新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座

2026/10/161分析方法设计依据分析方法建立普通步骤分析方法验证内容与要求药品分析应用示例内容提要新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第1页2026/10/162第一节

分析方法设计依据建立分析检测方法主要依据待测药品理化性质及在生物体内存在情况分析测定目标与要求生物样品类型与预处理方法试验室条件新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第2页2026/10/163一、待测药品理化性质及体内存在情况准确测定生物样品中药品或其特定代谢物

——预处理——待测物从结合物或缀合物中释放选择样品预处理方法——首先应考虑

——待测药品理化性质

——药品在生物体内存在情况

——药品在生物体内生物转化(代谢)路径新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第3页2026/10/164(一)待测药品理化性质

药品pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等——预处理及检测方法

含有亲脂性——在适当pH值下用溶剂萃取

含有强极性或亲水性——沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等

含有挥发性——GC测定法

含有光谱或电化学特征——分析检测方法

药品稳定性——萃取浓缩技术

对酸碱不稳定——防止使用强酸或强碱性溶剂

对热不稳定——防止高温蒸发溶剂新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第4页2026/10/165(二)待测药品体内存在状态与血浆蛋白结合强弱及结合率高低 ——分离萃取方法

蛋白结合较强——不宜直接采取溶剂萃取体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物 ——分析检测技术

浓度较低（尤其有代谢产物共存) ——代谢产物干扰与特定代谢产物同时测定 ——采取LC-MS等分析检测技术新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第5页2026/10/166二、分析测定目标与要求

药代动力学——研究药品在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 ——血浆浓度随时间改变过程；代谢路径及代谢产物

要求 ——同时测定原形药品和代谢产物

检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属

性(分离能力)(原形药品及其代谢产物分离)

方法 ——无须强调方法简便、快速； ——大多采取色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC.LC-MS

毒代动力学——确定新化合药品预期人用剂量水平与其毒性水平之间安全范围新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第6页2026/10/167三、生物样品类型与预处理方法

生物样品类型与预处理方法——决定分析方法应用

以血浆或血清为分析样品

蛋白沉淀

溶剂萃取 ——分析样品较为"洁净”，可用HPLC或HPLC-MS检测

新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第7页2026/10/168四、试验室条件

在设计体内药品分析方法时,还应充分考虑到试验室现有或有可能在其它试验室使用仪器装备,合理选择可行分析方法。新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第8页2026/10/169第二节分析方法

建立普通步骤一、分析方法选择二、分析方法建立 (一)

检测条件筛选 (二)分离条件筛选新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第9页2026/10/1610一、分析方法选择

体内药品分析方法设计

生物样品中药品浓度——决定分析方法首要原因

生物样品中药品或其特定代谢产物浓度低、样品量少

——难以经过增加取样量提升方法灵敏度

——经过选择适当分析方法适应样品分析需求

新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第10页2026/10/1611二、分析方法建立分析方法建立之前

查阅文件资料——充分了解药品在体内动力学过程,使所确定分析方法 ——防止受到代谢产物干扰适合用于实际生物样品测定新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第11页2026/10/1612二、分析方法建立初步确定分析方法后

进行一系列试验工作——选择最正确分析条件

同时验证分析方法可行性——确认是否适合用于实际生物样品分析方法建立和验证过程——是不可截然划分

分析方法建立步骤第一步:检测条件筛选第二步:分离条件筛选新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第12页2026/10/1613(一)检测条件筛选

标准物质

——

照确定分析方法(不包含生物基质预处理)测定

——

确定最正确分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度

HPLC——

调整检测器(类型、条件)

色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)

流动相(组分及其配比)及其流速

柱温、进样量、内标物质浓度及其加入量等

——

使各物质含有足够方法灵敏度(LOQ)

良好色谱参数(n、R、T)

适当保留时间(tR)新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第13页2026/10/1614(二)分离条件筛选

在进行分离条件筛选时，应考查生物基质中内源性物质及代谢产物对分离与检测干扰，步骤以下: 1．空白溶剂试验——溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验——endogenouscompounds(方法特异性) 3．模拟生物样品试验——方法效能指标 4．实际生物样品测试——代谢产物(方法特异性)新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第14页2026/10/16152.空白生物基质试验

空白生物基质(blankbiologicalmatrix) ——如空白血浆

考查目标 ——生物基质中内源性物质对测定干扰（方法特异性) ——在待测药品(或特定活性代谢物、内标物质等)“信号窗”（信号附近有限范围)内不应出现内源性物质信号新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第15页2026/10/16163.模拟生物样品试验

模拟生物样品(质量控制,QC样品)——空白生物基质中加入待测药品

考查目标 ——方法线性范围、精密度与准确度、灵敏度

药品萃取回收率等各项技术指标 ——同时深入检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用其它药品对测定干扰程度,即方法特异性新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第16页2026/10/16174.实际生物样品测试

空白生物基质和模拟生物样品试验——确定分析方法及其条件 ——不能完全确认是否适合于实际生物样品测定 ——药品在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)

或代谢生成数个代谢产物及其深入结合物(或缀合物)

