品种和种类的不同，淀粉颗粒具有不同的形状和大小。形状不规则，大致上可分为圆形、椭圆形和多角形。一般说来，水份含量高，蛋白少的植物，颗粒较大，形状较整齐，大多为圆形或卵形，如马铃薯、甘薯的淀粉。颗粒较大的薯类淀粉较易糊化，颗粒较小的谷物淀粉相对较难糊化。淀粉颗粒的构成如下图：

淀粉分子链→针状晶体→淀粉颗粒172聚集氢键淀粉的分子结构淀粉可分为直链和支链淀粉两类。直链淀粉通过α-1，4键连接。支链淀粉的直链部分通过α-1，4键连接，分支点则有α-1，6键连接，支链平均有25个葡萄糖基团，因而还原性末端数量较少。一般植物中直链淀粉含量为20～25%，支链淀粉占75～80%。直链淀粉在70～80℃的水中可溶，溶液的粘度较小，遇I2呈纯蓝色；支链淀粉在高温水中可溶，溶液的粘度大，遇I2呈兰紫色。173一、淀粉的水解的理论基础淀粉在水-热处理过程的中变化（1）水-热处理的概念将淀粉质原料与水一起，在高温高压或低温低压的条件下进行处理的过程。（2）水-热处理的目的淀粉原料经过水热处理，使淀粉从细胞中游离出来，并转化为溶解状态，以便淀粉酶系统进行糖化作用，这就是原料水-热处理的主要目的。174一、淀粉的水解的理论基础（3）淀粉的膨胀和溶解膨胀：淀粉是一种亲水胶体，遇水加热后，水分子渗入淀粉颗粒的内部，使淀粉分子的体积和重量增加，这种现象称为膨胀。糊化：在温水中，当淀粉颗粒无限膨胀形成均一的粘稠液体的现象，称为淀粉的糊化。此时的温度称为糊化温度。一、淀粉的水解的理论基础溶解或液化淀粉糊化后，如果提高温度至130℃，由于支链淀粉的全部（几乎）溶解，网状结构彻底破坏，淀粉溶液的粘度迅速下降，变为流动性较好的醪液，这种现象称为淀粉的溶解或液化。一、淀粉的水解的理论基础（4）淀粉质原料的各个组分在水-热处理过程中的变化淀粉的变化自糖化：在50～60℃预煮时，原料自身的淀粉酶系统活化，并分解淀粉生成糖和糊精酸水解：在微酸条件（pH5.6～6.3），淀粉的局部酸水解现象在70℃以下，水解的产物是糖，75～80℃产物是糊精。177一、淀粉的水解的理论基础糖的变化己糖的变化（葡萄糖和果糖）：果糖在酸性介质中不稳定，由于容易开链，所以较易分解。部分的5-羟甲基糠醛缩合生成黄棕色色素。葡萄糖在pH2～4内稳定性最佳。一、淀粉的水解的理论基础戊糖的变化：蒸煮过程中戊糖和己糖一样脱水生产糠醛，但是后者比羟甲基糠醛稳定。179一、淀粉的水解的理论基础焦糖化：当温度达到糖的熔点时（185℃），糖分脱水形成黑色无定形物，统称焦糖。焦糖不仅不能被发酵利用，而且还会阻碍糖化酶对淀粉的糖化作用，影响微生物的生长。焦糖化反应在高浓度醪液中比低浓度中较易进行。在不易与溶液接触的地方（如蒸煮锅的死角），或锅壁局部过热处都容易发生。180一、淀粉的水解的理论基础氨基糖反应：还原糖与氨基酸之间产生的呈色反应称为氨基糖反应。氨基糖反应不是一个简单的聚合反应，而是一个过程相当复杂的反应。

