层析技术课件

層析技術

（Chromatography）

一、概述定義——也稱色譜層析、色譜、色層；樣品中各組成依據其在固定相與流動相之間作用行為的差別進行多次分離的過程。特點——分離精度高、適用範圍廣、設備簡單、操作方便；處理量小、間歇操作等發展史——1903年一位俄國植物學家首次提出。1931年首次應用於製備；1938年適用範圍擴展至無色物質；……

石油醚CaCO3顆粒植物葉石油醚提取物石油醚CaCO3顆粒1903年俄國植物學家Tswett實驗示意圖葉綠素葉黃素胡蘿蔔素石油醚二、層析法分類分離機理吸附層析——物質吸附力差異分配層析——物質分配係數差異凝膠層析——物質分子量差異吸附層析的種類物理吸附層析離子交換層析親和層析疏水作用層析金屬螯合層析有機染料層析凝膠層析分離原理固定相的形狀柱層析紙層析薄板層析流動相的物態氣相層析液相層析流動相壓力低壓中壓高壓三、層析技術的原理和術語平衡關係——分佈係數

CsKd=———CmCs：溶質在固定相中的溶度Cm：溶質在流動相中的溶度溶質在固定相中的量K’(容量因數)=————————溶質在固定相中的量K’=βKd（β為相比）阻滯因數（Rf值）

溶質的移動速度

Am（流動相的平均截面積）Rf=—————————=—————

流動相在色譜系統中的移動速度

Am+Kd·As（固定相的平均截面積）保留值——保留時間tR、保留體積vR

柱高（L）

t0（死時間）

=————tR

=t0（1+k’）

線速度（ν）

分離度

tR2—tR1R=————

W1+W25、塔板理論——塔板數、塔板高度塔板數

tR

N=5.54{————}2

Wh/2塔板高度

LH=———N四、柱層析系統

工藝流程圖層析柱—徑高比（10：1—1：100）、材質（玻璃、有機玻璃、PVC、不銹鋼等）、耐壓（0.05－10MPa）等

泵—恒速、壓力（蠕動泵、柱塞泵等）餾分收集儀—手動、自動檢測儀通用型—示差折光、介電常數、電導等專用型—紫外、螢光、放射性檢測器等記錄儀工作站—色譜參數的選擇和設定、自動化操作、色譜數據的採集和存儲，並作即時處理、數據後處理、自動列印出一套完整的色譜分析數據……實驗室用的層析柱工業用的層析柱自動餾分收集儀（國產）自動餾分收集儀（進口）蠕動泵國產柱層析系統伯樂公司（BIO-RAD）柱層析系統發瑪西亞公司（Pharmacia）柱層析系統五、親和層析(AffinityChromatography,AC)

定義——利用生物大分子與其相應互補體間特異識別能力進行多次差別分離的過程特點——選擇性高、操作條件溫和；親和層析劑製備複雜，種類少3、常用的生物親和關係

酶——底物及其類似物、抑制劑、輔助因數抗體——抗原（蛋白、病毒、細胞）激素——受體蛋白、載體蛋白外源凝激素——糖蛋白、多糖、細胞表面受體蛋白核酸——互補堿基段、核酸聚合酶、核結合蛋白4、親和層析劑的製備載體（骨架）的選擇載體的要求載體骨架高度親水、惰性具有大量可供活化的化學基團具有較大孔徑的網狀結構良好的化學、物理、生物穩定性常用的載體多糖類（葡聚糖、瓊脂糖、纖維素等）有機聚合物（聚乙烯醇、聚丙烯醯胺等）混合類（改性矽膠、多糖+樹脂等）載體（骨架）活化劑配基2）配基的選擇專一性配基——參照生物親和關係類別性配基——酶的輔酶（NAD+、NANP+、ATP等）、外源凝激素（伴刀豆球蛋白A等）3）配基與載體的結合載體的活化溴化氰法重氮化法環氧氯丙烷法高碘酸法共價偶聯反應溴化氰法重氮化法高碘酸法環氧氯丙烷法4)親和層析劑中“手臂”“手臂”的由來“手臂”的種類親水性（肽鏈）疏水性（碳鏈）“手臂”的結合方法類似於配基的共價偶聯反應5、親和層析分離過程6、影響因素

離子強度親和力為靜電力為主：離子強度↑，↓親和力為疏水力為主：離子強度↑，↑抑制氫鍵形成的物質pH值溫度六、免疫層析定義——利用抗原—抗體特異性識別能力進行差別分離的過程。抗體（配基）的製備多克隆抗體——動物（小白兔、山羊等）整體免疫單克隆抗體——雜交瘤技術免疫層析劑製備—類似於親和層析劑的製備雜交瘤技術原理B-淋巴細胞

+→雜交瘤細胞→單克隆抗體骨髓瘤細胞操作過程B-淋巴細胞、骨髓瘤細胞融合雜交瘤細胞的規模培養單克隆抗體的分離純化4.免疫層析應用生物藥物（蛋白類藥物——酶類、多肽類）分離純化藥物製劑（靶向藥物）臨床診斷（免疫診斷試劑盒）七、疏水作用層析

(HydrophobicInteractionChromatography，HIC)定義——利用生物大分子疏水作用力進行多次差別分離的過程。疏水作用層析劑及其製備功能基團——苯基、醚基、短鏈烷基製備方法——類似親和層析劑的製備方法3、疏水作用層析的影響因素

離子強度及種類破壞水化作用的物質表面活性劑溫度4、特點

可直接分離鹽析後的蛋白質可通過調節疏水配基鏈長和密度改變吸附力疏水性吸附劑種類多，選擇餘地大。八.有機染料親和層析定義——利用某些類似於NAD+結構的有機染料（蒽醌及偶氮化合物）作為配基製成親和層析劑進行差別分離過程。特點——結合容量大；