实际生物样品——确立分析方法后,尚需进行实际生物样品测试

考查目标 ——代谢产物对药品、内标物质干扰情况 ——深入验证方法可行性新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第17页2026/10/1618第三节分析方法

验证内容与要求验证步骤：

首先为分析方法验证 ——特异性、精密度与准确度、回收率

定量限与检测限、溶液稳定性

其次为生物基质中待测药品稳定性验证 ——室温放置、冷冻（或冷藏)、冻-融循环新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第18页2026/10/1619验证效能指标与基本要求 1.特异性——防止干扰 2.标准曲线与线性范围——覆盖全部浓度范围 3.准确度——与实际情况相符 4.精密度——结果可重现 5.定量限——到达峰浓度1/10～1/20 6.稳定性——确保全部样品准确测定 7.提取回收率——确保准确度8.基质效应

新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第19页2026/10/1620一、方法特异性(专属性或选择性)

方法特异性(specificity) ——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质能力

比较——待测药品或其活性代谢产物检测信号

对照品（或标准品)

空白生物基质

模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品)

确证——内源性物质对分析方法有没有干扰新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第20页2026/10/1621二、标准曲线与线性范围

标准曲线（standardcurve)——calibrationcurveorworkingcurve

标准曲线——用模拟生物样品建立 ——线性范围(不包含零点)应能覆盖全部生物样品中药品浓度 ——不能使用外推方法求算未知生物样品中药品浓度

建立标准曲线所使用模拟生物样品 ——应使用与待测含药生物样品相同生物基质制备新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第21页2026/10/1622

标准系列溶液浓度范围

最少含5～9个浓度点(不包含零点,即空白) ——可覆盖全部待测生物样品中药品浓度

如：1、2、5.10、20、50、100(等比梯度模式—百分比常数约为2)

若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5

设定最高浓度为100，最低浓度为1(个体差异)

实际制备时：500、250、100、50、20、10……新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第22页2026/10/1623

标准系列模拟生物样品制备

空白生物基质(如血浆)——加入标准系列溶液适量,涡旋混匀

为预防在标准溶液加入及涡旋混合时造成损失 ——①先加入标准溶液③

②再加入空白生物基质

③涡旋混匀①②新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第23页2026/10/1624标准曲线程度要求

药代动力学或生物利用度研究 ——标准曲线最少包含5个浓度(通常为5～9个浓度,不包含零点) ——最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax10%～5%，并应为方法LOQ(非LOD) ——相关系数要求≥0.99(色谱法)——低浓度点准确度为真实值80%-120%，其余点为85%-115%。

新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第24页2026/10/1625三、准确度

方法准确度(accuracy) ——系指用该方法测得生物样品中待测药品浓度与其真实浓度靠近程度 ——应使用实际生物样品测定,但实际生物样品浓度是未知所以,通常使用模拟生物样品测定

新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第25页2026/10/1626四、精密度

方法精密度(precision) ——系指每次测定结果与屡次测定平均值偏离程度 ——表示该分析方法可重复性(reproducibility) ——反应分析方法可操作性,是方法验证基本关键点之一

实际生物样品量有限(如血浆,普通为0.1～2ml) ——使用模拟生物样品测定新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第26页2026/10/16271.表示方法

方法精密度普通用标准偏差(standarddeviation,SD)或相对标准偏差(relativestandarddeviation,RSD)表示 SD= RSD= = ——包含批内(within-run或intra-assay)RSD—日内(within-day)

和批间(between-run或inter-assay)RSD—日间(between-day,day-to-day)新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第27页2026/10/16282.测定法——分别测定法(Ⅰ)

照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不一样批间制备高、中、低3个浓度QC样品，并分析测定

批内RSD ——每一浓度5个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每1浓度RSD

批间RSD ——每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次;用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度3个分析批数据)RSD新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第28页2026/10/16293.程度要求

在药代动力学和生物利用度研究中

对g/ml级水平RSD普通应≤10% ng/ml级水平RSD普通应≤15%

在LOQ附近RSD应≤20%。新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第29页2026/10/1630五、定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ) ——系指在确保含有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)前提下，能测定出生物样品中药品最低浓度 ——又称为方法灵敏度(sensitivity) ——标准曲线上最低浓度点(最低浓度点≥LOQ)

要求 ——应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中药品浓度 ——准确度在80%～120%(或RE在±20%范围内) ——RSD＜20%新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第30页2026/10/1631六、稳定性与质量控制

稳定性——包含方法稳定性和样品稳定性

方法稳定性——方法耐用性

样品稳定性——生物样品存放条件和时间、冻-融循环

测定法——QC样品穿插于实际样品测定全过程 ——模拟(或实际)生物样品及其预处理后待测溶液进行考查

要求 ——准确度85%～115%(RE在±15%范围内)，RSD＜15%新药研发中药物分析方法建立与验证专家讲座第31页2026/10/1632七、提取回收率

生物样品预处理方法 ——提取回收率，≥70%

取空白生物基质(如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度QC样品(每一浓度最少5个样品)，每个样品分析测定1次

另取等量相同