NH2己糖糖醛↓聚合糖→羟甲基糖醛─→──→氨基糖其他醛酮类缩合中间产物181一、淀粉的水解的理论基础二、淀粉的液化（糊化）淀粉液化的方法水解动力的不同酸法、酶法、酸酶法、机械液化法工艺的不同间歇式、半连续式、连续式设备的不同管式、罐式、喷射式加酶方式的不同一次加酶、两次加酶、三次加酶原料的精粗不同淀粉质原料直接液化、精制淀粉液化182酶法液化（1）酶解法液化、糖化淀粉常用的酶α-淀粉酶：其作用是将淀粉迅速水解为糊精及少量麦芽糖，对淀粉的作用，可将长链从内部分裂成若干短链的糊精，所以也称内切淀粉酶。淀粉受到α-淀粉酶的作用后，遇碘呈色很快反应，如下表现：蓝→紫→红→浅红→不显色(即碘原色)。糖化酶：作用于淀粉的l，4键结合，能从葡萄糖键的非还原性末端起将葡萄糖单位一个一个的切断，因为是从链的一端逐渐地一个个地切断为葡萄糖，所以称为外切淀粉酶。183二、淀粉的液化（糊化）β-淀粉酶：

β-淀粉酶能水解α-1，4糖苷键，不能水解α-1，6糖苷键，遇此键水解停止，也不能越过继续水解。水解由淀粉分子的非还原末端开始，水解相隔的α-1，4键麦芽糖，届于β-构型。故叫β-淀粉酶，β-淀粉酶届于外切酶，水解产物只有麦芽糖。异淀粉酶：异淀粉酶能水解支链淀粉和糖原分子中支叉地位的α-1，6糖苷键，使支叉结构断裂。但对于直链结构中的α-1，6糖苷键却不能水解。184二、淀粉的液化（糊化）普鲁蓝酶

能水解支叉结构和直链结构的α-1，6糖苷键、支链淀粉、糖原和其β-极限糊精及普鲁蓝分子中的β-1，6键。异淀粉酶或普鲁蓝酶与β-淀粉酶合并水解，能使支叉开裂，使β-淀粉酶继续水解，大大提高麦芽糖的产率。185二、淀粉的液化（糊化）（2）酶法液化方法间歇（升温）液化法半连续（高温、喷淋）液化法连续（喷射）液化法186二、淀粉的液化（糊化）升温液化法工艺：将浓度30~40%淀粉乳调整pH到6.5，加入CaCl2(0.01mol/L)和一定量淀粉酶(5~8u/克淀粉)，剧烈搅拌，加热到85~90℃，保持30~60分钟，达到液化程度(DE15~18)，升温到100℃，灭酶10分钟。此方法简便，但效果较差，能耗大，原料利用率低，过滤性能差。187二、淀粉的液化（糊化）高温液化法（喷淋连续进出料液化法）工艺：将淀粉乳调整到适当pH和Ca2+浓度，加入一定量的液化酶，用泵打给喷淋头引入液化罐中（其中已有90℃热水），淀粉糊化后，立即液化，至保温罐90℃保温40分钟，达到液化的程度。优点：设备和操作简单，效果比间歇液化好。缺点：不安全，蒸汽耗量大，温度无法达到最佳温度，液化效果差，糖液过滤性能也差。188二、淀粉的液化（糊化）连续（喷射）液化法利用喷射器将蒸汽直接喷射至淀粉薄层，以在短时间内达到要求的温度，完成糊化和液化。喷射后，进入保温罐，85℃~90℃保温45分钟。优点：设备小，便于连续操作，原料利用率高，转化率高，蛋白质凝聚好。但要求一定压力的蒸汽，进出料的速度要稳定。189二、淀粉的液化（糊化）喷射液化的几种流程：一段高温喷射液化单罐维持连续出料多段液化：多次加酶，多次加热，适用各种原料（特别是难液化的小麦，玉米淀粉）190二、淀粉的液化（糊化）191一段高温喷射液化工艺：控制要点：淀粉乳浓度30%左右pH6.0~6.5喷射器出口温度（105±3）˚C，保温97℃~100˚C，30~60min二、淀粉的液化（糊化）192单罐维持二、淀粉的液化（糊化）193连续出料二、淀粉的液化（糊化）194多段液化工艺二、淀粉的液化（糊化）液化程度的控制I2试测定DE值DE值高，糊精太小，不利于糖化酶作用，影响催化效率，终点DE值低。DE值低，液化不彻底，糖化速度慢，酶用量大，时间长，过滤性能差。透光率和澄清度195二、淀粉的液化（糊化）液化效果的标准液化要均匀蛋白絮凝效果好液化彻底（60˚C时液化液要稳定，不出现老化现象，不含不溶性淀粉颗粒，液化液透明、清亮）196二、淀粉的液化（糊化）酶法液化方法比较直接升温法：设备简